Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Методы микробиологического измерения
концентрации клеток мицелиального
гриба Trichoderma longibrachiatum TW-420
ВКМ F-3880D - продуцента целлюлаз,
b-глюканазы и ксиланазы
в атмосферном воздухе населенных мест
и воздухе рабочей зоны
Сборник методических указаний
по методам контроля
МУК 4.2.3034-12; 4.2.3035-12
Москва 2012
1.
Разработаны ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский
университет им Н.И. Пирогова» Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).
2.
Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты
биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии
«Научные основы гигиены окружающей среды».
3.
Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в
сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 20 июля 2012 г.
4. Введены
впервые.
СОДЕРЖАНИЕ
1. Общие положения и область применения. 2
2. Биологическая характеристика плесневого гриба Tr. longibrachiatum TW-420 BKM F-3880D и его гигиенический норматив. 2
3. Пределы измерений. 3
4. Метод измерений. 3
5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы.. 3
6. Требования безопасности. 4
7. Требования к квалификации операторов. 4
8. Условия измерений. 4
9. Проведение измерения. 4
10. Вычисление результатов измерения. 5
11. Оформление результатов измерений. 6
Список литературы.. 6
|
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации
Г.Г. Онищенко
20 июля 2012 г.
Дата введения: с момента утверждения
|
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения
концентрации
клеток мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum
TW-420 BKM F-3880D -
продуцента целлюлаз,
b-глюканазы и ксиланазы в атмосферном
воздухе населенных мест
Методические указания
1. Общие положения и
область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику
проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток
мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-420
BKM F-3880D - продуцента целлюлаз, b-глюканазы и
ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50
до 5000 клеток в 1 м3 воздуха.
Методические указания
разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля штамма Tr. longibrachiatum TW-420 BKM
F-3880D в атмосферном воздухе и оценки
соответствия уровня его содержания гигиеническим нормативам на основе учета
требований ГОСТ
17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам
определения загрязняющих веществ» и ГОСТ
Р 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».
Методические указания
предназначены для применения в организациях Федеральной службы по надзору в
сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также в санитарных
лабораториях биотехнологических предприятий, микробиологических лабораториях
научно-исследовательских институтов, работающих в области гигиены окружающей
среды и аккредитованных в установленном порядке на право проведения
микробиологических исследований.
2. Биологическая
характеристика плесневого гриба Tr. longibrachiatum TW-420 BKM F-3880D и его гигиенический норматив
Штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-420 BKM F-3880D является продуцентом комплекса целлюлаз, b-глюканазы и ксиланазы. Получен с помощью
методов многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры Tr. longibrachiatum TW-307 BKM
F-3865D. Депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов
Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН под
номером BKM F-3880D.
Растет на агаризованных
средах (Мальц-arap, глюкозо-картофельный агар, среда Чапека
с дрожжевым автолизатом, сусло-агар) при t 29 - 34 °С в течение 7 суток, рН 3,5 - 5,0.
При росте на Мальц-агаре
диаметр колоний достигает 80 - 90 мм на 7-е сутки при росте при t 25 °С. Мицелий развит преимущественно субстратный, воздушный
мицелий - скудный, белого цвета. Цвет колонии первоначально белый, затем при
формировании спор - зеленый. Обратная сторона колоний имеет
светло-зеленовато-желтоватую окраску.
При микроскопировании штамм
имеет конидии, которые формируются в многочисленных компактных подушечках
диаметром до 2 мм. Конидиеносцы бесцветные, гладкостенные формируются на
субстратном мицелии, главные ветви которого длинные и прямые, иногда извитые.
Боковые ветви короткие, формируются через неравные интервалы под углом к
главным ветвям. Фиалиды одиночные, булавовидные или бутыловидные, размер 5 - 10´2 - 3 мкм. Конидии одноклеточные,
зеленоватые, гладкостенные, эллипсоидные размером 4 - 7´2 - 4 мкм собраны в мелкие головки на
вершинах фиалид.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений
количества клеток плесневого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в
диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха при
доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха
клеток плесневого гриба на поверхность плотной питательной среды и подсчета
выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и
физиолого-биохимическим признакам.
5. Средства измерений,
вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют
следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные
устройства, материалы
Импактор
микробиологический «Флора-100»
|
ТУ 9443-001-05031637-02
|
Прибор для
бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова)
|
ТУ 64-12791-77
|
Прибор MAS-100 ECO фирмы Merk
(Германия) для отбора проб воздуха
|
|
Термостаты электрические
суховоздушные или водяные
|
|
Автоклав электрический
|
ГОСТ 9586-75
|
Бокс, оборудованный
бактерицидными лампами
|
|
Холодильник бытовой
|
|
Весы лабораторные,
аналитические типа ВЛА-200
|
|
Микроскоп биологический с
иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211
|
|
Лупа с увеличением ´10
|
ГОСТ 25706-83
|
Чашка Петри
бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 90 мм
|
ГОСТ 23932-90
|
Пробирки бактериологические
П1 и П2 вместимостью 15 и 20 мл
|
ГОСТ 25336-82
|
Пипетки мерные на 1, 5 и 10
мл
|
ГОСТ 10515-75
|
Пипетки мерные на 1, 5 и 10
мл
|
ГОСТ 1770-74
|
Колбы конические
вместимостью 250 и 500 мл
|
ГОСТ 1770-74
|
Секундомер
|
ГОСТ 9586-75
|
Барометр
|
ГОСТ 24696-79
|
Марля медицинская
|
ГОСТ 9412-77
|
Вата медицинская
гигроскопическая
|
ГОСТ 25556-81
|
5.2. Реактивы, растворы
Агар
микробиологический
|
ГОСТ 17206-84
|
D-Глюкоза
|
ГОСТ
6038-79
|
(возможно заменить
раствором глюкозы для инъекций)
|
|
Вода дистиллированная
|
ГОСТ 6709-72
|
Спирт этиловый ректификат
|
ГОСТ 5962-67
|
Кислота молочная пищевая
(для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной флоры)
|
ГОСТ 490-79
|
Глюкозо-картофельный агар,
г/л (очищенный картофель - 200, агар - 18 - 20, рН 4,5 - 5,0, режим
стерилизации 1,1 - 1,2 ати в течение 30 мин, глюкоза - 15 - 20 перед
использованием)
|
|
Среда Гетчинсона, г/л (КН2РO4 - 0,1; NaCl - 0,1;
СаСl2 - 0,1; FeCl3 - 0,1; MgSO4
´ 7Н2O - 0,3; NaNO3 - 2,5; агар - 2,0; дистиллированная вода)
|
|
0,5 %-й водный раствор
карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), вязкость m 10 мПас, t 25 °C, вискозиметр Брукфильда LVF
|
|
0,1 %-й раствор Конго
Красного (congo
rot)
|
|
6. Требования
безопасности
При выполнении измерений
концентрации клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе соблюдают следующие
требования.
