ГОСТ Р 51423-99 (ИСО 6655-97)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КОРМА, КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ

Метод определения массовой доли растворимого азота после обработки пепсином в разведенной соляной кислоте

Издание официальное

ГОССТАНДАРТ РОССИИ Москва

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Творческим коллективом с участием представителей Технического комитета но стандартизации ТК 4 «Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы»

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 «Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы»

2    ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 22 декабря 1999 г. № 578-ст

3    Настоящий стандарт представляет собой аутентичный текст международного стандарта ИСО 6655—97 «Корма для животных. Определение содержания растворимого азота после обработки пепсином в разведенной соляной кислоте», за исключением 2, 6

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5    ПЕРЕИЗДАНИЕ

Настоящий стандарт нс может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания на территории Российской Федерации без разрешения Госстандарта России

53

ГОСТ F 51423-99 (ИСО 6655-97)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КОРМА. КОМБИКОРМА. КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ

Метол определения массовой доли растворимого азота после обработки пепсином в разведенной соляной кислоте

FccdsJufTs, compound feeds, feed raw materials. Method for determination of soluble nitrogen fraction of total mass after treatment with pepsin in dilute hydrochloric acid

Дата введения 2001-01-01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на корма, комбикорма и комбикормовое сырье и устанавливает метод определения массовой доли растворимого азота после обработки пепсином в разведенной соляной кислоте.

Настоящим методом определяется суммарная массовая доля белкового и небелковою азота.

Примечания

1    Значения, получаемые настоящим метолом, нс связаны напрямую с показателем пере вари пае мосг и in vivo.

2    Если массовую долю небелкового азота нужно исключить из результата испытании, ее следует определить соответствующим методом.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте используют ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 13496.0-80* Комбикорма, сырье. Методы отбор;! проб

ГОСТ Р 51417-99 (ИСО 5983—97) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Определение массовой доли азота и расчет массовой доли сырого протеина. Метод Къельдаля

ГОСТ Р 51419-99 (ИСО 6498—98) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Подготовка испытуемых проб

3    Сущность метода

Инкубация пробы в растворе пепсина в разведенной соляной кислоте при 40 °С в течение 48 ч. Фильтрование суспензии и определение массовой доли азота в фильтрате или в осадке на фильтре методом Къельдаля по ИСО 5983. В последнем случае дополнительно проводят определение массовой дат и азота в пробе в соответствии с ИСО 5983.

4    Реактивы

Используют реактивы квалификации х.ч. или ч.д.а.. но всех реактивах (за исключением стандартных материалов) должны отсутствовать азотсодержащие компоненты.

4.1    Дистыированная или деминерализованная вода.

4.2    Разведенная соляная кислота молярной концентрации с (HCI) = 0.075 моль/дм³.

• Действует до введения в действие ГОСТ Р, разработанного на основе ИСО 6497 111.

И манне официальное

1

ГОСТ Р 51423-99

4.3    Пепсин активностью 2.0 сдиниц/мг в соответствии с определением, данным в приложении А.

4.4    Раствор пепсина в соляной кислоте активностью пепсина около 400 единиц/дм³.

Растворяют (0.2±0.001) г пепсина в 1 дм' разведенной соляной кислоты. Раствор готовят

непосредственно перед использованием.

Если активность пепсина отклоняется от 2.0 сдинип/мг. регулируют массу пепсина таким образом, чтобы получить раствор активностью пепсина 400 единиц/дм³.

4.5    Соляная кислота молярной концентрации с (HCI) = 7.5 моль/дм³ (рю ⁼ 1.125 г/см³).

5    Оборудование и материалы

Используют обычное лабораторное оборудование.

5.1    Водяная баня или инкубатор для поддержания температуры (40±1) *С.

5.2    Колбы Къельдаля соответствующей вместимости.

5.3    Фильтровальная бумага, быстро фильтрующая кислотостойкая.

5.4    Оборудование для перегонки и фильтрации.

6    Отбор проб

6.1    Отбор проб - по ГОСТ 13496.0.

Проба, получаемая лабораторией, должна быть действительно представительной и защищена от изменений своих качеств при транспортировании и хранении.

7    Подготовка испытуемых проб

7.1    Подготовка испытуемых проб — по ГОСТ Р 51419

Если массовая доля жира в пробе превышает 10 %. жир экстрагируют в соответствии с ГОСТ Р 51419 и учитывают это при расчете (раздел 9).

