Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

16 страниц

Купить СТБ ISO 16266-2015 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку "Купить" и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Устанавливает метод выделения и подсчета Pseudomonas aeruginosa в образцах бутилированной воды с применением мембранной фильтрации.

 Скачать PDF

Стандарт идентичен международному стандарту ISO 16266:2006, IDT

Оглавление

Введение

1 Область применения

2 Нормативные ссылки

3 Термины и определения

4 Сущность метода

5 Разбавители, питательные среды и реактивы

6 Оборудование и стеклянная посуда

7 Отбор проб

8 Методика испытаний

9 Представление результатов

10 Протокол испытаний

11 Данные о ростовых свойствах

12 Факторы, препятствующие достоверной оценке

13 Обеспечение качества

Приложение А (справочное) Дополнительная информация о Pseudomonas aeruginosa

Приложение В (справочное) Альтернативные среды

Библиография

Приложение Д.А (справочное) Сведения о соответствии государственных стандартов ссылочным международным стандартам

 
Дата введения01.12.2015
Добавлен в базу01.01.2019
Завершение срока действия01.07.2020
Актуализация01.01.2021

Организации:

25.05.2015УтвержденГосстандарт Республики Беларусь29
РазработанБелГИМ
ИзданБелГИСС2015 г.

Water quality. Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa. Membrane filtration method

Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

КАЧЕСТВО ВОДЫ

Обнаружение и подсчет Pseudomonas aeruginosa. Метод мембранной фильтрации

ЯКАСЦЬ ВАДЫ

Выяуленне i падлш Pseudomonas aeruginosa. Метад мембраннай фтьтрацьм

(ISO 16266:2006, ЮТ)

Издание официальное

Г осстандарт Минск

(пБ

УДК 628.16.067.1:543.31 (083.74)(476)    МКС 13.060.70    КП    06    ЮТ

Ключевые слова: качество воды, обнаружение Pseudomonas aeruginosa, подсчет Pseudomonas aeruginosa, метод мембранной фильтрации

Предисловие

Цели, основные принципы, положения по государственному регулированию и управлению в области технического нормирования и стандартизации установлены Законом Республики Беларусь «О техническом нормировании и стандартизации».

1    ПОДГОТОВЛЕН республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт метрологии» (БелГИМ)

ВНЕСЕН Госстандартом Республики Беларусь

2    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ постановлением Госстандарта Республики Беларусь от 25 мая 2015 г. № 29

3    Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 16266:2006 Water quality -Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa - Method by membrane filtration (Качество воды. Обнаружение и подсчет Pseudomonas aeruginosa. Метод мембранной фильтрации).

Международный стандарт разработан подкомитетом SC 4 «Микробиологические методы» технического комитета ISO/TC 147 «Качество воды» Международной организации по стандартизации (ISO).

Перевод с английского языка (ел).

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий государственный стандарт, и международных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в Национальном фонде ТИПА.

В разделе «Нормативные ссылки» и тексте стандарта ссылки на международные стандарты актуализированы.

Сведения о соответствии государственных стандартов ссылочным международным стандартам приведены в дополнительном приложении Д.А.

Степень соответствия - идентичная (ЮТ)

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

© Госстандарт, 2015

Настоящий стандарт не может быть воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Госстандарта Республики Беларусь

Издан на русском языке

СТБ ISO 16266-2015

- cr- количество красновато-коричневых колоний, давших положительные результаты при проверке на выделение аммиака и оксидазы и флюоресцирующих на питательной среде Кинга В, то количество Pseudomonas aeruginosa в исследуемом объеме пробы составляет

Р + F(cF/nF) + FKCr/Dr).

Допускается также представление результатов в форме качественной оценки как подтверждение присутствия или отсутствия Pseudomonas aeruginosa в исследуемом объеме воды.

10    Протокол испытаний

В протоколе испытаний должна указываться следующая информация:

a)    ссылка на настоящий стандарт;

b)    все данные, позволяющие полностью идентифицировать пробу;

c)    полученные результаты анализа, выраженные в соответствии с требованиями раздела 9;

d)    дополнительные наблюдения, сделанные при выполнении анализа, а также сведения обо всех выполненных операциях, не предусмотренных методом или рассматриваемых как необязательные, которые могли оказать влияние на полученные результаты.

11    Данные о ростовых свойствах

При проведении сличительных испытаний шестью лабораториями из пяти стран были получены следующие результаты (см. таблицу 2).

