Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз) к антибактериальным препаратам

Методические указания МУК 4.2.2495—09

Издание официальное

Москва • 2010

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз) к антибактериальным препаратам

Методические указания МУК 4.2.2495—09

МУК 4.2.2495—09

вызванной микроорганизмом, относящимся к этой категории, обычно эффективно;

•    промежуточный - МПК АБП в отношении штаммов этой категории выше, чем в отношении чувствительных, но находится в пределах, достигаемых при максимально допустимых режимах дозирования. Лечение инфекции, вызванной микроорганизмом, относящимся к этой категории, может быть эффективным при применении АБП в повышенных дозах, однако не исключен отбор вариантов возбудителя, характеризующегося более высоким значением МПК, сопровождающегося отсутствием эффекта антибиотикотерапии;

•    устойчивый - штамм не подавляется при концентрациях АБП, создающихся в органах и тканях при рекомендуемых режимах дозирования. Использование АБП, к которому культура микроорганизмов устойчива, недопустимо.

Основным количественным показателем, характеризующим микробиологическую активность АБП, является значение МПК, которое может быть получено при использовании МСР. Для определения МПК заданные концентрации АБП вносят в питательную среду. Питательную среду с двукратно увеличивающимися концентрациями АБП засевают исследуемой культурой микроорганизма, посевы инкубируют при оптимальной для данного вида возбудителя температуре в течение 18—48 ч и затем оценивают наличие или отсутствие видимого роста.

Для получения антибиотикограммы микроорганизмов ДДМ используют стандартизированные условия (состав и количество среды, количество засеваемых микробных клеток, температура и сроки инкубирования, стандартные диски). В определенных пределах величина диаметра зоны подавления роста обратно пропорциональна МПК, т. к. существует линейная связь между логарифмом МПК, измеренной при использовании МСР, и диаметром зоны задержки роста при использовании ДДМ.

Для окончательной характеристики чувствительности/устойчивости культур необходимо использовать МСР АБП в плотной питательной среде для получения наиболее достоверных результатов и адекватного выбора средств специальной экстренной профилактики и этиотропной терапии эпидемически опасных инфекционных заболеваний бактериальной природы.

Необходима строгая стандартизация процедуры определения антибиотикограммы, внедрение внутреннего контроля качества на всех эта-

МУК 4.2.2495—09

пах исследования, использование критериев интерпретации результатов для каждого вида возбудителя ООИ.

5.2. Выбор контрольных штаммов

Выбор референтных (контрольных) штаммов определяется видом тестируемого микроорганизма. В качестве контрольных тест-штаммов используют типичные штаммы с хорошо изученными фенотипическими характеристиками, включая чувствительность к АБП, отличающиеся генетической стабильностью. К таковым относятся вакцинные штаммы Yersinia pestis EV НИИЭГ, Francisella tularensis 15, Brucella abortus 19BA, Bacillus anthracis СТИ, а также Vibrio cholerae non 01 KM 162 (P9741), депонированный в качестве референтного антибиотикочувствительного тест-штамма в ГК ПБ РосНИПЧИ «Микроб», типичные штаммы буркхольдерий - Burkholderia mallei NCTC 10230 и Burkholderia pseudomallei CIP 6086. Контрольные штаммы, соответствующие каждому виду возбудителей ООИ, используют на этапах предварительного изучения качества питательных сред, применяемых при определении антибиотикочувствительности, контроля активности дисков с антибиотиками и АБП для их последующего использования в случае эпидемических осложнений (МУ 3.4.1030—01).

Для внутреннего контроля качества определения антибиотико-граммы используют также эталонные референс-штаммы Escherichia coli АТСС 25922 (для возбудителей чумы, туляремии, бруцеллеза, холеры); Staphylococcus aureus АТСС 25923 (для возбудителя сибирской язвы); Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 (для возбудителей сапа и мелиоидоза).

Допустимые колебания значений МПК АБП и диаметров зон инги-биции роста всех вышеперечисленных контрольных штаммов на используемых для каждого вида возбудителя питательных средах представлены в таблицах соответствующих разделов документа.

Для сохранения свойств и чистоты контрольные штаммы необходимо хранить в лиофилизированном состоянии. «Рабочие» культуры хранят в пробирках на скошенном агаре или в столбиках агара, оптимального для роста каждого вида микроорганизма, при 2—8 °С с еженедельным пересевом. Исключением является контрольный штамм Vibrio cholerae non Ol KM 162 (P-9741), который хранится в 0,3 %-м полужидком агаре при 18—20 °С. Перед использованием для контроля качества определения антибиотикограммы референтный штамм двукратно пересевается.

11

МУК 4.2.2495—09

53. Выбор питательных сред Для оценки чувствительности микроорганизмов к АБП используют питательные среды, разрешенные к применению в Российской Федерации, в соответствии с биологическими особенностями каждого вида изучаемого микроорганизма (прилож. 1). Стандартной средой является агар Мюллера-Хинтона (Muller-Hinton).

