"Утверждено" Министерством здравоохранения СССР
"29" июля 199] г.
N 6245-91.
Временные методические указания по определению остаточных количеств имазетапира в сое. горохе, сырье лекарственных культур, почве, воде методом тонкослойной хроматографии.
I. Краткая характеристика препарата.
Имазетапир- действующее вещество гербицида пивот, ф.Цианамид,США.
Химическое название: (RS) -5-зтил-2- (4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидозолин-2-ил) никотиновая кислота.
Молекулярная формула: C15H19N3O3
Структурная формула:
М.м. 289,34.
Химически чистый препарат пивота представляет собой порошок от белой до желтой окраски с легким кисловатым запахом. Тпл 169-173° С, Ткип 180° С. Растворимость при 25° С (г/ 100мл): в ацетоне - 4,82; диметилсульфоксиде -
42,25; метаноле - 10,5; пропаноле - 1,73; воде - 0,14. Давление паров - 1.10~7 мм.рт.ст.
Препарат малотоксичен для теплокровных. ЛД50 для кроликов и мышей при оральном введении 5000 мг/кг. При прямом контакте не оказывает раздражающего действия на кожу.
МДУ пивота в бобах сои - 0,5 мг/кг, Г1ДК пивота в почве - 0,1 мг/кг, в воде 0,7 мг/л, ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 2,0 мг/м3, в атмосферном воздухе -0,04 мг/м^.
Пивот применяется в борьбе с сорной растительностью н посевах бобовых культур.
Разработчики: Г.П.Пушкина, НПО "ВИЛАР", Киевский институт усовершенствования врачей.
2.1. Основные положения.
2.1.1. Принцип метода.
Метод определения имазстапира основан на извлечении гербицида из бобов и травы сои подкисленным водным этанолом, из травы лекарственных культур и гороха (зерно) -70% водным ацетоном,из почвы смесью ацетона и 0,05 н СаС12 , очистке экстрактов путем псреэкстракции с последующим определением вещества тонкослойной хроматографией.
2.1.2. Метрологическая характеристика метода.
I. В качестве проявляющего реагента - 0-толидин. Минимально определяемое количество имазетапира в пробе - 0,5 мкг.Нижний предел определения пивота в лекарственном сырье (трава) и горохе (зерно) - 0,08 мг/кг, в почве -0,05 мг/кг, вводе -0,01 мг/кг, % обнаружения пивота в сырье- 68-70%, в почве - 75-80%. II. В качестве проявляющего реагента - бромфеноловый синий.Минимально определяемое количество пивота в пробе 3 мкг.Нижний предел обнаружения пивота в сырье бобов сои 0,3 мг/кг, в траве - 0,30 мг/кг, в почве - 0,15 мг/кг, в Boat - 0,07 мг/кг.
2.1.3. Избирательность метода.
Метод селективен. Прочие пестициды не мешают определению.
2.2. Реактивы и растворы.
Ацетон, х.ч., ГОСТ 22300-76.
Хлороформ, х.ч., ГОСТ 22300-76, перегнанный.
Имазетапир, ан. станд., фирма Цианамид.
н-Гексан, ч.д.а., ТУ 6-09-3375-78.
Сульфат натрия, х.ч., ТУ 6-09-3675-74. безводный.
Соляная кислота, ч., ГОСТ 3118-77.
О-толидип, ТУ 6-09-2223-75.
Этиловый спирт, рек гиф. ГОСТ 5962-67.
Уксусная кислота, ч., ГОСТ 18270-72, ледяная.
Перманганат калия, ГОСТ 20490-75.
Четыреххлористый углерод.
Йодид калия, ч„ ГОСТ 4222-74.
Серная кислота.
Азотнокислое серебро, ч.д.а., ГОСТ 1277-81.
Бромфеноловый синий, ч.д.а., ТУ 6-09-113-2.
Проявляющие реагенты:!.Растворяют 0,16 г о-толидина в 30 мл ледяной уксусной кислоты, доводят до 500 мл дистиллированной водой и прибавляют 1 г иодида калия. Раствор хранят в темной склянке.Годен к употреблению в течение длительного времени.II. 0,05 г бромфенолового синего растворяют в 10 мл ацетона и доводят до 100 мл 1 % раствором нитрата серебра в водном ацетоне (ацетон:вода, 3:1).
Экстрагирующая смесь: 1 часть 1М HCI, 39 частей Н2О и 60 частей этанола.
Стандартные растворыио имазетапира в ацетоне с содержанием ЮО.мкг/мл и 10 мкг/мл.
3—2992
2.3. Приборы, аппаратура, посуда.
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М ТУ 11 97-76.