8    Проведение испытании

8.1    Взятие навески

Берут навеску подготовленной пробы массой около 2 г с точностью до 0.001 г.

8.2    Инкубация

Навеску пробы помещают в мерную колбу вместимостью 500 см³, добавляют 450 см³ раствора пепсина, предварительно подогретого до 40 *С. Содержимое колбы перемешивают дтя предотвращения агломерации. Проверяют pH суспензии, которая должна быть ниже 1.7. Колбу помещают на водяную баню или в инкубатор, установленный на 40 'С. и выдерживают се там в течение 48 ч. Содержимое колбы перемешивают через 8.24 и 32 ч.

По истечении 48 ч в колбу вносят 15 см' соляной кислоты, с (НС1) = 7.5 моль/дм³, и охлаждают содержимое до 20 ’С. Объем в колбе доводят водой до метки, содержимое перемешивают и фильтруют через фильтровальную бумагу. Дальнейшее испытание проводят по 8.3 или 8.4.

8.3    Определение массовой доли азота в фильтрате

8.3.1    Минерализация

Отбирают 250 см' фильтрата и переносят ею в колбу Къельдаля. В колбу добавляют реактивы, необходимые для минерализации, как указано в ГОСТ Р 51417. 8.2.1. Содержимое колбы доводят до кипения.

Примечай и с — Рекомендуется внести и колбу реактив, предотвращающий ценообразование.

Содержимое колбы выпаривают при интенсивном кипении почти до пашою испарения воды. Остаток воды удаляют с осторожностью, снижая интенсивность нагрева. После тою. как жидкость в колбе станет прозрачной, нагревание продалжают сше в течение 1 ч. затем колбу охлаждают.

8.3.2    Отгонка и титрование

Отгонку аммиака и титрование проводят но ГОСТ Р 51417. 8.2.2 и 8.2.3.

55

8.3.3 Контрольный опыт

Контрольный опыт проводят, выполняя те же операции с использованием тех же реактивов, за исключением навески пробы. Обработку результатов проводят в соответствии с разделом 9.

8.4 Определение массовой доли азота в осадке после фильтрации

8.4.1    Минерализация осадка после фильтрации

Фильтр и осадок на нем промывают теплой водой до полного удаления кислоты. Фильтр с осадком переносят в колбу Къельдаля и дальнейшее испытание проводят по 8.3.1 настоящего стандарта.

8.4.2    Отгонка и титрование — по ГОСТ Р 51417. 8.2.2 и 8.2.3.

8.4.3    Определение массовой доли азота в пробе

Массовую долю азота в подготовленной пробе определяют в соответствии с ГОСТ Р 51417.

8.4.4    Контрольный опыт

Контрольный опыт проводят, выполняя те же операции с использованием тех же реактивов, за исключением навески пробы.

9 Обработка результатов

9.1 Расчет массовой доли растворимого а юга при выполнении испытания по 8.3

При условии, что для улавливания аммиака из пробы и в контрольном опыте использовались равные количества серной кислоты ГОСТ Р 51417. массовую долю растворимого азота в пробе 1Р,. г/кг, рассчитывают по формуле

_2(Ц-Р,КА/

m

где Vq — объем раствора гидроксида натрия, пошедший на титрование в контрольном опыте ГОСТ Р 51417. 4.9.1, см³;

V1 — объем раствора гидроксида натрия, пошедший на титрование в опыте с пробой по 8.3.2 ГОСТ Р 51417. 4.9.1, см³; с — молярная концентрация раствора гидроксида натрия, использованного на титрование, ГОСТ Р 51417. 4.9.1, моль/дм³;

М — молярная масса азота, г/моль (А/ = 14 г/моль); т — масса навески, г.

Результат испытания округляют с точностью до 0.1 г/кг.

9.2 Расчет массовой доли растворимого азота при выполнении испытания по 8.4

При условии, что для улавливания аммиака из пробы и в контрольном опыте использовались равные количества серной кислоты по ГОСТ Р 51417. массовую долю растворимого азота в пробе ИЛ, г/кг. рассчитывают по формуле

где H'n — массовая доля азота в пробе, определенная по 8.4.3. г/кг.

Результат испытания округляют с точностью до 0.1 г/кг.