Каждую партию питательных сред проверяют с использованием контрольного штамма на ростовые качества для тестируемого микроорганизма (рост при высеве на чашки с агаром - не менее 30 % КОЕ), а также на соответствие рекомендуемого pH с помощью pH-метра. Последнее связано с изменением активности аминогликозидов, макролидов, тетрациклинов в зависимости от pH питательной среды.

Выбранную питательную среду промышленного производства готовят в колбах в строгом соответствии с инструкцией изготовителя, затем разливают в градуированные бутылки емкостью 250 мл и автоклавируют. Остуженный до 48—50 °С агар (при необходимости в него добавляют стерильные термолабильные добавки или растворы АБП) разливают в чашки Петри.

Агар разливают по 25 мл в чашки диаметром 100 мм и по 20 мл в чашки диаметром 90 мм с тем, чтобы толщина агара составляла (4 ± 0,5) мм. Чашки оставляют для застывания при комнатной температуре. Для приготовления чашек с агаром требуется горизонтальная поверхность. Чашки после подсушивания при комнатной темдературе лучше использовать немедленно, однако возможно их приготовление за 24 ч до использования при условии хранения при 4—8 °С. Допускается подсушивание при 37 °С в течение 15 мин перевернутых вверх дном чашек в термостате, предварительно обработанном 70°-м спиртом.

5.4. Требования к культуре, используемой для инокуляции Исследование на чувствительность культур микроорганизмов к АБП проводится одновременно с их индикацией и/или идентификацией.

Необходимо использовать только чистые культуры бактерий или (при проведении специфической индикации) материал из 2—3-х изолированных морфологически типичных колоний возбудителя в первичном посеве пробы клинического материала от больного при выраженной симптоматике инфекции (например, водянистый стул у больных с алгидной формой холеры обычно содержит чистую культуру V cholerae, так же как и пунктат из чумного бубона и т. д.).

МУК 4.2.2495—09

Суспензию микроорганизмов готовят из агаровой культуры, выращенной на неселективной питательной среде при соответствующей температуре (28, 37 °С), оптимальной для роста данного вида бактерий. Стандартизацию суспензии проводят по оптическому стандарту мутности (ОСО) ГИСК им. Л. А. Тарасевича на 5—10 ед., что соответствует п х 10⁸—10⁹ КОЕ/мл в зависимости от вида возбудителя. ОСО приведен в соответствие с международным стандартом мутности. Инокулюм следует использовать в течение 15 мин после приготовления.

5.5. Выбор антибактериальных препаратов

В соответствии с нормативной документацией средствами общей экстренной профилактики инфекции бактериальной природы (до определения вида возбудителя) являются доксициклин (тетрациклин), ци-профлоксацин (офлоксацин, пефлоксацин), рифампицин и тримето-прим/сульфамонометоксин (торговое название - сульфатон) или триме-топрим/сульфаметоксазол (бисептол, ко-тримоксазол и др.).

Специальная экстренная профилактика и этиотропная терапия инфекции проводится уже в соответствии с установленной антибиотико-граммой возбудителя, включающей данные о чувствительности к антибактериальным препаратам I и II групп.

К АБП I группы относят антибиотики, наиболее эффективные при данной инфекции, вызванной антибиотикочувствительными типичными штаммами возбудителя. Чувствительность к этим препаратам определяют в первую очередь для обоснования специальной экстренной профилактики и этиотропной терапии инфекции. В число таких АБП обычно включены и препараты, используемые для целей общей экстренной профилактики.

К дополнительным (II группа) АБП относят антибиотики, которые могут быть альтернативой препаратам I группы в случае регистрации к ним устойчивости, а также использоваться для получения антибиотико-грамм выделенных штаммов возбудителя в рамках эпидемиологического надзора за чувствительностью определенного вида микроорганизма.

При составлении наборов АБП в настоящем документе учтены закономерности перекрестной резистентности бактерий к различным представителям одной группы. Так, для определения чувствительности к фторхинолонам достаточно воспользоваться только ципрофлоксацином (или офлоксацином, или пефлоксацином и др.); к цефалоспоринам III поколения - цефтриаксоном (или цефотаксимом, или цефтазидимом).

13

МУК 4.2.2495—09

Партии АБП, используемые для осуществления общей, специальной экстренной профилактики и этиотропной терапии опасных инфекционных заболеваний, должны быть предварительно изучены на соответствие заявленной и фактической антибактериальной активности методом серийных разведений препаратов в плотной питательной среде (среда Мюллера-Хинтона) с использованием референс-штаммов.

5.6. Интерпретация результатов исследования

Интерпретация результатов оценки антибиотикочувствительности микроорганизма к АБП заключается в отнесении его к одной из трех категорий: чувствительный, промежуточный, устойчивый в соответствии с критериями, разработанными для данного вида бактерий. Интерпретация проводится путем сопоставления величин МПК и (или) диаметров зон ингибиции роста, полученных в результате исследования, с пограничными значениями этих параметров для чувствительных, промежуточных и устойчивых культур изучаемого вида возбудителя.