6.1. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами».
6.2. ГОСТ 12.1.005-88 «Правила техники безопасности при работе с химическими
реактивами».
6.3. ГОСТ 12.1.019-79 «Электробезопасность при работе с электроустановками» и
инструкции по эксплуатации прибора.
6.4.
Руководство «Положение об организации работы по технике безопасности в
микробиологической промышленности» (1980), «Инструкции по устройству,
требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических
лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).
6.5. Все
виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей
вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном
бактерицидными лампами.
7. Требования к
квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их
результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием,
прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области
микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и
подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре
воздуха (20 ± 5) °С, атмосферном давлении (760 ± 20) мм рт.ст. и влажности
воздуха не более 80 %.
9. Проведение
измерения
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения концентрации клеток
мицелиального гриба воздух аспирируют при помощи одного из пробоотборников со
скоростью 10 - 100 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время
аспирации воздуха (5 - 20 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток
штамма-продуцента и вида пробоотборника.
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха
тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность
подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку
крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой,
одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки
прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска,
прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной
чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации
и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
При выполнении анализа воздуха
прямым методом глюкозо-картофельный агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °С,
добавляют глюкозу из расчета 15 - 20 г/л и молочную кислоту из расчета 2,0 мл
на 500 мл среды (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной
микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.
Чашки с застывшей средой
помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки
бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. После отбора проб
воздуха чашки Петри помещают в термостат на 29 °С. Через 4 - 7 суток производят
подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам и
характерной окраске колоний микромицета с обратной стороны чашки.
При
выполнении анализа атмосферного воздуха дополнительным методом пробы воздуха
отбирают на среду Гетчинсона с добавлением 0,5 %-й карбоксиметилцеллюлозы. Культивируют в термостате
при t 28 °С в течение двух суток и проводят
окрашивание 0,1 %-м раствором Конго красным. Учет колоний штамма производится
по зонам просветления, образующимся в результате ферментации целлюлозы под
действием комплекса целлюлаз.
Ростовые свойства всех используемых
питательных сред должны быть проверены в соответствии с «Требованиями к
ростовым свойствам питательных сред» (Государственная Фармакопея СССР, изд. XI, вып. 2, с. 208), что позволит более
полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный
штамм-продуцент высевается на 2 - 3 чашки каждой используемой среды.
10. Вычисление
результатов измерения
Расчет концентрации клеток продуцента
в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле:
где
Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 -
коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время
аспирации).
В случае невозможности использования
аппарата Кротова. рекомендуем применять метод седиментации клеток продуцента из
воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время
отбора проб воздуха может составлять до 60 мин. При использовании этого метода
пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента.
Эмпирически установлено, что за 5 мин на
площадь 100 см2 оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л
воздуха, следовательно за 1 мин - количество бактерий из 2 л воздуха. Площадь
чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 см2. Составляя пропорцию
определяем, что за 1 мин на стеклянную чашку Петри оседают клетки из 1,57
л/мин. Количество клеток в 1 м3 воздуха определяем по
вышеприведенной формуле, где V - 1,57 л/мин ´ t
(время аспирации, мин).
Предлагаемый метод является
ориентировочным и может быть использовать как вспомогательный метод.
11. Оформление
результатов измерений
Результаты
измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол №
количественного
микробиологического анализа штамма Tr. longibmchiatum TW-420 BKM F-3880D в атмосферном воздухе населенных мест
|
1. Дата проведения анализа __________________________________________________
|
2. Рабочее место (профессия работающего) ________________________________________
|
3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство,
технологическая стадия, точка отбора пробы)
_______________________________________________________________
|
4. Вид пробоотборника ______________________________________________________
|
5. Дата последней метрологической
поверки оборудования для отбора проб _________
|
6. Питательная среда, время инкубации ________________________________________
|
7. Количественная и качественная
характеристика выросших колоний (количество
типичных колоний, морфологические признаки, окраска по Грамму и др.)
|
8. Результаты идентификации
микроорганизмов с указанием метода _______________
|
9. Результаты расчёта концентрации
штамма ___________________________________
|
10. Соотношение полученных результатов с
уровнем ПДКр.з. ______________________
|
11. Отбор пробы произведён (Ф. И. О., должность, дата, подпись) _______________________
|
12. Идентификация штамма и расчёт
концентрации произведены (Ф. И. О.,
должность, дата, подпись)
____________________________________________________________________
|
Список литературы
1. РД 52.04.186-96
«Руководство по контролю загрязнения атмосферы».
2. ГОСТ Р 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».
3. ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам
определения загрязняющих веществ».