9.3 Расчет массовой доли растворимого сырого протеина

Массовую долю растворимого сырого протеина рассчитывают умножением массовой доли растворимого азота на 6.25.

10 Точность метода

10.1    Межлабораториое испытание

Результаты межлабораторного испытания точности метода приведены в приложении Б. Полученные точностные характеристики применимы только для исследованных объектов в исследованном диапазоне концентраций анализируемого вещества.

10.2    Сходимость

Абсолютная разница между двумя независимыми единичными результатами испытаний, по-

56

ГОСТ Р 51423-99

лученными настоящим методом на одной и той же пробе в одной лаборатории одним и тем же оператором с использованием одною и того же оборудования в течение короткого промежутка времени, превышает значения показателя г, приведенные в таблице 1. не более чем в 5 % случаев.

10.3 Воспроизводимость

Абсолютная разница между двумя единичными результатами испытаний, полученными настоящим методом на одной и той же пробе в рахтичных лабораториях различными операторами с использованием различного оборудования, превышает значения показателя R. приведенные в таблице 1. не более чем в 5 % случаев.

Табл и к а 1 — Пределы сходимости г и воспроизводимости R

Проба Среднее значение массовой доли растворимого сырого протеина, г/кг сухого продукта г, г/кг R, г/кг Мука люцерны 136.6 7.2 26.5 Кукурузный кормовой глютен 141.5 8.9 28.9 Кокосовая мука 149.5 7.4 31.6 Травяной силос 192.9 7.9 36.3 Костная мука 512.0 8.9 63.1 Перьевая мука 574.3 22.1 166.3

11 Оформление результатов испытания

Отчет о результатах испытания должен содержать:

-    всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;

-    метод, в соответствии с которым произведен отбор проб (если известен);

-    метод испытания;

-    полученный результат испытания, представленный в виде содержания растворимого азота или растворимого сырого протеина (в последнем случае указывают коэффициент пересчета 6.25);

-    если проверена сходимость, окончательный результат с оценкой сходимости;

-    все подробности проведения испытания, не указанные в настоящем стандарте, или рассматриваемые как несущественные вместе со всеми побочными обстоятельствами, которые могли влиять на результаты испытания.

57

ПРИЛОЖЕНИЕ А

(обязательное)

Определение активности пепсина

A.I Область распространения

Настоящее приложение устанавливает метод определения активности пепсина, используемый при определении массовой доли растворимого азота после обработки пепсином в разведенной соляной кислоте. Л.2 Определение

В настоящем приложении использован следующий термин с соответствующим определением: единица активности пепсина. Масса пепсина, необходимая для высвобождении за одну минуту при определенных условиях того количества оксиарильных групп, которое при взаимодействии с реактивом Фалина—Сиокадго даст оптическую плотность, эквивалентную 1 мкмоль тирозина в тех же условиях.

Л.З Сущность метода

Обработка гемоглобина пепсином в разведенной соляной кислоте. Осаждение нсгилролнзованной части белка трихлоруксусной кислотой. Фильтрация и добавление гидроокиси натрия и реактива Фалина—Сиокадго. Измерение оптической плотности этого раствор;! при длине волны 750 нм и определение соответствующей массы тирозина с помощью градуировочного графика.

Д.4 Реактивы

Используют реактивы квалификации х.ч. иди ч.л.а.. дистиллированную или деминерализованную воду:

соляную кислоту молярной концентрации с (MCI) = 0.2 моль/дм³;

соляную кислоту молярной концентрации с (IICI) = 0.06 моль/дм³;

соляную кислоту молярной концентрации с (IICI) = 0.025 моль/дм³;

раствор трихлоруксусной кислоты массовой концентрации с (CCI3CO2H) = 50 г/дм³;

раствор гидроксида натрия молярной концентрации с (NaOII) = 0.5 моль/дм³;

реактив Фол и на—Сиокадго

В круглодонную колбу со шлифом вместимостью 2 дм³ помещают 100 г дигидрата вольфрамата натрия (NaiWO^ 211>0). 25 г ли гидрата молибдата натрия (NayMoO-r 21 ПО) и 700 см³ воды. В колбу добааляют 50см¹ фосфорной кислоты. р(М₃Р0₄) = 1,71 r/см³ и 100 см³ концентрированной соляной кислоты. р(МС1) = ■1.19 г/см³. К колбе присоединяют обратный холодильник, раствор доводят до кипения и аккуратно кипятят в течение 10 ч. Затем колбу охлаждают, отсоединяют обратный холодильник, добааляют 175 г дигидрата сульфата лития (LHSO4 21 ПО), 50 см³ воды и I см³ брома. Содержимое колбы кипятят в течение 15 мин для удаления избытка брома.