Таблица 2 - Сличительные испытания для определения ростовых свойств среды Pseudomonas агар.

Средние показатели относительного выделения (%) различных штаммов Pseudomonas aeruginosa

на среде Pseudomonas агар по сравнению с питательным агаром после разведения дистиллированной

водой и фильтрации

Штамм

Продолжительность

инкубации

%

Л

24 ч

101,7

48 ч

100,1

О

24 ч

92,6

48 ч

91,3

О

24 ч

104,4

о

48 ч

124,8

А

24 ч

94,7

48 ч

91,3

12    Факторы, препятствующие достоверной оценке

При выделении большого числа микроорганизмов, предположительно относящихся к Pseudomonas aeruginosa, естественное разрастание колоний может препятствовать их точной количественной оценке.

13    Обеспечение качества

Штаммы Pseudomonas aeruginosa NCTC 10332 и Е. coli NCTC 9001 могут быть использованы в качестве положительного и отрицательного контроля на любом из этапов исследования.

7

СТБ ISO 16266-2015

Приложение А

(справочное)

Дополнительная информация о Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa - это типовой вид микроорганизмов рода Pseudomonas.

Он представляет собой грамотрицательные неспорообразующие палочки, дающие положительную реакцию в тестах на оксидазу и каталазу. Для этих микроорганизмов характерен окислительный метаболизм, что подтверждается результатами теста на среде Хью-Лейфсона; они, как правило, способны восстанавливать нитраты до нитритов и выделять аммиак, разлагая ацетамид. Большинство штаммов (98 %) вырабатывают водорастворимый флюоресцентный пигмент. Также большинство штаммов могут развиваться при температуре 42 °С, но не при 4 °С, что позволяет дифференцировать Pseudomonas aeruginosa от Pseudomonas fiuorescens, которые развиваются при температуре 4 °С, но прекращают рост при 42 °С.

Pseudomonas aeruginosa разжижает желатин, гидролизует казеин и не вызывает гидролиза крахмала. Пигмент пиоцианин (сине-зеленый) вырабатывается более чем 90 % штаммов.

8

СТБ ISO 16266-2015

Приложение В

(справочное)

Альтернативные среды

Могут использоваться и другие питательные среды, альтернативные питательному агару, при условии, что они не селективные и не содержат сбраживающихся углеводов.

9

СТБ ISO 16266-2015

Библиография

[1]    Council Directive 80/777/EEC on the approximation of the laws of the Member States relating to the exploitation and marketing of natural mineral waters. Official Journal of the European Communities, L229, 1980, pp. 1-10

(Директива Совета 80/777/EEC о сближении законодательств государств-членов, касающихся добычи и реализации естественных минеральных вод)

[2]    Directive 96/70/ЕС of the European Parliament and of the Council amending Council Directive 80/777/EEC on the approximation of the laws of the Member States relating to the exploitation and marketing of natural mineral waters. Official Journal of the European Communities, L299, 1996,

pp. 26-28

(Директива Совета 96/70/ЕС, изменяющая Директиву Совета 80/777/ЕЕС о сближении законодательств государств-членов, касающихся добычи и реализации естественных минеральных вод)

[3]    Council Directive 98/83/ЕС on the quality of water intended for human consumption. Official Journal of the European Communities, L330, 1998, pp. 32-53

(Директива Совета 98/83/ЕС о качестве воды, потребляемой человеком)

10

Приложение Д.А

(справочное)

Сведения о соответствии государственных стандартов ссылочным международным стандартам

Таблица Д.А.1

Обозначение и наименование международного стандарта

Степень

соответ

ствия

Обозначение и наименование государственного стандарта

ISO 3696:1987 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний

ют

ГОСТ ISO 3696:2013 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля

ISO 5667-3-2012 Качество воды. Отбор проб. Часть 3. Консервация и обработка проб воды

ют

СТБ ISO 5667-3-2012 Качество воды. Отбор проб. Часть 3. Руководство по хранению и обращению с пробами воды

ISO 6887-1:1999 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Подготовка образцов для испытания, исходной суспензии и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 1. Общие правила подготовки исходной суспензии и десятичных разведений

ют

ГОСТ ISO 6887-1-2015 Микробиология пищевых продуктов и кормов. Подготовка образцов для испытания, исходной суспензии и десятикратных разведений для микробиологического исследования. Часть 1. Общие правила подготовки исходной суспензии и десятикратных разведений