Приведенные в МУК 4.2.1890—04 критерии интерпретации результатов определения чувствительности микроорганизмов III—IV групп патогенности к АБП разработаны на основе микробиологических, фармакокинетических, фармакодинамических факторов и клинических наблюдений. В настоящем документе проведена адаптация этих критериев к интерпретации результатов определения антибиотикограмм возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии, холеры, бруцеллеза, сапа и мелиоидоза. Изменение пограничных значений МПК и диаметров зон ингибиции роста бактерий для некоторых АБП явилось результатом сравнительного изучения данных in vitro, эффективности in vivo (экспериментальные модели инфекций), диапазонов значений МПК и диаметров зон ингибиции роста для 20—75 штаммов каждого вида микроорганизма, а также клинических наблюдений в практике противочумных учреждений и анализа данных современной отечественной и зарубежной литературы.

Клинически ориентированные категории чувствительности и устойчивости бактерий к АБП не всегда коррелируют с микробиологическими, в связи с чем необходим бактериологический контроль эффективности этиотропной терапии инфекции у каждого пациента даже в случае улучшения симптоматики заболевания (через 2—3 сут. на фоне лечения).

МУК 4.2,2495—09

5.7. Метод серийных разведений в агаре

Важным этапом МСР является приготовление растворов АБП.

Растворы с высокими концентрациями препаратов (100000—10 000— 1 000 мг/л) являются основными и могут храниться при 2—8 °С в течение недели. Исключением являются растворы тетрациклинов, беталактамов, фуразолидона, сульфаниламидов, которые необходимо использовать ex tempore для внесения в питательные среды в необходимых концентрациях.

Для приготовления основных растворов используют субстанции АБП с известной активностью. При отсутствии субстанций в экстренных случаях допускается использование препаратов в виде мелкодисперсных порошков, инъекционных форм препаратов. АБП взвешивают на электронных лабораторных весах с точностью до 4-го знака. Объём растворителя должен соответствовать количеству активного вещества в навеске. Расчет навески АБП для приготовления основного раствора проводят по формуле:

т АБ_теор -расчетная (теоретическая) навеска АПБ, мг;

С - необходимая концентрация АПБ, мкг/мл;

Умор, - объем растворителя для растворения теоретической навески, мл;

А - активность АПБ (количество активного вещества, содержащегося в субстанции), мкг/мг.

Взвесить точно расчетное количество порошка практически невозможно. Поэтому готовят близкую к расчетной навеску, а затем пересчитывают количество необходимого растворителя.

xF (лм)

-—---.где

тАБ^мг)

Кракп - объем растворителя для растворения практической навески, мл; т АБ_практ, - полученная навеска АПБ, мг; т АБ_те0Р' - расчетная (теоретическая) навеска АПБ, мг;

Vmeop - объем растворителя для растворения теоретической навески, мл; Различия в растворимости АБП определяют необходимость использования растворителей (солюбилизаторов) в минимальном объеме и необходимого количества разбавителя (дистиллированная вода). Для растворения тетрациклинов, рифампицина, фуразолидона используют димексид, левомицетин растворяют в 96°-м спирте. Приготовление ос-

15

МУК 4.2.2495—09

новных растворов налидиксовой кислоты и фторхинолонов проводят в 7₂ от необходимого объема дистиллированной воды добавлением по капле 0,1 М КОН до полного растворения препаратов с последующим доведением растворителя до расчетного объема. Растворителем и разбавителем для других АБП служит дистиллированная вода.

Для измерения объёмов растворов антибиотиков используют калиброванные дозаторы и пипетки.

Рабочие растворы АБП готовят на дистиллированной воде в концентрациях, необходимых для внесения в расплавленный и остуженный (до 48—50 °С) агар (20 мл на одну чашку Петри) для создания в нём двукратно увеличивающихся концентраций (например: 1—2—4—8— 16—32 мг/л) препарата в соответствии с пограничными значениями МПК для чувствительных и устойчивых штаммов данного вида микроорганизма. В зависимости от необходимого количества чашек Петри с каждой из концентраций АБП используют мерные широкогорлые флаконы на 50—100 мл, в которые наливают агар в объёме 20—40 мл и т. д. и добавляют раствор АБП (начиная с наименьшей концентрации), интенсивно размешивают и выливают в чашки Петри, на которых указана концентрация АБП. Контролем служит агаровая чашка без АБП. После застывания агара в чашках и их подсушивания на дне чашки делают надписи: дата посева, вид возбудителя, номер исследуемых культур.