Колбу охлаждают, раствор декантируют в мерную колбу вместимостью 1 дм³. Объем содержимого в колбе доводят до метки дистиллированной водой, раствор перемешивают и фильтруют. Остаточная зеленоватая окраска раствора не допускается.

Перед использованием один объем реактива разводит двумя объемами воды; раствор гемоглобина

Берут навеску гемоглобино-протеинового субстрата около 2 г по методу Ансона. соответствующую 354 мг азота, и помещают ее в колбу со шлифом вместимостью 200 см³ и отметкой на уровне 100 см³.

П р и м с ч а н и е — При необходимости определяют массовую долю азота в субстрате с помощью микрометола Късльдаля. Ожидаемая массовая доля азота составляет 17.7 %.

В колбу с субстратом вносят небольшое количество разведенной соляной кислоты, с (IICI) = = 0.06 моль/дм³. подсоединяют колбу к вакуумному насосу и перемешивают содержимое до полного растворения гемоглобина. Посте этого спускают вакуум и, при постоянном перемешивании, добавляют в колбу разведенную соляную кислоту той же молярной концентрации до отметки на уровне 100 см³.

Раствор готовят непосредственно перед использованием;

стандартный раствор тирозина молярной концентрации с (GjIlnNOO = 0.2 ммоль/дм³.

Для приготовления основного раствора в мерной колбе вместимостью 1 дм³ растворяют 181,2 мг тирозина в разведенной соляной кислоте, с (IICI) ■ 0,06 моль/дм³. доводят сю объем содержимого в колбе до метки.

20 см³ основного раствора переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем содержимого в колбе до метки разведенной соляной кислотой, с (I1CI) ■ 0,06 моль/дм'.

Молярная концентрация тирозина в приготовленном стандартном растворе составляет 0,2 мкмоль/см³ (0,2 ммоль/дм³).

А.5 Оборудование

Используют обычное лабораторное оборудование: водяную баню для поддержания температуры (25±1) *С;

58

ГОСТ Р 51423-99

спектрофотометр для проведения измерений при длине волны 750 нм;

хронометр для измерения времени с точностью до 1 с;

pH-метр для измерения pH с точностью до 0.1 единицы;

стеклянную палочку, один конец которой толще другого.

Д.6 Проведение испытания

Л.6.1 Приготовление раствора пепсина

Навеску пепсина массой 150 мг (или массу, необходимую для получения оппшсской плотности 0.35±0.035) растворяют в 100 см³ разведенной соляной кислоты, с (НС1) = 0.06 моль/дм³.

2 см³ приготовленного раствора переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 50 см³ и доводят объем содержимою в колбе разведенной соляной кислотой, с (НС1) = 0.025 моль/дм³, до метки. Значение pH приготовленного раствора должно быть 1.6±0.1.

Колбу с раствором пофужают в полян) к» баню температурой 25 ‘С.

Л.6.2 Гидролиз

В пробирку с помощью пипетки переносят 5.0 см³ раствора гемоглобина и нагревают на водяной бане до 25 *С. В пробирку вносят 1.0 см³ раствора пепсина; содержимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой, совершая около 10 возвратно-поступательных движений. Пробирку выдерживают на водяной бане при (25±1)*С в течение 10 мин ± 1 с, отсчитывая время с момента внесения раствора пепсина. Необходимо точно соблюдать продолжительность и температуру инкубации. По окончании инкубации в пробирку добавляют

10.0    см³ раствора грихлоруксусной кислоты, предварительно подогретого до (25±1) ‘С. содержимое пробирки перемешивают и фильтруют через сухую фильтровальную бумагу.

Л.6.3 Проведение цветной реакции и измерение оптической плотности

5.0    см³ фильтрата переносят пипеткой в коническую колбу вместимостью 50 см'. В колбу добавляют

10.0    см³ раствора гидроксида натрия и. при постоянном перемешивании. 3.0 см³ разбавленного реактива Фолина—Сиокалто. Через 5—10 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 750 нм в кювете рабочей длиной 1 см. В качестве раствора сравнения используют волу.