ISO 19458:2006 Качество воды. Отбор проб для микробиологического анализа

ют

СТБ ISO 19458:2011 Качество воды. Отбор проб для микробиологического анализа

11

Ответственный за выпуск Н. А. Баранов

Сдано в набор 01.08.2015. Подписано в печать 21.08.2015. Формат бумаги 60x84/8. Бумага офсетная. Гарнитура Arial. Печать ризографическая. Уел. печ. л. 1,98 Уч.-изд. л. 0,65 Тираж2экз. Заказ 602

Издатель и полиграфическое исполнение:

Научно-производственное республиканское унитарное предприятие «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации» (БелГИСС) Свидетельство о государственной регистрации издателя, изготовителя, распространителя печатных изданий

№ 1/303 от 22.04.2014 ул. Мележа, 3, коми. 406, 220113, Минск.

СТБ ISO 16266-2015

Содержание

Введение..................................................................................................................................................IV

1    Область применения..............................................................................................................................1

2    Нормативные ссылки..............................................................................................................................1

3    Термины и определения........................................................................................................................2

4    Сущность метода....................................................................................................................................2

5    Разбавители, питательные среды и реактивы....................................................................................2

6    Оборудование и стеклянная посуда.....................................................................................................4

7    Отбор проб..............................................................................................................................................5

8    Методика испытаний..............................................................................................................................5

9    Представление результатов..................................................................................................................6

10    Протокол испытаний.............................................................................................................................7

11    Данные о ростовых свойствах.............................................................................................................7

12    Факторы, препятствующие достоверной    оценке...............................................................................7

13    Обеспечение качества.........................................................................................................................7

Приложение А (справочное) Дополнительная информация о Pseudomonas aeruginosa...................8

Приложение В (справочное) Альтернативные среды............................................................................9

Библиография..........................................................................................................................................10

Приложение Д.А (справочное) Сведения о соответствии государственных стандартов

ссылочным международным стандартам.......................................................................11

Введение

Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) - это условно-патогенный для человека микроорганизм, который способен развиваться в воде с очень низким содержанием питательных веществ. В процессе добычи и реализации природной минеральной воды или родниковой воды ни одна из взятых на анализ проб этой воды объемом 250 мл не должна содержать Pseudomonas aeruginosa (см. [1] и [2]). Другие виды бутилированной воды, предназначенной для продажи, также не должны содержать Pseudomonas aeruginosa в 250 мл пробы (см. [3]). Вода остальных видов, включая воду в плавательных бассейнах и воду для бытового потребления, также может периодически проверяться на содержание Pseudomonas aeruginosa в медико-санитарных целях. В этих случаях объем пробы для анализа обычно составляет 100 мл.

IV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

КАЧЕСТВО ВОДЫ Обнаружение и подсчет Pseudomonas aeruginosa. Метод мембранной фильтрации

ЯКАСЦЬ ВАДЫ Выявление i падл1к Pseudomonas aeruginosa.

Метад мембраннай фтьтрацьм

Water quality

Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa. Membrane filtration method

Дата введения 2015-12-01

ВНИМАНИЕ! Лица, применяющие настоящий стандарт, должны быть ознакомлены с надлежащей лабораторной практикой. Настоящий стандарт не ставит своей задачей рассмотрение в полном объеме проблем безопасности, связанных с его применением, если таковые имеются. Пользователь стандарта берет на себя ответственность за установление соответствующей практики в части соблюдения правил гигиены и требований техники безопасности, а также за обеспечение соответствия всем действующим положениям национальных нормативных актов.

ВАЖНО! Испытания, описанные в настоящем стандарте, должны проводиться только соответствующим образом обученным персоналом.

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод выделения и подсчета Pseudomonas aeruginosa в образцах бутилированной воды с применением мембранной фильтрации. Данный метод может быть применен для анализа воды других видов с низким уровнем фоновой флоры, например воды в плавательных бассейнах или воды, предназначенной для бытового потребления.

2    Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные стандарты. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения).