Испытуемые суспензии культур наносят на поверхность питательного агара без АПБ (контроль) и с АБП (начиная с наименьшей концентрации) каплями легким касанием пипетки (~ 0,005 мл) или с помощью штампа-репликатора (- 0,001 мл). Одновременно можно изучать до 25— 50 культур, обязательно включая контрольные референс-штаммы, что обеспечивает достоверность данных антибиотикограммы.

После полного впитывания капель суспензий в агар чашки переворачивают вверх дном и инкубируют при оптимальной для данного возбудителя температуре (28, 37 °С) в течение 18—48 ч. Учёт результатов проводят после появления роста тестируемых культур на агаре без АБП и при условии, что значения МПК для контрольных штаммов укладываются в рекомендуемый диапазон значений этого показателя для испытуемых АПБ (таблицы в соответствующих разделах). Минимальная подавляющая концентрация (МПК) - это концентрация АБП в агаре, которая полностью подавляет рост культуры. По значению МПК исследуемая культура может быть отнесена к чувствительной, промежуточной, устойчивой в соответствии с критериями для изучаемого вида возбудителя (таблицы в соответствующих разделах).

МУК 4.2.2495—09

5.8, Диско-диффузионный метод

Проверенный на пригодность с использованием эталонных антибиотикочувствительных штаммов питательный агар (приготовленный, расплавленный, остуженный, как указано ранее) разливают в чашки Петри, установленные на строго горизонтальной поверхности, в объеме 20 мл на чашку диаметром 90 мм, 25 мл - на чашку диаметром 100 мм, 60 мл - на чашку диаметром 150 мм. Толщина слоя агара должна составлять строго (4 ± 0,5) мм. Эти требования следует выполнять обязательно, т. к. зоны ингибиции роста зависят от глубины и равномерности агарового слоя.

Перед использованием свежеприготовленных чашек или после хранения в холодильнике (7—10 сут. в запаянных полиэтиленовых пакетах) их необходимо подсушить при 37 °С (в течение 15 мин).

При определении чувствительности культур микроорганизмов с помощью ДЦМ необходимо использовать только стандартизированные качественные диски производственного изготовления.

Каждую серию дисков с АПБ контролируют с помощью референс-штаммов на соответствие заявленным концентрациям на питательной среде, прошедшей контроль качества. Диски, дающие диаметры зон ингибиции роста большие, чем допустимый диапазон значений для рефе-ренс-культуры, выбраковываются, т. к. их использование может привести к отнесению антибиотикорезистентных штаммов к разряду чувствительных.

Проверенные на пригодность серии дисков с АПБ хранятся до истечения срока годности в герметичной упаковке при - 18 °С и ниже. Используемые в работе диски можно хранить в холодильнике (4—8 °С). Картриджи должны быть плотно упакованными, чтобы не допустить попадания в них влаги. Флаконы с дисками (картриджи) следует извлекать из холодильника за 1 ч до начала работы и открывать только по достижении ими комнатной температуры, предотвращая тем самым образование конденсата влаги на дисках после открывания картриджа.

Бактериальную суспензию необходимой концентрации наносят на агаровую чашку Петри в объеме 0,2—0,3 мл я распределяют равномерно по поверхности с помощью стерильного шпателя. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10—15 мин и затем наносят диски (не более 6 на чашку). Диски наносят стерильным пинцетом и слегка придавливают. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно составлять 15—20 мм.

17

МУК 4.2.2495—09

Чашки с посевом без дисков (контроль роста культуры) и с дисками инкубируют вверх дном 18—48 ч при температуре, оптимальной для роста изучаемого вида возбудителя (28, 37 °С). Параллельно с тестируемыми культурами необходимо проводить внутренний контроль качества исследования - определение чувствительности референс-штамма к используемым АПБ. Учет результатов проводится только при наличии сливного роста культуры на чашках без дисков и соответствия величин зон ингибиции роста контрольных штаммов значениям, приведенным в соответствующих таблицах. Измерение диаметров зон полного подавления видимого роста производят кронциркулем, штангенциркулем, с помощью линейки-лекало (с точностью до 1 мм) на чашках, помещенных кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом 45°.

Появление колоний в зоне задержки роста микроорганизмов может свидетельствовать или о загрязнении культуры посторонней микрофлорой или о гетерогенности тестируемой культуры по признаку чувстви-тельности/устойчивости к данному антибиотику. И в одном, и в другом случае исследование необходимо повторить с изучением чувствительности к АБП культур из колоний (если это не загрязнение), выросших в пределах диаметра зоны ингибиции роста. Интерпретацию результатов исследования следует провести с использованием таблиц, в которых даны пограничные значения диаметров зон ингибиции роста исследуемого микроорганизма конкретным АБП (разделы 6, 7, 8,9» 10, 11).

В паспорт каждой выделенной культуры необходимо вносить не только значения МПК, диаметров зон задержки роста, но и интерпретацию результатов исследований: штамм чувствительный, промежуточный или устойчивый.