Л.6.4 Контрольное испытание

Контрольное испытание проводят при каждом определении.

5.0    см³ раствора гемоглобина переносят пипеткой в пробирку, подогревают на водяной бане до (25±1) *С. добавляют 10.0 см³ раствора трихлоруксусной кислоты, предварительно подогретого до (25±1) ’С. Содержимое пробирки перемешивают и вносят 1.0 см' раствора пепсина. Раствор в пробирке перемешивают стеклянной палочкой. Пробирку выдерживают на водяной бане при температуре (25±1)’С в течение 10 мин ±1 с. после чего раствор фильтруют через сухую фильтровальную бумагу. Дальнейшее испытание выполняют но А.6.3.

Л.6.5 Построение |радуировочного (рафика

В шесть конических колб вместимостью 50 см' помещают 0; 1.0; 2.0; 3.0; 4.0 и 5.0 см³ стандартного раствора тирозина, что соответствует 0; 0.2; 0.4; 0.6; 0,8 и 1.0 мкмоль тирозина. В колбы лобааляют разведенную соляную кислоту, с (НО) = 0.2 моль/дм³. в таком количестве, чтобы объем содержимого в каждой колбе составил 5.0 см³.

В каждую колбу вносят по 10.0 см' раствора гидроксила натрия и. при постоянном перемешивании.

3.0    см' разбавленного реактива Фолина—Сиокалто. Измеряют оптическую плотность растворов в соответствии с А.6.3.

Строят фалуироночный график зависимости оптической плотности от массы тирозина в микромолях.

Д.7 Обработка результатов

По градуировочному графику определяют массу тирозина в микромолях, соответствующую оптической плотности окрашенного раствора, скорректированной с результатом контрольного испытания.

Активность пепсина а. мкмоль/г в минуту при (25±1)*С, рассчитывают по <|юрмуле

_а = ИЛ    (А.    I)

т I ’

где « — масса тирозина, найденная по градуировочному графику, мкмоль; т — масса пепсина, взятая в А.6.1. мг,

/ — продолжительность реакции, мин (/ ■ 10 мин).

Примечание — Две единицы активности пепсина на миллиграмм, полученные настоящим методом, соответствуют 3.64 миллиединнцам Ансона на миллиграмм (в микромолях тирозина на миллифамм в минуту при 35.5 ’С) или 36400 коммерческим единицам на грамм (в микромолях тирозина на грамм за 10 мин при

35.5 *С).

ПРИЛОЖЕНИЕ Б (справочное)

Результаты межлабораторного испытания

Точность настоящего метода установлена в результате межлабораторного испытания, проведенного на международном уровне ИСО/ТК 34/ПК 10. В этом испытании принимали участие 19 лабораторий, каждая из которых провела по три параллельных определения шести образцов.

Табл и на Б. 1

Параметр Мука люцерны Кукурузный кормовой плотен Кокосовая мука Травяной силос Костная мука Перьевая мука Количество лабораторий, оставшихся посте исключения выпавших лабораторий 17 18 17 18 15 17 Среднее значение массовой доли растворимого азота, г/кг сухого продукта 136,6 141,5 149,5 192.9 512.0 574.3 Стандартное отклонение сходимости S„ г/кг 2,5 3.1 2,6 2.8 3.2 7,8 Коэффициент вариации сходимости. % 1,8 2.2 1.7 1,4 0.6 1.4 Предел сходимости г (г ■ 2,8 S,). г/кг 7.2 8.9 7.4 7.9 8.9 22.1 Стандартное отклонение воспроизводимости .5*. г/кг 9.4 10.2 11.2 12.8 22.3 58.8 Коэффициент вариации воспроизводимости. % 6.8 7.2 7.5 6.6 4.4 10.2 Предел воспроизводимости R (R - 2,8 ,5д), г/кг 26.5 28.9 31.6 36,3 63.1 166,3

ПРИЛОЖЕНИЕ В (справочное)

Библиография

|1| ИСО 6497 Корма для животных. Методы отбор;! проб

ОКС 65.120    CI9    ОКСТУ    9209.

9709

Ключевые слова: корма, комбикорма, комбикормовое сырье, растворимый азот, пепсин, соляная кислота