ISO 3696:1987 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний

ISO 5667-1:2006* Качество воды. Отбор проб. Часть 1. Руководство по составлению программ отбора проб

ISO 5667-3:2012 Качество воды. Отбор проб. Часть 3. Консервация и обработка проб воды

ISO 6887-1:1999 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Подготовка образцов для испытания, исходной суспензии и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 1. Общие правила подготовки исходной суспензии и десятичных разведений

ISO 7704:1985 Качество воды. Оценка мембранных фильтров, используемых для микробиологического анализа

ISO 8199:2005 Общее руководство по подсчету микроорганизмов, выращенных посевом на питательной среде

ISO 19458:2006 Качество воды. Отбор проб для микробиологического анализа

* Действует взамен ISO 5667-1:1980 и ISO 5667-2:1991.

Издание официальное

3    Термины и определения

В настоящем стандарте применяют следующий термин с соответствующим определением:

3.1    синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa): Микроорганизмы, которые размножаются на селективной питательной среде, содержащей цетримид, и вырабатывают пиоцианин, либо микроорганизмы, которые размножаются на селективной питательной среде, содержащей цетримид, дают положительные результаты в тесте на оксидазу, флюоресцируют в ультрафиолетовых лучах с длиной волны (360 ± 20) нм и обладают способностью вырабатывать аммиак из ацетамида.

4    Сущность метода

4.1    Фильтрация

Измеренный объем пробы воды или разведение этой пробы пропускают через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм. Мембранный фильтр помещают на селективную питательную среду и проводят инкубацию в условиях, предусмотренных для данной питательной среды.

4.2    Подсчет

Количество микроорганизмов, предположительно являющихся Pseudomonas aeruginosa, определяют путем подсчета типичных колоний на мембранном фильтре после инкубации. Колонии, вырабатывающие пиоцианин, всегда относят к Pseudomonas aeruginosa, в то время как принадлежность прочих флюоресцирующих или окрашенных в красновато-коричневый цвет колоний требует дополнительного подтверждения.

4.3    Подтверждение

Выполняют пересев колоний, видовая принадлежность которых требует подтверждения, с мембранного фильтра на чашки с питательным агаром (см. также приложение В). После инкубации проводят исследование культур, которые первоначально не проявляли флюоресцентных свойств, на оксидазу, а затем оксидазоположительные культуры исследуют на выработку флюоресцеина и способность вырабатывать аммиак из ацетамида. Колонии, которые проявили флюоресцентные свойства в начале испытаний, дополнительно проверяют на способность вырабатывать аммиак из ацетамида.

5    Разбавители, питательные среды и реактивы

В процессе приготовления питательных сред и разбавителей используют реактивы аналитической степени чистоты, если не указано иное. Готовят питательную среду, как описано ниже, и добавляют к ней селективные агенты в заданных концентрациях или используют промышленно выпускаемые питательные среды и реактивы, подготавливаемые в соответствии с указаниями изготовителя. Для разведения питательной среды и реактивов используют воду класса 3 согласно ISO 3696 или воду сопоставимой степени чистоты, не содержащую веществ, которые могут подавлять рост микроорганизмов в условиях, выбранных для испытаний.

5.1    Питательные среды

Для определения Pseudomonas aeruginosa применяют питательную среду, описанную ниже.

кислотой

5.1.1.1 Состав

Желатиновый пептон    16,0 г

Гидролизат казеина    10,0 г

Сульфат калия (безводный) (K2S04)    10,0 г

Хлорид магния (безводный) (MgCI2)    1,4 г

Глицерин    10 мл

Агар    от 11,0 до 18,0 г

Вода (дистиллированная или сопоставимой степени чистоты)    1000 мл


5.1.1    Основа агаризованной среды Pseudomonas агар/агар с цетримидом и налидиксовой

Примечание - Требуемое количество агара зависит от его желирующей способности. При работе с агаром необходимо следовать указаниям изготовителя.

2

СТБ ISO 16266-2015

Добавка CN

Гексадецилтриметиламмоний бромид (цетримид)    0,2 г

Налидиксовая кислота    0,015 г.