6. Определение чувствительности чумного микроба (Yersinia pestis) к антибактериальным препаратам

6J. Контрольные штаммы

Для стандартизации определения антибиотикограммы возбудителя чумы в качестве контрольных штаммов могут быть использованы:

1)    вакцинный штамм чумного микроба - Yersinia pestis EV НИИЭГ, чувствительный к антибактериальным препаратам;

2)    референс-штамм Escherichia coli АТСС 25922, рекомендованный для определения антибиотикочувствительности бактерий семейства Enterobacteriaceae₉ к которому относится и возбудитель чумы.

МУК 4.2.2495—09

6. 2т Питательные среды

Для определения чувствительности чумного микроба к антибактериальным препаратам МСР и ДЦМ могут быть использованы:

1)    агар Мюллера-Хинтона (Muller-Hinton) pH 7,3 ± 0,2;

2)    агар Хоттингера pH 7,2 ± 0,1 (1,2—1,4 г/л аминного азота).

Для ДДМ дополнительно можно использовать агар Гивенталя-Ведьминой (АГВ) pH 7,4 ± 0,2.

Каждая серия питательного агара перед использованием для определения антибиотикограммы возбудителя чумы должна быть проверена с использованием контрольных штаммов и АБП. Допустимые колебания значений МПК и диаметров зон ингибиции роста для контрольных штаммов представлены в табл. 6.1 и 6.2.

6.3. Антибактериальные препараты Для определения антибиотикограммы чумного микроба, выделенного в природном очаге чумы или от больного, используют антибактериальные препараты, рекомендованные МУ 3.4.1030—01 для экстренной профилактики и лечения этой инфекции.

Для МСР в плотной питательной среде выбирают серии двукратно увеличивающихся концентраций антибактериальных препаратов в соответствии с пограничными значениями МПК для чувствительных и устойчивых культур чумного микроба.

Препараты первого ряда:

Стрептомицин 4—8—16—32—64 мг/л Амикацин 4—8—16—32—64 мг/л Гентамицин 2—4—8—16 мг/л Доксициклин 2—А—8—16 мг/л

Ципрофлоксацин (или офлоксацин, пефлоксацин, ломефлоксацин, левофлоксацин) 0,06—0,125—0,25—0,5—1,0 мг/л

Цефтриаксон (или цефотаксим) 0,5—1—2—4 мг/л Рифампицин 2—4—8—16—32 мг/л

Триметоприм/сульфаметоксазол 1—2—4—8 мг/л (по триметоприму) Препараты второго ряда:

Канамицин 4—8—16—32—64 мг/л Нетилмицин 2—А—8—16 мг/л Тобрамицин 4—8—16—32 мг/л Тетрациклин 2—4—8—16 мг/л Ампициллин 4—8—16—32 мг/л

Цефтазидим (или цефтибутен, цефиксим, цефепим) 0,5—1—2—4 мг/л

19

ББК51.9

060

060 Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз) к антибактериальным препаратам: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010.—59 с.

ISBN 978—5—7508—0891—5

1.    Разработаны ФГУЗ Ростовски й-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт (И. В. Рыжко, Н. В. Павлович, Ю. М. Ломов,

А. И. Щербанюк, Р. И. Цураева, А. В. Тришина, М. В. Цимбалистова, И. Я. Черепахина, Л, М. Смоликова); ФГУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт (С. В. Балахонов, С. А. Белькова, Е. Г. Токмакова, Е. Г. Горячкина); ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт (В. И. Илюхин, Н. В. Андропова, Т. В. Семина,

Е. В. Калинкина, М. Н. Трушкина); ФГУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт (Л. Ю. Аксенова, Н. П. Буравцева,

Е. И. Еременко, А. Г. Рязанова, Е. А. Цыганкова, Г. И. Лямкин, Л. В. Лапус-тина, Д. В. Русанова, С. В. Вилинская, С. И. Головнева); ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (С. А. Щербакова, Е. С. Казакова, И. Н. Шарова); ФГУЗ Противочумный центр Роспотребнадзора (В. Е. Безсмертный, С. М. Иванова, Г. В. Титов); Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е. Б. Ежлова, Н. Д. Пакскина).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 марта 2009 г. № 1).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 1 апреля 2009 г,

4.    Введены в действие с 1 июня 2009 г.

5.    Введены взамен «Инструкции по определению чувствительности возбудителей опасных инфекционных заболеваний к антибиотикам и химиопрепаратам», утвержденной Минздравом СССР от 7 февраля 1989 г.

ББК51.9

€> Роспотребнадзор, 2010 О Федеральный центр гигиены н эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010

Азтреонам 0,5—1—2—4—8 мг/л Налидиксовая кислота 4—8—16—32 мг/л Левомицетин 2—4—8—16 мг/л

Налидиксовая кислота не рекомендуется для экстренной профилактики и лечения чумы, однако устойчивость чумного микроба к этому препарату может сопровождаться снижением эффективности фторхино-лонов при сохранении к ним чувствительности in vitro.

