Купить ГОСТ Р 54414-2011 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее
Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"
Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.
Распространяется на отварную, копченую, соленую продукцию с массовой долей поваренной соли не более 5,5 % и фаршевые изделия из рыбы, а также рыбу-сырец, охлажденную, мороженую, используемую для приготовления этой продукции, и устанавливает метод электрофореза с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле (далее – SDS-электрофорез) для видовой идентификации рыбы.
1 Область применения
2 Нормативные ссылки
3 Термины и определения
4 Сущность метода
5 Требования к оборудованию, материалам и реактивам
6 Отбор проб
7 Приготовление растворов
8 Референс-образцы
9 Проведение анализа
10 Обработка результатов анализа
11 Условия проведения измерений
12 Требования безопасности
Приложение А (рекомендуемое) Результаты проведения анализа и компьютерной обработки полученных данных при определении вида рыбы в образце рыбных палочек
Приложение Б (рекомендуемое) Результаты проведения анализа и компьютерной обработки полученных данных при определении вида рыбы в анализируемом образце
Приложение В (рекомендуемое) Форма протокола испытаний
Дата введения | 01.01.2013 |
---|---|
Добавлен в базу | 01.10.2014 |
Актуализация | 01.01.2021 |
22.09.2011 | Утвержден | Федеральное агентство по техническому регулированию и метрологии | 334-ст |
---|---|---|---|
Разработан | ОАО Гипро-рыбфлот | ||
Издан | Стандартинформ | 2013 г. |
Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ | |
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ( fpf т Л СТАНДАРТ V J РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ |
ГОСТР 54414- гои |
РЫБА И ПРОДУКЦИЯ ИЗ НЕЕ
Видовая идентификация рыбы методом электрофореза с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле
Издание официальное
Москва
Стандартинформ
2013
Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Открытым акционерным обществом «Научно-исследовательский и проектноконструкторский институт по развитию и эксплуатации флота» (ОАО «Гипрорыбфлот»)
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 299 «Консервы и пресервы из рыбы и нерыбных объектов, тара, методы контроля»
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 сентября 2011 г. № 334-ст
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
© Стандартинформ, 2013
Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
Приложение А (рекомендуемое)
Результаты проведения анализа и компьютерной обработки полученных данных при определении вида рыбы в образце рыбных палочек
1 2 3 4 5 6
1 — набор стандартных белков для градуировки; 2 — референс-образец рыбных палочек из налима; 3 — референс-образец рыбных палочек из камбалы; 4, 5 — референс-образец рыбных палочек из путассу; 6 — анализируемый образец рыбных палочек |
А.1 Пример картины распределения белковых фракций на электрофореграмме приведен на рисунке А.1 (разделение и окрашивание белков на геле было проведено на системе PhastSystem, перенос изображения на компьютер и обработка данных были проведены с помощью системы видеодокументирования ImageMaster VDS и компьютерной программы ImageMaster ID).
Молекулярная масса, а.е.м.
97.0-
45.0-
30.0-
14,4-
Рисунок А.1
8
ГОСТ P 54414—2011
А.2 График, полученный в результате компьютерной обработки электрофореграммы набора стандартных белков для градиентного геля 10 %—15 %, приведен на рисунке А.2.
Молекулярная масса, а.е.м. |
Рисунок А.2 |
А.З Пример компьютерной обработки электрофореграмм при анализе значений молекулярных масс белков анализируемого образца и референс-образцов приведен в таблице А.1.
Таблица А.1 — Молекулярная масса ММ маркерных белков анализируемого образца и референс-образцов В а. е. м. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
9
А.4 Обобщение результатов анализа для определения вида рыбы в анализируемом образце рыбных палочек— по рисункам А.1, А.2 и таблице А.1.
А.4.1 В результате SDS-электрофореза выделенных белков мышечной ткани референс-образцов из разных видов рыб получены отличающиеся друг от друга картины распределения белковых фракций.
А.4.2 У анализируемого образца распределение маркерных белков и значения молекулярных масс совпадают с локализацией основных белков референс-образца из путассу и их значениями ММ. Таким образом, можно сделать вывод, что анализируемый образец рыбных палочек приготовлен из путассу.