5.1.1.2 Приготовление

5.2 Подтверждающие среды и реактивы

5.2.1    Среда Кинга В

5.2.1.1    Состав

Пептон    20,0 г

Глицерин    10 мл

Фосфат калия однозамещенный (К2НР04)    1,5 г

Сульфат магния семиводный (MgS04-7H20)    1,5 г

Агар    15,0 г


Растворяют пептон, гидролизат казеина, сульфат калия, хлорид магния и агар в 1000 мл дистиллированной воды (или воды сопоставимой степени чистоты). Добавляют 10 мл глицерина. Доводят смесь до кипения, чтобы добиться полного растворения компонентов, затем стерилизуют в автоклаве при температуре (121 ± 3) °С в течение 15 мин. Дают питательной среде охладиться до температуры 45 °С - 50 °С. Добавку цетримида и налидиксовой кислоты, растворенную в 2 мл стерильной дистиллированной воды, хорошо перемешивают и добавляют к стерильной расплавленной основной среде. После тщательного перемешивания питательной среды ее разливают в стерильные чашки Петри таким образом, чтобы полученная толщина слоя агара составляла не менее 5 мм. Конечный уровень pH застывшей питательной среды должен соответствовать 7,1 ± 0,2 при температуре 25 °С. Залитые чашки, не допуская их высыхания, хранят в темном месте при температуре (5 ± 3) °С и используют в течение 1 месяца со дня приготовления. Среда может находиться в расплавленном состоянии не более 4 ч. Повторно питательную среду не расплавляют.

Вода (дистиллированная или аналогичной чистоты) 1000 мл.

5.2.1.2 Приготовление

Компоненты растворяют в нагретой воде. Охлаждают до температуры 45 °С - 50 °С и регулируют уровень pH при помощи соляной кислоты или натрия гидроксида таким образом, чтобы он равнялся

7,2 ± 0,2 при температуре 25 °С. Разливают среду по 5 мл в пробирки, закрывают их колпачками и автоклавируют при температуре (121 ± 3) °С в течение 15 мин. Дают питательной среде в пробирках застыть под наклоном.

приготовления.

5.2.2 Питательный бульон с ацетамидом 5.2.2.1 Состав Раствор А

Фосфат калия двузамещенный    (КН2Р04)    1,0 г

Сульфат магния безводный (MgS04)    0,2    г

Ацетамид    2,0    г

Хлорид натрия (NaCI)    0,2    г

Вода (дистиллированная или сопоставимой степени чистоты, не содержащая аммиака) 900 мл.


Хранят среду в темном месте при температуре (5 ± 3) °С и используют в течение 3 мес со дня

Растворяют компоненты в воде и регулируют уровень pH раствора при помощи соляной кислоты или гидроксида натрия таким образом, чтобы он соответствовал 7,0 ± 0,5 при температуре 25 °С.

ВНИМАНИЕ! Ацетамид оказывает канцерогенное и раздражающее действие. При взвешивании, приготовлении и утилизации данной среды должны быть приняты соответствующие меры безопасности.

Раствор В

Молибдат натрия (Na2Mo04-2H20)    0,5 г

Сульфат железа семиводный (FeS04-7H20)    0,05 г

Вода    100    мл.

3

5.2.2.2 Приготовление

Для приготовления питательного бульона с ацетамидом добавляют 1 мл раствора В к 900 мл свежеприготовленного раствора А (5.2.2.1). Непрерывно помешивая, добавляют воду и доводят общий объем раствора до 1 л. Разливают приготовленную смесь по 5 мл в пробирки, закрывают их колпачками и автоклавируют при температуре (121 ± 3) °С в течение 15 мин. Хранят питательный бульон в темном месте при температуре (5 ± 3) °С и используют в течение 3 мес со дня приготовления.

5.2.3 Питательный агар

5.2.3.1 Состав

Пептон    5,0 г

Мясной экстракт    1,0 г

Дрожжевой экстракт    2,0 г

Хлорид натрия (NaCI)    5,0 г

Агар    15,0 г

Вода    1000    мл.

5.2.3.2 Приготовление

Компоненты растворяют в нагретой воде. Стерилизуют раствор в автоклаве при температуре (121 ± 3) °С в течение 15 мин. Значение pH приготовленной среды после застывания должно быть 7,4 ± ± 0,2 при температуре 25 °С. Просушивают чашки перед использованием для удаления излишней влаги с поверхности. Залитые чашки хранят в темном месте, не допуская их высыхания, при температуре (5 ± 3) °С и используют в течение 1 мес со дня приготовления.

5.2.4    Реактив для выполнения теста на оксидазу

5.2.4.1    Состав

Тетраметил-л-фенилендиамина дигидрохпорид 0,1 г

Вода    10    мл.

5.2.4.2    Приготовление

Растворяют тетраметил-л-фенилендиамина дигидрохпорид в воде непосредственно перед использованием; раствор хранят в темном месте. Поскольку данный реактив нестабилен, каждый раз при выполнении анализа приготавливают небольшое количество свежего раствора.