С целью экономии времени и средств для проведения исследования МСР могут применяться штампы-репликаторы, позволяющие изучить антибиотикограммы 25—50-ти штаммов одновременно с введением в исследование контрольного антибиотикочувствительного штамма, что повышает достоверность получаемых результатов.

Для постановки ДДМ используют проверенные (на предварительно прошедшей контроль серии питательной среды) коммерческие диски с определенными концентрациями АБП (табл. 6.2).

6.4. Посевная доза, инокуляция, инкубация При определении чувствительности возбудителя чумы к антибактериальным препаратам с помощью ДДМ используют суспензию микробных клеток из суточной агаровой культуры в 0,85 % изотоническом растворе хлорида натрия, стандартизированную по отраслевому стандарту мутности ГИСК им. Л. А. Тарасевича на 5 ед. - 5 х 10⁸ м. к. (~ 1,5 х 10⁸ КОЕ/мл). Суспензию наносят на поверхность агара в объеме 0,2 мл(пх10⁷ КОЕ), равномерно распределяют стерильным шпателем. Через 10—15 мин накладывают диски (не более шести на чашку диаметром 100 мм). Посевы инкубируют при 28 °С. Предварительный учет проводят через 24 ч, окончательный - через 48 ч. Результаты учитывают при появлении сливного роста на контрольных чашках (без дисков). Диаметры зон задержки роста культуры вокруг дисков, включая диаметр самого диска, измеряют с точностью до 1 мм штангенциркулем, кронциркулем или специальной линейкой-лекало.

Для МСР используют суспензию той же концентрации 5 х 10⁸ м. к. (—1,5 х Ю⁸ КОЕ/мл), нанося небольшими каплями с помощью штампа-репликатора или касанием пипетки с тонким концом на чашки с питательной средой, содержащей различные концентрации антибактериальных препаратов, начиная с чашек, содержащих минимальное количество антибиотиков. Посевная доза - n х Ю⁵—10⁶ КОЕ. Посевы инкубируют при температуре 28 °С. Учет через 36—48 ч. Чувствительность/устой-чивость культур определяют по минимальной концентрации препарата,

МУК 4.2.2495—09

Содержание

1.    Область применения...............................................................................................5

2.    Нормативные и методические документы............................................................6

3.    Общие сведения......................................................................................................7

4.    Обоснование для исследования чувствительности всех выделенных

культур возбудителей ООИ к антибактериальным препаратам........................8

5.    Методы определения чувствительности возбудителей ООИ к

антибактериальным препаратам............................................................................9

5.1.    Общая характеристика методов.....................................................................9

5.2.    Выбор контрольных штаммов......................................................................11

5.3.    Выбор питательных сред..............................................................................12

5.4.    Требования к культуре, используемой для инокуляции.............................12

5.5.    Выбор антибактериальных препаратов.......................................................13

5.6.    Интерпретация результатов исследования..................................................14

5.7.    Метод серийных разведений в агаре............................................................15

5.8.    Диско-диффузионный метод........................................................................17

6.    Определение чувствительности чумного микроба (Yersiniapestis) к

антибактериальным препаратам..........................................................................18

6.1.    Контрольные штаммы...................................................................................18

6.2.    Питательные среды.......................................................................................19

6.3.    Антибактериальные препараты....................................................................19

6.4.    Посевная доза, инокуляция, инкубация.......................................................20

6.5.    Критерии оценки чувствительности/устойчивости чумного микроба к

антибактериальным препаратам..........................................................................21

7.    Определение чувствительности возбудителя сибирской язвы (Bacillus

anthracis) к антибактериальным препаратам......................................................25

7.1.    Контрольные штаммы...................................................................................25

7.2.    Питательные среды.......................................................................................26

7.3.    Антибактериальные препараты....................................................................26

7.4.    Посевная доза, инокуляция, инкубация.......................................................27

7.5.    Критерии оценки чувствительности/устойчивости сибиреязвенного

микроба к антибактериальным препаратам.......................................................27

8.    Определение чувствительности холерного вибриона (Vibrio cholerae) к

антибактериальным препаратам..........................................................................32

8.1.    Контрольные штаммы...................................................................................32

8.2.    Питательные среды.......................................................................................32

8.3.    Антибактериальные препараты....................................................................32

8.4.    Посевная доза, инокуляция, инкубация.......................................................34

8.5.    Критерии оценки чувствительности/устойчивости холерного вибриона

к антибактериальным препаратам.......................................................................34

9.    Определение чувствительности туляремииного микроба (Francisella

tularensis) к антибактериальным препаратам.....................................................39

3

9.1.    Контрольные штаммы...................................................................................39

9.2.    Питательные среды.......................................................................................39

9.3.    Антибактериальные препараты....................................................................40

9.4.    Посевная доза, инокуляция, инкубация.......................................................41

9.5.    Критерии оценки чувствительности/устойчивости туляремийного

микроба к антибактериальным препаратам.......................................................41