10
Приложение Б (рекомендуемое)
Результаты проведения анализа и компьютерной обработки полученных данных при определении вида рыбы в анализируемом образце
6 7 |
1 — набор стандартных белков для градуировки; 2 — референс-образец горбуши отварной; 3 — референс-образец горбуши-сырца; 4,7 — анализируемый образец отварной рыбы; 5— референс-образец семги отварной; 6 — референс-образец семги-сырца |
Б.1 Пример картины распределения белковых фракций на электрофореграмме приведен на рисунке Б.1 (разделение и окрашивание белков на геле было проведено на системе PhastSystem, перенос изображения на компьютер и обработка были проведены с помощью системы видеодокументирования ImageMaster VDS и компьютерной программы ImageMaster).
Молекулярная масса, а.е.м.
Рисунок Б.1
11
Б.2 График, полученный в результате компьютерной обработки электрофореграммы набора стандартных белков для градиентного геля 10 %—15 %, приведен на рисунке Б.2.
Рисунок Б.2 |
Б.З Пример компьютерной обработки электрофореграмм при анализе значений молекулярных масс белков анализируемого образца и референс-образцов приведен в таблице Б.1.
Таблица Б.1 — Молекулярная масса ММ маркерных белков анализируемого образца и референс-образцов
В а. е. м. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Б.4 Обобщение результатов анализа для определения вида анализируемого образца — по рисункам Б, 1, Б.2 и таблице Б.1.
Б.4.1 В результате SDS-электрофореза выделенных белков мышечной ткани референс-образцов из двух видов рыб видно, что у горбуши (так же, как и у семги) локализация маркерных белков и значение их молекулярных масс для рыбы-сырца и отварного образца совпадают.
Б.4.2 У анализируемого образца распределение маркерных белков и значения их молекулярных масс полностью совпадают с локализацией основных белков и значениями их молекулярных масс референс-образцов из горбуши-сырца и в отварном виде. Таким образом, можно сделать вывод, что анализируемый образец отварной рыбы приготовлен из горбуши.
В качестве референс-образца могут быть использованы как рыба-сырец, так и отварная рыба.
13
Приложение В (рекомендуемое)
Форма протокола испытаний
Наименование организации (испытательной лаборатории)
ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ
№_от «_»_20_г.
Даты: поступления на испытание: «_»_20_г.
конца испытаний: «_»_20_г.
Продукция_
Производитель сырья или продукции_
Предъявитель сырья или продукции_
Отбор образцов проведен_
Акт отбора образцов и техническое задание на испытания №_от «_»_20_г.
Испытания проведены на основании требований_
Номер образца_
Характеристика анализируемого образца (вид и состояние упаковки, этикетки, штриховка)
Маркировка_
Годен до_Штриховой код_
наименование анализируемого образца продукции
Результаты анализа: установлено, что_
_идентичен/неидентичен
наименование вида
Исполнители:
инициалы, фамилия подпись
инициалы, фамилия подпись
Руководитель испытательной лаборатории
инициалы, фамилия подпись
МП
Заключение распространяется на образец, представленный на испытания.
14
УДК 576.8.078:006.354 ОКС 67.120.30 Н29 ОКСТУ 9209
Ключевые слова: сырье, рыбная продукция, видовая идентификация, метод SDS-электрофореза
15
Редактор Л.В. Коретникова Технический редактор В.Н. Прусакова Корректор Р.А. Ментова Компьютерная верстка В.И. Гоищенко
Сдано в набор 20.03.2013. Подписано в печать 20.04.2013. Формат бОхЭД^в. Гарнитура Ариал. Уел. печ. л. 2,32.
Уч.-изд. л. 1,45. Тираж 158 экз. Зак. 461.
ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ», 123995 Москва, Гранатный пер., 4. www.gostinfo.ru info@gostinfo.ru Набрано во ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» на ПЭВМ.
Отпечатано в филиале ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» — тип. «Московский печатник», 105062 Москва, Лялин пер., 6.