Лампа УФ света МРТУ 42-1618.
Хроматографическая камера с пришлифованной крышкой.
Мерные колбы, ГОСТ 1770-74, вместимостью 100 мл.
Делительные воронки, ГОСТ 25336-82, вместимостью 500 мл, 250 мл.
Пульверизаторы стеклянные.
Чашки Петри, ГОСТ 25336-82.
Эксикатор, ГОСТ 25336-82.
Пипетки градуированные, ГОСТ 20292-74 на 10, 1 и 0,1 мл.
Градуированные пробирки, ГОСТ 1770-74, с пробками на шлифах вместимостью 10 мл.
Колбы плоскодонные, ГОСТ 25335-82, вместимостью 500 и 250 мл.
Цилиндры мерные, ГОСТ 1770-74, вместимостью 100 и 25 мл.
Микрошприцы на 100 мкл, ГОСТ 20292.
Почвенное сито.
Хроматографические пластинки "Silufol", Чехословакия.
Хроматографические пластинки "Сорбфил", ТУ 26-11-17-89 ПКБ Пласт-маш, МБС АН России г.Краснодар.
Зерновая мельница или кофемолка.
2.4. Подготовка к определению.
2.4.1. Подготовка камеры для хлорирования.
Хлорирующий раствор готовят быстрым смешиванием четыреххлористого углерода, 3% раствора перманганата калия и 12% раствора ИС1 (1:1:1).
2.4.2. Подготовка хроматографических камер.
Хроматографическая камера заполняется смесью подвижных растворите лей:1. Н-гексан:хлороформ:уксусная кислота:этиловый спирт (20:2:2:4) (для лекарственного сырья).
И. Н-гексан:этанол:хлороформ:уксусная кислота (30:10:5:1) (для сои), для насыщения камеры парами подвижных растворителей необходимо 1-1,5 часа при температуре нс менее 20-25° С.
2.5. Отбор проб.
Отбор проб для проведения определения проводится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов внешней среды для определения микроколичеств пестицидов", утвержденными Минздравом СССР 21 августа 1979 года N 2051-79.
2.6. Подготовка проб к анализу.
Сухое сырье (трава) лекарственных культур, травы и бобов сои, зерна гороха измельчают на зерновой мельнице или кофемолке, сырое сырье режут ножницами, навеску бобов (сырую) растирают в ступке.
Сырую почву растирают в ступке, а сухую просеивают через сито.
2.7. Проведение определения.
Лскарстдешюе сырье (града)>горох (зерно).
Навеску сырой травы 50 г или сухой 10 г, зерен гороха (сухой) - 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 мл. Пробу заливают 100 и 50 мл 70% подкисленного НС1 ацетона соответственно и оставляют на ночь. Экстракт фильтруют и повторяют экстракцию 2 раза по 50 и 25 мл растворителя.
Обь единенные экстракты переносят в делительную воронку, добавляют 50 мл дистиллированной воды, подкисляют концентрированной H2SO4 до рН=2 и приливают 30 мл гексана. Содержимое взбалтывают к течение 2-х минут. Гексановую фракцию отбрасывают, в делительную воронку к оставшейся водно-ацетоновай фракции добавляют 30 мл хлороформа и пивот экстрагируют путем встряхивания в течение 2-х минут.
Повторяют экстракцию еще 2 раза по 25 мл. Хлороформные экстракты объединяют и переносят в делительную воронку, приливают 25 мл 50% водного раствора бикарбоната натрия, встряхивают содержимое в течение 2-х минут. После разделения слоев хлороформ отбрасывают, а в бикарбонат добавляют 1М H2SO4 до рНв2. Жидкость перемешивают до полной дегазации.
Далее в бикарбонатный раствор добавляют 25 мл хлороформа и 10 г хлористого натрия. Воронку встряхивают. После разделения фаз хлороформный слой переносят в отгонную колбу, пропуская его через слой безводного сернокислого натрия. Повторяют экстракцию порциями хлороформа по 15 мл. Хлороформ отгоняют под вакуумом при 40°С досуха.
Сухой остаток растворяют в 0,5 мл ацетона.
Соя.(трава, бобы). Навеску бобов сои 50 г сырых и 20 г сухих заливают экстрагирующей смесью (НС1 1М:Н20 :этанол, (1:39:60)) 100 и 50 мл соответственно и оставляют на ночь.
Навеску травы сои 50 г сырой и 50 г сухой также заливают экстрагирующей смесью и оставляют на ночь.
Экстракты фильтруют через воронку Бюхнера, промывая пробу экстрагирующей смесью дважды по 50 мл.