10.    Определение чувствительности бруцелл {Brucella spp.) к

антибактериальным препаратам..........................................................................45

10.1.    Контрольные штаммы.................................................................................45

10.2.    Питательные среды......................................................................................45

10.3.    Антибактериальные препараты..................................................................46

10.4.    Посевная доза, инокуляция, инкубация....................................................47

10.5.    Критерии оценки чувствительности/устойчивости возбудителя

бруцеллеза к антибактериальным препаратам...................................................48

11.    Определение чувствительности возбудителей сапа и мелиоидоза

{Burkholderia mallei u Burkholderiapseudomallei) к антибактериальным препаратам............................................................................................................51

11.1.    Контрольные штаммы.................................................................................51

11.2.    Питательные среды......................................................................................51

11.3.    Антибактериальные препараты..................................................................52

11.4.    Посевная доза, инокуляция, инкубация.....................................................53

11.5.    Критерии оценки чувствительности/устойчивости возбудителей сапа и

мелиоидоза к антибактериальным препаратам..................................................54

Приложение. Питательные среды для определения чувствительности возбудителей особо опасных инфекций бактериальной природы к

антибактериальным препаратам..........................................................................58

Список сокращений..................................................................................................59

4

МУК 4.2.2495—09

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

1 апреля 2009 г.

Дата введения: 1 июня 2009 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз) к антибактериальным препаратам

Методические указания МУК 4.2.2495—09

1. Область применения

В настоящих методических указаниях изложены стандартизированные методы определения чувствительности возбудителей особо опасных инфекций (ООН) бактериальной природы к антибактериальным препаратам (АБП) методом серийных разведений (МСР), дискодиффузионным методом (ДДМ) и критерии интерпретации результатов с учетом биологических особенностей каждого вида микроорганизма.

Методические указания предназначены для лабораторий, имеющих разрешение на работу с возбудителями опасных инфекционных болезней I—II и II—IV групп патогенности, противочумных станций, противочумных институтов и специализированных противоэпидемическшс бригад (СПЭБ) ФГУЗ противочумных институтов.

В лабораториях Центров индикации и диагностики возбудителей особо опасных инфекционных болезней, Референс-центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней и Национальных центров верификации диагностической деятельности (в соответствии с приказом Роспотребнадзора от 17.03.08 № 88) выполняют исследования по

МУК 4.2.2495—09

определению антибиотикочувствительности/устойчивости микроорганизмов I—II групп патогенности с использованием метода серийных разведений и диско-диффузионного метода. В лабораториях ФГУЗ ЦГиЭ, СПЭБ, противочумных станций допускается применение только диско-диффузионного метода.

2* Нормативные и методические документы

1.    Федеральный закон Российской Федерации «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 30 марта 1999 г. № 52-ФЗ.

2.    Международные медико-санитарные правила. ВОЗ, 2005.

3.    СП 1.2.1285—03 «Безопасность работы с микроорганизмами I— II групп патогенности (опасности)».

4.    СП 1.2.1318—03 «Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I—IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами».

5.    СП 3.4.2318—08 «Санитарная охрана территории Российской Федерации».

6.    МУ 3.4.1030—01 «Организация, обеспечение и оценка противоэпидемической готовности медицинских учреждений к проведению мероприятий в случае завоза или возникновения особо опасных инфекций, контагиозных вирусных геморрагических лихорадок, инфекционных болезней неясной этиологии, представляющих опасность для населения Российской Федерации и международного сообщения».

7.    Приказ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 17.03.08 № 88 «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней».

8.    Специфическая индикация патогенных биологических агентов: Практическое руководство. М., 2006.

9.    СП 3.1.7.1380—03 «Профилактика чумы. Общие требования к эпидемиологическому надзору за чумой».

10. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации, 2004 г., № 7 «Об организации и проведении мероприятий по профилактике чумы».

МУК 4.2.2495—09

11.    СП 3.1.089—96 Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных: Сборник санитарных и ветеринарных правил. «Сибирская язва».

12.    СП 3.1.1086—02 «Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору за холерой».

13.    МУ 3.1.2007—05 «Эпидемиологический надзор за туляремией».

14.    МУ 4.2.2218—07 «Лабораторная диагностика холеры».

15.    МУ 3.1.7.1189—03 «Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза у людей».

16.    МУК 4.2.2413—08 «Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы».

17.    «Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза. Методические рекомендации». Волгоград, 1994.

18.    «Инструкция по определению чувствительности возбудителей опасных инфекционных заболеваний к антибиотикам и химиопрепаратам». М., 1990.

19.    МУК 4.2.1890—04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».

20.    Приказ М3 РФ от 12.08.03 № 400 «О совершенствовании организационной работы специализированных противоэпидемических бригад противочумных учреждений».

21.    Распоряжение Правительства РФ от 21.05.07 № 642-р «О модернизации специализированных противоэпидемических бригад».