ГОСТ P 54414—2011
1 Область применения............................................1
2 Нормативные ссылки............................................1
3 Термины и определения..........................................2
4 Сущность метода..............................................2
5 Требования к оборудованию, материалам и реактивам.........................2
6 Отбор проб.................................................3
7 Приготовление растворов.........................................3
8 Референс-образцы.............................................4
9 Проведение анализа............................................5
10 Обработка результатов анализа.....................................6
11 Условия проведения измерений.....................................7
12 Требования безопасности........................................7
Приложение А (рекомендуемое) Результаты проведения анализа и компьютерной обработки
полученных данных при определении вида рыбы в образце рыбных палочек.....8
Приложение Б (рекомендуемое) Результаты проведения анализа и компьютерной обработки
полученных данных при определении вида рыбы в анализируемом образце.....11
Приложение В (рекомендуемое) Форма протокола испытаний.....................14
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
РЫБА И ПРОДУКЦИЯ ИЗ НЕЕ
Видовая идентификация рыбы методом электрофореза с додецилсульфатом натрия
в полиакриламидном геле
Fish and products from it. Species identification offish by electrophoresis with sodium dodecyl sulphate in polyacrylamide gel method
Дата введения — 2013—01—01
Настоящий стандарт распространяется на отварную, копченую, соленую продукцию с массовой долей поваренной соли не более 5,5 % и фаршевые изделия из рыбы, а также рыбу-сырец, охлажденную, мороженую, используемую для приготовления этой продукции, и устанавливает метод электрофореза с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле (далее — SDS-электрофорез) для видовой идентификации рыбы.
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ Р 52840-2007 Рыба и продукция из нее. Видовая идентификация рыбы методом изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле.
ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть первая. Метрологические и технические требования.
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования
ГОСТ 83-79 Реактивы. Натрий углекислый. Технические условия ГОСТ 244-76 Натрия тиосульфат кристаллический. Технические условия ГОСТ 1277-75 Реактивы. Серебро азотнокислое. Технические условия ГОСТ 1625-89 Формалин технический. Технические условия
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
Издание официальное
ГОСТ 6259-75 Реактивы. Глицерин. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 19814-74 Кислота уксусная синтетическая и регенерированная. Технические условия
ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ 31339-2006 Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила приемки и методы отбора проб
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 SDS-электрофорез: Метод электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.
3.2 маркерные белки: Основные белки, характерные (видоспецифичные) для каждого вида анализируемого объекта.
[ГОСТ Р 52840-2007, статья 3.2]
3.3 стандартные белки: Белки с известной молекулярной массой (ММ).
3.4 референс-образец: Образец продукции, используемый в качестве стандарта при оценке результатов идентификации.
Метод основан на видовой специфичности белков мышечной ткани рыб и заключается в переводе белков исследуемого образца в раствор с помощью додецилсульфата натрия и дальнейшем разделении белковых молекул в соответствии с их молекулярной массой в градиентном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Идентификацию проводят путем сравнения картин электрофоретического распределения белковых фракций анализируемого образца с соответствующим референс-об-разцом.
Для проведения анализа используют следующее оборудование, материалы и реактивы:
- универсальную модульную автоматизированную систему для разделения белков с использованием готовых гелевых сред в программируемом режиме и автоматической обработкой гелей (фиксация, окрашивание, отмывка), с контролем условий разделения (температуры, параметров тока) со следующими программными параметрами: напряжение от 10 до 2000 В, сила тока от 0,1 до 50,0 мА, мощность
7,0 Вт, температура от 0 °С до 70 °С или иное электрофоретическое оборудование для разделения белков методом SDS-электрофореза (далее — система);
- центрифугу рефрижераторную с частотой вращения не менее 12000 мин-1;