В качестве альтернативы могут использоваться другие доступные, промышленно выпускаемые тесты на оксидазу.

5.2.5    Реактив Несслера

5.2.5.1    Состав

Хлорид ртути (НдС12)    Юг

Йодид калия (KI)    7 г

Гидроксид натрия (NaOH)    16 г

Вода (не содержащая аммиака) 100 мл.

Растворяют в небольшом количестве воды 10 г НдС12 и 7 г KI и, помешивая, постепенно добавляют эту смесь к охлажденному раствору, приготовленному из 16 г NaOH и 50 мл воды. Разбавляют раствор водой и доводят его объем до 100 мл. Готовый раствор хранят в боросиликатных стеклянных сосудах с резиновой пробкой вдали от солнечных лучей. Максимальный срок хранения составляет один год.

ВНИМАНИЕ! НдС12-токсичное вещество. Опасно при проглатывании.

6 Оборудование и стеклянная посуда

Используют стандартное лабораторное оборудование для микробиологических исследований.

6.1    Стеклянная посуда

Всю стеклянную посуду перед применением стерилизуют при температуре (170 ± 5) °С в течение 1 ч в суховоздушном шкафу или при температуре (121 ± 3) °С в течение 15 мин в автоклаве.

6.2    Инкубатор, обеспечивающий рабочую температуру (36 ± 2) °С.

6.3    Ультрафиолетовая лампа, длина волны излучения (360 ± 20) нм.

6.4    Стерильные мембранные фильтры, номинальный размер пор 0,45 мкм.

Характеристики фильтров подлежат регулярному контролю, как установлено в ISO 7704.

4

СТБ ISO 16266-2015

7    Отбор проб

Отбор, хранение, консервацию и обработку проб осуществляют в соответствии с требованиями ISO 5667-1, ISO 5667-3 и ISO 19458.

8    Методика испытаний

8.1    Общие требования

Мембранную фильтрацию осуществляют в соответствии с методикой, описанной в ISO 8199, а приготовление разведений - в соответствии с требованиями ISO 6887-1.

8.2    Мембранная фильтрация

Пропускают отдельные части пробы воды или части разведения этой пробы через стерильный эфироцеллюлозный мембранный фильтр с номинальным диаметром пор 0,45 мкм. Как установлено в ISO 8199, помещают каждую мембрану на чашку Петри, содержащую агар с цетримидом и налидик-совой кислотой (5.1), и проверяют отсутствие воздушных пузырей под мембраной.

8.3    Инкубация чашек

Инкубацию чашек Петри проводят при температуре (36 ± 2) °С в течение (44 ±4) ч в закрытых контейнерах, оберегая их от высыхания.

8.4    Осмотр мембран

Рост микроорганизмов на мембранах контролируют спустя (22 ± 2) ч и (44 ± 4) ч.

Все обнаруженные колонии, которые дают синюю/зеленую (пиоцианин) окраску, рассматривают как относящиеся к Pseudomonas aeruginosa, и выполняют их подсчет.

Осматривают мембрану в ультрафиолетовых лучах. Следует отметить, что продолжительное ультрафиолетовое облучение мембран нежелательно, так как в подобном случае колонии могут погибнуть и будет невозможно проследить дальнейший рост микроорганизмов на подтверждающей среде. Выполняют подсчет всех не производящих пиоцианин, но флюоресцирующих колоний как предположительно относящихся к Pseudomonas aeruginosa и проверяют их принадлежность при помощи бульона с ацетамидом, как описано ниже.

Выполняют подсчет всех прочих нефлюоресцирующих колоний с красновато-коричневой пигментацией как предположительно относящихся к Pseudomonas aeruginosa и проверяют их принадлежность при помощи теста на оксидазу, бульона с ацетамидом и среды Кинга В, как описано ниже. Подсчет колоний по истечении (22 ± 2) ч выполняют на случай чрезмерно быстрого роста и слияния колоний, который может наблюдаться спустя (44 ± 4) ч. По результатам двух подсчетов для вычисления количества Pseudomonas aeruginosa в соответствии с разделом 9 используют большее из полученных значений.

В таблице 1 представлен обобщенный порядок выбора колоний и выполнения подтверждающих операций.