3. Общие сведения

Антибиотикограмма возбудителей особо опасных инфекций бактериальной природы должна быть получена в течение срока идентификации культур, т. к. определяет выбор средств специальной экстренной профилактики и этиотропной терапии инфекции. Адекватность такого выбора зависит от стандартности и качества определения антибиотико-граммы, критериев её интерпретации, отработанных для определенного вида бактерий. Однако критерии оценки результатов определения чув-ствительности/устойчивости возбудителей особо опасных инфекций до настоящего времени предложены не были. Исследование чувствительности возбудителей ООИ к АБП должно максимально достоверно и в кратчайшие сроки обеспечить:

• выбор средств специальной экстренной профилактики и этиотропной терапии инфекции;

7

МУК 4.2.2495—09

•    обоснование необходимости смены антибактериального препарата на основе бактериологического контроля эффективности лечения у отдельного больного;

•    единые подходы к осуществлению наблюдения за распространением антибиотикорезистентности среди штаммов микроорганизмов-возбудителей ООИ;

•    оценку антибактериальной активности партий АБП, используемых для экстренной профилактики и лечения инфекций, а также новых антибиотиков, перспективных для расширения арсенала средств, применяемых для этиотропной терапии ООИ.

4. Обоснование для исследования чувствительности всех выделенных культур возбудителей ООИ к антибактериальным препаратам

Антибиотикорезистентность возбудителей различных инфекционных заболеваний является насущной проблемой как медицинской науки, так и клинической медицины. Особую опасность представляет множественная лекарственная устойчивость бактерий, чрезвычайно быстро распространяющаяся с помощью мигрирующих генетических элементов, содержащих гены лекарственной устойчивости и имеющих специализированные механизмы их передачи среди широкого круга бактерий. Некоторые микроорганизмы легко мутируют, приобретая резистентность к ряду антибиотиков (стрептомицину, рифампицину, налидиксовой кислоте и др.).

Наличие антибиотикорезистентности обнаружено у природных штаммов чумного микроба. Все чаще встречаются сообщения о выделении стрептомициноустойчивых, тетрациклиноустойчивых вариантов возбудителя. Имеются факты регистрации резистентности к рифампицину, левомицетину и снижения чувствительности к гентамицину. От людей выделены культуры с плазмидами множественной лекарственной устойчивости.

Большинство природных изолятов сибиреязвенного микроба чувствительно к АБП, однако описаны случаи выделения от больных и из других источников штаммов, устойчивых к пенициллину, амоксицилли-ну, стрептомицину, тетрациклинам, рифампицину.

Серьезным осложнением течения 7-й пандемии холеры является нарастание устойчивости возбудителя к традиционно применяемым для лечения инфекции препаратам-тетрациклинам, левомицетину, тримето-приму/сульфаметоксазолу, фуразолидону, ампициллину и др. В настоя-

МУК 4.2.2495—09

щее время от больных выделяют культуры, имеющие от 3 до 10 маркеров резистентности, в т. ч. и к фторхинолонам (ципрофлоксацину, оф-локсацину и др.).

Природная устойчивость возбудителей бруцеллеза и туляремии к р-лактамным антибиотикам, цефапоспоринам и сниженная чувствительность к химиопрепаратам возбудителей сапа и мелиоидоза затрудняет выбор АБП и их комбинаций для этиотропной терапии этих инфекций.

Экспериментально доказана возможность получения штаммов чумного, сибиреязвенного, туляремийного микробов, устойчивых к АБП, что делает вероятным использование таких вариантов в целях биотерроризма.

В процессе лечения ООН антибактериальными препаратами спектр и степень антибиотикорезистентности возбудителей может меняться, что требует смены АБП или их комбинаций.

Вышеизложенное определяет необходимость изучения антибиоти-кограммы каждой выделенной культуры, постоянного эпидемиологического надзора за чувствительностью/устойчивостью выделяемых культур возбудителей ООИ.

Стандартизированное определение антибиотикограммы возбудителя и её правильная интерпретация являются основой адекватного выбора антибиотиков для целей экстренной профилактики и лечения ООИ.

5. Методы определения чувствительности

возбудителей ООИ к антибактериальным препаратам

5.7. Общая характеристика методов

Для определения чувствительности возбудителей ООИ к АБП используют метод серийных разведений препаратов в плотной питательной среде (МСР) и диско-диффузионный метод (ДДМ).

Мерой чувствительности бактерий при использовании МСР является минимальная концентрация (МПК) АБП, подавляющая видимый рост исследуемого микроорганизма.

В соответствии с МУК 4.2.1890—04 исследуемые микроорганизмы в результате изучения их антибиотикограмм относят к одной из трех категорий:

• чувствительный - рост и размножение бактерий подавляется при концентрациях АБП, создающихся в органах и тканях человека при рекомендуемых дозах и схемах применения. Лечение инфекции,

9