- рН-метр — милливольтметр лабораторный pH — 673 М;
- пробирки центрифужные вместимостью 10 см3;
- аппликатор с капиллярными отверстиями объемом 1 мкл для внесения образцов в гель;
ГОСТ P 54414—2011
- микродозатор с переменным объемом дозирования: от 0,5 до 10,0 мм1 (шаг — 0,1 мм1, точность + (1,5 - 5,0) %, воспроизводимость от 1,0 % до 5,0 %);
- наконечники для микродозаторов (микропипеток) с переменным объемом дозирования жидкостей;
- ступку фарфоровую по ГОСТ 9147;
- штамп для образца с лунками вместимостью не менее 1,5 мкп;
- весы неавтоматического действия II класса точности с допускаемой погрешностью взвешивания не более + 0,001 г по ГОСТ Р 53228;
- холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда по ГОСТ 26678;
- колбы стеклянные мерные 2-50-2, 2-100-2 и 2-1000-2 по ГОСТ 1770;
- цилиндры стеклянные мерные лабораторные 1-50-2, 1-100-2 по ГОСТ 1770;
- пипетки стеклянные 1-1-2-5, 1-1-2-10 по ГОСТ 29227;
- полоски буферные из агарозы;
- гели градиентные полиакриламидные с додецилсульфатом натрия, 10 %—15 %;
- пленку парафиновую;
- бумагу фильтровальную лабораторную по ГОСТ 12026;
- кислоту уксусную по ГОСТ 19814, х. ч.;
- спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652, х. ч.;
- глицерин по ГОСТ 6259, ч. д. а.;
- 2-меркаптоэтанол, ч. д. а;
- додецилсульфат натрия, х. ч.;
- краситель бромфеноловый синий, ч. д. а;
- краситель кумасси R 250, ч. д. а;
- /т?рис(гидроксиметил)аминометан гидрохлорид, х. ч.;
- /т?рис(гидроксиметил)аминометан, х. ч.;
- воду дистиллированную по ГОСТ 6709;
- альдегид глутаровый с содержанием основного компонента не менее 25 %;
- серебро азотнокислое по ГОСТ 1277;
- натрий углекислый 12,5 %-ный;
- натрия тиосульфат кристаллический по ГОСТ 244;
- формальдегид 37 %-ный по ГОСТ 1625;
- набор стандартных белков для градуировки с известными молекулярными массами в диапазоне от 14400 до 97000 а. е. м.
Допускается использование других средств измерений и вспомогательного оборудования по метрологическим, техническим характеристикам и качеству не ниже указанных в настоящем стандарте.
Допускается использование других реактивов, в том числе импортных, по качеству и чистоте не ниже вышеуказанных.
Отбор проб проводят по ГОСТ 31339.
7.1 Экстрагирующий раствор
В мерную колбу вместимостью 100 см1 вносят 2 г додецилсульфата натрия и доводят объем до метки дистиллированной водой.
7.2 Буферный раствор
В мерную колбу вместимостью 50 см1 вносят 5 см1 водного раствора трис-буфера по 7.2.1, добавляют 4 см1 глицерина, 8 см1 10 %-ного водного раствора додецилсульфата натрия, 2 см1 2-меркаптоэта-нола и 2 см1 0,1 %-ного водного раствора бромфенолового синего.
7.2.1 Приготовление водного раствора трис-буфера: в мерную колбу вместимостью 100 см1 вносят 3 см1 раствора /т?рис(гидроксиметил)аминометана молярной концентрацией 0,5 моль/дм1 и доводят
объем до метки водным раствором /77рцс(гидроксиметил)аминометан гидрохлорида молярной концентрацией 0,5 моль/дм3. Значение pH водного раствора трис-буфера должно составлять 6,8 ± 0,01.
7.2.1.1 Приготовление водного раствора трис(гидроксиметил)аминометан гидрохлорида молярной концентрацией 0,5 моль/дм3: в мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 78,5 г трис(гидрокси-метил)аминометан гидрохлорида и доводят объем до метки дистиллированной водой.
7.2.1.2 Приготовление водного раствора трис(гидроксиметил)аминометана молярной концентрацией 0,5 моль/дм3: в мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 60,5 гтрис(гидроксиметил)амино-метана и доводят объем до метки дистиллированной водой.
7.2.2 Приготовление 10 %-ного водного раствора додецилсульфата натрия: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 10 г додецилсульфата натрия и доводят объем до метки дистиллированной водой.
7.2.3 Приготовление 0,1 %-ного водного раствора бромфенолового синего: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,1 г бромфенолового синего и доводят объем до метки дистиллированной водой.
7.3 Растворы для обработки гелей при окрашивании раствором кумасси
7.3.1 Приготовление промывного раствора: в мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 300 см3 96 %-ного этилового спирта, добавляют 600 см3 дистиллированной воды и 100 см3 уксусной кислоты.
7.3.2 Окрашивающий раствор состоит из основного и рабочего.
7.3.2.1 Приготовление основного раствора: в мерную колбу вместимостью 300 см3 помещают 0,4 г кумасси, добавляют 80 см3 дистиллированной воды и перемешивают в течение 5—10 мин. Добавляют 120 см3 96 %-ного этилового спирта и перемешивают еще 2 мин.