Объединение экстракты переносят в делительную воронку, доводят pH раствора до 1-2 и приливают 30 мл смеси гексана. Далее определение проводят так как в случае лекарственного сырья.
Почва. Навеску сырой почвы 100 г, навеску сухой почвы 50 г заливают смесью ацетона и 0,05 н СаС1г (2:1) и оставляют на ночь.
Количество смеси: 100 мл в случае сырой почвы, 50 мл в случае сухой.
Экстракт фильтруют в делительную воронку. Экстракцию повторяют еще 2 раза по 50 и 25 мл растворителя. Объединенные в делительной воронке экстракты подкисляют 1М H2SO4 до рН=2, добавляют50 мл хлороформа и пивот экстрагируют при перемешивании в течение 2-х минут.
Далее определение вещества проводят аналогично описанному для лекарственного сырья.
Вода. 200 мл воды помещают в делительную воронку на 500 мл, подкисляют конц. H2SO4 до рН=2.Имазетапир экстрагируют трижды по 30 мл хлороформа.
Объединенные хлороформные экстракты пропускают через слой безводного сернокислого натрия. Растворитель упаривают досуха при температуре t=40° С. Остаток растворяют в 0,5 мл ацетона.
2.7.1. Хроматографирование.
На хроматографические пластинки "Силуфол" и "Сорбфил" с помощью микропипетки на 0,1 мл наносят 0,1 мл раствора. Справа и слева наносят серию стандартных растворов имазетапира с содержанием вещества 0,4; 0,5; 0,6; 0,8; 1,0 мкг в случае проявляющего реагента о-толидина. Градуировочные растворы готовят в мерных пробирках на 10 мл согласно таблице 1.
Таблица 1.
Стандартные растворы имазетапира при проявляющем реагенте о-толидин. |
Номер стандарта |
|
____1 1 2. |
3 |
4 |
5 |
Взято стандартного раствора има-астапира 10 мкг/мл |
4 |
5 |
6 |
8 |
10 |
Добавлено ацетона в мл |
6 |
5 |
4 |
2 |
0 |
Содержание имазетапира в 0,1 мл в мкг |
0,4 |
0,5 |
0,6 |
0,8 |
1
1_- |
|
В случае проявляющего реагента бромфенолового синего, стандартные растворы определяемого соединения наносятся с содержанием 2; 3; 4; 5; 7 мкг. Градуировочные растворы готовят в мерных пробирках на 10 мл согласно таблице 2.
Таблица 2.
Стандартные растворы имазетапира при проявляющем реагенте бромфе-ноловый синий. |
Номер стандарта |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
Взято стандартного раствора имазетапира 100
мкг/МЛ |
2 |
3 |
4 |
5 |
7 |
Добавлено ацетона в мл |
8 |
7 |
6 |
5 |
3 |
Содержание имазетапира в 0,1 мл в мкг |
2 |
3 |
4 |
5 |
7 |
|
Хроматографирование осуществляют в системах:
I. Н-гексан:хлороформ:уксусная кислота: эта но л (20:2:2:1) (для лекарст-
венного сырья, почвы и воды).
II. Н-гексан:этанол:хлороформ:уксусная кислота (30:10:5:1) (для сои, почвы и воды).
При подъеме фронта растворителя на 10 см на пластинках "Силуфол" и на 5 см на пластинках "Сорбфил", пластинки вынимают из хроматографической камеры, сушат на воздухе. Далее пластинки обрабатывают проявляющим реагентом:
I. Пластинку помещают под УФ-лампу на 10 минут, а затем на 10-15 минут в хлорирующую камеру. После удаления избытка хлора, пластинку обрабагы-вают из пульверизатора о-толидином.
И. Пластинку обрабатывают бромфеноловым синим, подсушивают и опрыскивают 2% раствором лимонной кислоты.
Пивот проявляется в виде синего пятна на желтоватом фоне. Окраска сохраняется в течение 5-10 минут.
Rf препарата 0,35. Если температура будет ниже 20°С, то значение Rf может быть ниже указанной величины.
2.8. Обработка результатов анализа.
Количественное определение содержания имазетапира в пробе проводят путем сравнения площади интенсивности окраски пятен рабочей пробы и серии стандартных растворов.
Содержание имазетапира в анализируемой пробе (X) мг/кг вычисляют по формуле:
C.V
VT7F1
С - содержание имазетапира, найденное в хроматографируемой пробе, мкг; V - общий объем раствора, мл;
V] - объем аликвоты нанесенной на пластинку, мл;
Р - навеска анализируемой пробы в г.
3. Требования техники безопасности.
Соблюдать требования техники безопасности, принятие для работы с растворителями, легковоспламеняющимися жидкостями и пестицидами.