Таблица 1 - Операции, необходимые для подтверждения видовой принадлежности колоний, выращенных на агаровой питательной среде с цетримидом и налидиксовой кислотой

Описание колонии, выращенной на агаре с цетримидом и налидиксовой кислотой

Выработка аммиака из ацетамида

Выделение

оксидазы

Флюоресценция на среде Кинга В

Подтверждено

присутствие

Pseudomonas

aeruginosa

Синяя/зеленая окраска

НП а)

НП

НП

Да

Флуоресцентная окраска (кроме синей/зеленой)

+

НП

НП

Да

Красновато-коричневая окраска

+

+

+

Да

Прочие виды

НП

НП

НП

Нет

а) НП - не проверяется.

8.5 Подтверждение результатов

8.5.1    Питательный агар

Выполняют пересев всех колоний или по возможности как можно большего количества колоний (см. ISO 8199), нуждающихся в подтверждении, с мембранного фильтра, а затем проводят инкубацию в течение (22 ± 2) ч при температуре (36 ± 2) °С. Контролируют посевы на чистоту и подвергают те из них, которые первоначально демонстрировали красновато-коричневую окраску, тесту на оксидазу (8.5.2).

8.5.2    Тест на оксидазу

Помещают две-три капли свежеприготовленного реактива для выполнения теста на оксидазу

(5.2.4)    на фильтровальную бумагу, находящуюся в чашке Петри.

При помощи платиновой (не никель-хромовой) проволочной петли, пластиковой петли, деревянной или стеклянной палочки распределяют некоторое количество культуры по фильтровальной бумаге. Окрашивание фильтровальной бумаги в насыщенный сине-фиолетовый цвет в течение 10 с рассматривают как положительную реакцию. В качестве альтернативы можно использовать промышленно выпускаемые реактивы для тестов на оксидазу, при этом необходимо соблюдать соответствующие указания изготовителя.

8.5.3    Среда Кинга В

Выполняют пересев полученных в 8.5.1 культур с красновато-коричневой пигментацией, дающих положительные результаты в тесте на оксидазу, на среду Кинга В, а затем проводят инкубацию максимально в течение 5 дней при температуре (36 ± 2) °С 1). Ежедневно контролируют их рост в ультрафиолетовых лучах и следят за появлением флюоресценции. Если в указанный пятидневный период было замечено флуоресцентное свечение, фиксируют положительный результат исследования.

8.5.4    Бульон с ацетамидом

Засевают пробирки культурой, полученной в 8.5.1, и проводят инкубацию при температуре (36 ± 2) °С в течение (22 ± 2) ч. Добавляют в каждую пробирку одну-две капли реактива Несслера

(5.2.5)    и проверяют посевы на выделение аммиака, о котором должно свидетельствовать окрашивание содержимого пробирок в зависимости от концентрации в цвет от желтого до кирпично-красного.

8.5.5    Подсчет

Подсчитывают все колонии, подтвержденные как Pseudomonas aeruginosa, а именно колонии, которые вырабатывают пиоцианин (сине-зеленый пигмент) или демонстрируют положительные результаты в тесте на оксидазу, флуоресцируют в ультрафиолетовых лучах (8.4 или 8.5.3) и обладают способностью вырабатывать аммиак из ацетамида (8.5.4).

Примечание - Флюоресцирующие колонии на первичной мембране всегда дают положительные результаты

в тесте на оксидазу, соответственно они не нуждаются в дополнительном контроле данного параметра

(см. таблицу 1).

9 Представление результатов

Исходя из подсчитанного количества типичных колоний на мембранах и с учетом результатов выполнения подтверждающих исследований, определяют подтвержденное количество Pseudomonas aeruginosa, содержащееся в заданном объеме воды. Для минеральной, родниковой и других видов бутилированной воды этот объем составляет 250 мл (см. [1], [2] и [3]). Для остальных видов воды исследуемый объем обычно составляет 100 мл.

Пример

Если

-Р- количество синих/зеленых колоний, заведомо принадлежащих искомому виду;

-F- количество флюоресцирующих колоний;

-    R - количество красновато-коричневых колоний;

-    Пр - количество флюоресцирующих колоний, проверенных на выделение аммиака;

-    ср - количество флюоресцирующих колоний, давших положительный результат при проверке на выделение аммиака;

-ля - количество красновато-коричневых колоний, проверенных на выделение аммиака и оксида-зы и флюоресценцию на питательной среде Кинга В;

11 Как правило, достаточно 24 ч.