7.3.2.2 Приготовление рабочего раствора: в мерной колбе вместимостью не менее 100 см3 смешивают 50 см3 основного раствора с 50 см3 раствора 20 %-ной уксусной кислоты.
7.3.2.3 Приготовление раствора 20 %-ной уксусной кислоты: 20 см3 уксусной кислоты растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см3 и доводят до метки.
7.3.3 Приготовление консервирующего раствора: в мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 40 см3 глицерина, 40 см3 уксусной кислоты и доводят объем до метки дистиллированной водой.
7.4 Растворы для обработки гелей при окрашивании серебром
7.4.1 Приготовление промывного раствора: в мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 100 см3 96 %-ного этилового спирта, добавляют 850 см3 дистиллированной воды и 50 см3 уксусной кислоты.
7.4.2 Приготовление окрашивающего раствора: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят (0,15 + 0,001) г азотнокислого серебра и доводят объем дистиллированной водой до метки.
7.4.3 Приготовление раствора, усиливающего окраску: в мерной колбе вместимостью 100 см3 смешивают 30 см3 25 %-ного глутарового альдегида и 60 см3 дистиллированной воды.
7.4.4 Приготовление раствора, развивающего окраску: в мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 200 см3 12,5 %-ного раствора углекислого натрия, 800 см3 дистиллированной воды и 0,4 см3 37 %-ного формальдегида.
7.4.5 Приготовление раствора, останавливающего окраску: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят (1,60 + 0,01) г тиосульфата натрия и (3,70 ± 0,01) г трис(гидроксиметил)аминометан гидрохлорида и доводят объем дистиллированной водой до метки.
7.4.6 Приготовление консервирующего раствора: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 10 см3 глицерина и доводят объем до метки дистиллированной водой.
7.5 Растворы могут храниться в течение месяца при комнатной температуре. Рабочий раствор готовят вдень использования.
В качестве референс-образца для видовой идентификации рыбы, в том числе в составе рыбной продукции, в соответствии с областью применения настоящего стандарта могут быть использованы: соответствующий образец рыбы-сырца (для однокомпонентных продуктов) или образец, приготовленный по технологии аналогичной технологии изготовления анализируемого образца (для одно- и многокомпонентных продуктов). 2
9.1 Подготовка образцов к анализу
Пробы анализируемого образца и референс-образца готовят в идентичных условиях.
9.1.1 Мышечную ткань анализируемого образца массой не менее 1 г измельчают в ступке.
9.1.2 Пробу анализируемую образца по 9.1.1 отбирают массой (0,50 ±0,01) г в центрифужные пробирки вместимостью 10 см3 и заливают 2 см3 2 %-ного водного раствора додецилсульфата натрия по 7.1, смесь периодически перемешивают в течение 30 мин.
9.1.3 Смесь, полученную по 9.1.2, центрифугируют при частоте вращения 12000 мин-1 при температуре 20 °С в течение 15 мин.
9.1.4 Надосадочную жидкость, полученную по 9.1.3, фильтруют через бумажный фильтр и отбирают в стеклянные пробирки вместимостью 10 см3 по 0,25 см3 фильтрата.
9.1.5 К раствору, полученному по 9.1.4, добавляют 1,5 см3 буферного раствора, приготовленного по 7.2, и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, при необходимости фильтруют и используют для проведения электрофореза.
9.2 Приготовление раствора стандартных белков
9.2.1 Набор стандартных белков для градуировки с известной молекулярной массой растворяют в
1,5 см3 буферного раствора, приготовленного по 7.2, и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры и используют для проведения электрофореза.
9.2.1.1 Для видовой идентификации рыбы методом SDS-электрофореза используется набор стандартных белков для градуировки с молекулярной массой от 14400 до 97000 а. е. м. промышленного производства в виде сухой замороженной смеси.
9.2.1.2 Для автоматизированной разделительной системы используется набор белков с общей массой 100 мкг:
- фосфорилаза Б с молекулярной массой 97000 а. е. м.;
- альбумин с молекулярной массой 66000 а. е. м.;
- овальбумин с молекулярной массой 45000 а. е. м.;
- карбоангидраза с молекулярной массой 30000 а. е. м.;
- ингибитор трипсина с молекулярной массой 20100 а. е. м.;
- альфа-лактальбумин с молекулярной массой 14400 а. е. м.
9.3 Проведение SDS-электрофореза
9.3.1 Полиакриламидный гель помещают в систему в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
9.3.2 Вставляют буферные полоски в отделения держателя буферных полосок: одну — в отделение катода и одну — в отделение анода.
9.3.3 Электроды устанавливают в верхнем положении.
9.3.4 Формируют лунки в парафиновой пленке с помощью штампа: штамп с лунками, обращенными вверх, кладут на стол, накрывают парафиновой пленкой защитным слоем вверх (по направлению линий отверстий), в парафиновой пленке, двигаясь вдоль линии лунок, делают углубления при помощи стеклянной палочки, а затем снимают защитный слой.
9.3.5 Растворы, т. е. раствор анализируемого образца и аналогично приготовленный раствор референс-образца, полученные по 9.1.5, а также раствор стандартных белков для градуировки с известной молекулярной массой, приготовленный по 9.2, вносят микродозатором в каждую лунку 1,5 мкп.
9.3.6 Аппликатор опускают на поверхность растворов (стандартных белков для градуировки, анализируемого образца и референс-образцов), помещенных в лунки по 9.3.5, сформированные в парафиновой пленке с помощью штампа по 9.3.4, нарушая поверхность капель для заполнения капилляров.
9.3.7 Аппликатор, наполненный образцами по 9.3.6, помещают в систему со стороны катода и проводят электрофорез в автоматическом режиме в соответствии с инструкцией к системе.
Условия разделения: напряжение 220 В, ток 10 мА, мощность 2,5 Вт, температура 15 °С. Когда разделение закончено, гель вынимают и переносят в камеру окрашивания. Окончанием разделения служит звуковой сигнал, подаваемый системой.
9.4 Проведение окрашивания
Полиакриламидные гели окрашивают в автоматическом режиме с применением кумасси в соответствии с таблицей 1 или азотнокислого серебра в соответствии с таблицей 2. 3
Таблица 1 — Программа окрашивания полиакриламидных гелей с помощью раствора кумасси | ||||||||||||||||||||
|
Таблица 2 — Программа окрашивания полиакриламидных гелей с помощью раствора азотнокислого серебра | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Процесс окрашивания занимает от 30 до 50 мин. Затем полиакриламидные гели вынимают из системы и высушивают при температуре от 20 °С до 25 °С в течение 4 ч.
10.1 Полученную картину электрофоретического распределения белковых фракций анализируемой пробы сравнивают с картиной распределения белковых фракций референс-образца.
10.2 Строят графическую зависимость значений молекулярных масс стандартных белков от расстояния каждой белковой фракции до катода.
10.3 Измеряют расстояние от катода до локализации белков анализируемого образца и референс-образца и с помощью калибровочного графика, построенного по 10.2, находят соответствующие значения молекулярных масс белков. Графическое построение и определение молекулярных масс может осуществляться или с помощью компьютерной программы после переноса изображения распределения белковых фракций с полиакриламидного геля на монитор компьютера с использованием систем видеодокументирования, или ручным способом путем измерений расстояний с помощью линейки от катода до каждой белковой фракции.
10.4 Совпадение картин распределения белковых фракций и совпадение значений молекулярных масс маркерных белков анализируемого образца и референс-образцов свидетельствует об их 4
ГОСТ P 54414—2011
идентичности и подтверждает правильность заявленного наименования анализируемого образца. Примеры результатов анализа и их компьютерной обработки для разных видов анализируемых объектов приведены в приложениях А и Б.
10.5 Для подтверждения результатов идентификации проводят параллельное разделение белков как из одной пробы, так и из идентичных проб, полученных из двух-трех образцов анализируемого объекта.
10.6 Результаты анализа оформляют в виде протокола. Образец протокола приведен в приложении В.
При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:
- температура окружающего воздуха (22 ± 5) °С;
- атмосферное давление от 84,0 до 106,7 кПа;
- влажность воздуха не более 80 % при 25 °С;
- напряжение в сети (220 ± 10) В;
- частота переменного тока в сети питания (50 ± 1) Гц.
12.1 При выполнении работ с химическими реактивами необходимо соблюдать требования техники безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007.
12.2 Помещение, в котором проводятся работы, должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.
12.3 При работе с электроустановками электробезопасность должна соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.019. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
7
1
2
3
4