ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

МОЛОКО

Часть 1

Метод определения количества соматических клеток с применением микроскопа (контрольный метод)

МАЛАКО

Частка 1

Метад вызначэння колькасщ саматычных кпетак з выкарыстаннем мшраскопа (кантрольны метад)

(ISO 13366-1:2008, ЮТ)

Издание официальное

(JS

УДК 637.14.075(083.74)(476)    МКС    67.100.10    КП    03    ЮТ

Ключевые слова: молоко, соматические клетки, метод определения

Предисловие

Цели, основные принципы, положения по государственному регулированию и управлению в области технического нормирования и стандартизации установлены Законом Республики Беларусь «О техническом нормировании и стандартизации».

1    ПОДГОТОВЛЕН научно-производственным республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации» (БелГИСС)

ВНЕСЕН Госстандартом Республики Беларусь

2    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ постановлением Госстандарта Республики Беларусь от 18 января 2012 г. № 4

3    Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 13366-1:2008 Milk - Enumeration of somatic cells - Part 1: Microscopic method (Reference method) [Молоко. Подсчет соматических клеток. Часть 1. Метод с применением микроскопа (контрольный метод)], включая поправку Сог.1:2009.

Международный стандарт разработан подкомитетом SC 5 «Молоко и молочные продукты» технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 «Продукты пищевые» Международной организации по стандартизации (ISO) и Международной молочной федерацией (IDF).

Перевод с английского языка (еп).

Официальный экземпляр международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий государственный стандарт, имеется в Национальном фонде ТИПА.

Степень соответствия - идентичная (ЮТ)

4    ВЗАМЕН СТБ ИСО 13366-1-2005

© Госстандарт, 2012

Настоящий стандарт не может быть воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Госстандарта Республики Беларусь

Издан на русском языке

11 Протокол испытания

Протокол испытания должен включать:

a)    всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;

b)    метод отбора проб, если он известен;

c)    метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

d)    все детали, не описанные в настоящем стандарте или не обязательные, вместе с подробностями любых непредвиденных случайностей, которые могут повлиять на результат (ы) анализа;

e)    полученные результаты испытаний или окончательный заявленный результат, если была проверена повторяемость.

11

Приложение А

(справочное)

Совместное испытание

А.1 Общие положения

Международное совместное исследование коровьего молока, включающее восемнадцать лабораторий и тринадцать стран, было проведено в октябре 2005 г. Было исследовано 8 проб при четырех уровнях концентрации клеток на миллилитр и поделенных на 16 «слепых» дубликатов:

Средние значения каждого уровня концентрации были следующими:

-    уровень 1, пробы А и В: 245 ООО клеток/мл;

-    уровень 2, пробы С и D: 455 ООО клеток/мл;

-    уровень 3, пробы Е и F: 679 ООО клеток/мл;

-    уровень 4, пробы G и Н: 791 ООО клеток/мл.

Испытание было организовано A.I.A. (авторитетным инспекционным органом) Laboratorio Standard Latte (Лаборатория стандартов молока), Маккарезе, Рим (Италия). Были проведены статистические исследования в соответствии с ISO 5725-1 и ISO 5725-2 и получены прецизионные данные, указанные в таблице А.1.

Таблица А.1 - Результаты межлабораторного испытания

Уровень 1 2 3 4 Неучаствовавшие после устранения резко отклоняющихся значений 24 23 24 24 Среднее значение, х1 ООО клеток/мл 245 455 679 791 Стандартное отклонение сходимости sr> xi ООО клеток/мл 38 43 69 110 Коэффициент вариации стандартного отклонения сходимости, % 16 9 10 14 Предел сходимости r(2,8sr), *1 ООО клеток/мл 107 121 192 308 Стандартное отклонение воспроизводимости Sr, *1 ООО клеток/мл 41 62 78 110 Коэффициент вариации стандартного отклонения воспроизводимости, % 17 14 11 14 Предел воспроизводимости R (2,8sR), *1 ООО клеток/мл 114 174 218 308

12

СТБ ISO 13366-1-2012

Приложение В

(справочное)

Окрашивание козьего молока

В.1 Красящие растворы для козьего молока [8]

60 мл 20 мл 120 мл

В.1.1 Фиксатор Карнуа В.1.1.1 Компоненты

Хлороформ

Уксусная кислота ледяная 100%-ный этиловый спирт

В.1.1.2 Приготовление

Добавляют последовательно хлороформ и уксусную кислоту ледяную в этиловый спирт и тщательно перемешивают.

В.1.2 Красящий раствор метилового зеленого и пиронина-Y

В.1.2.1 Состав

Пиронин-Y    1,0 г

Метиловый зеленый    0,56 г

Деминерализованная вода    196 мл

В.1.2.2 Приготовление

Добавляют последовательно пиронин-Y и метиловый зеленый в колбу с деминерализованной водой и тщательно перемешивают. Фильтруют через фильтр (5.2) и хранят в колбе из коричневого стекла. Перед использованием раствор снова фильтруют через фильтр (5.2).

В.2 Приготовление мазка

Проводят окрашивание мазка на предметном стекле по следующей схеме:

1    Фиксатор Карнуа (В.1.1) в течение 5 мин.

2    50%-ный этанол в течение 1 мин.

3    30%-ный этанол в течение 1 мин.

4    Вода в течение 1 мин.

5    Окрашивание в красящем растворе пиронина-Y и метилового зеленого в течение 6 мин.

6    Быстрая промывка н-бутиловым спиртом и затем ксилолом.

7    Хранение предметных стекол в защищенном от пыли месте.

13

СТБ ISO 13366-1-2012

Приложение С

(справочное)

Распределение Пуассона

Как правило, клетки в молоке расположены согласно распределению Пуассона. Распределение Пуассона допускает, что:

M=V = s²,

где М - среднее значение;

V - вариация;

S - стандартное отклонение. Соответственно, коэффициент вариации CV:

CV = — х100%, М

или

CV =

100%

s

или

где М - среднее значение, представляющее собой число подсчитанных единиц (клеток) при подсчете количества соматических клеток.

14

СТБ ISO 13366-1-2012

[1]    ISO 707 IDF 50

[2]    ISO 5725-1:1994

[3]    ISO 5725-2:1994

[4]    ISO 13366-2/

IDF 148-2:2006

[5]

[6]

[7]

[8]

Библиография

Milk and milk products - Guidance on sampling

(Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб)

Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 1: General principles and definitions

(Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Общие принципы и определения)

Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method

(Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерения)

Milk - Enumeration of somatic cells - Part 2: Guidance on the operation of fluo-ro-opto-electronic counters

(Молоко. Подсчет соматических клеток. Часть 2. Руководство по работе флуорооптоэлекгронных счетчиков)

Department of Health and Human Services. Public Health Services. Food and Drug Administration. Milk laboratory evaluation form. Direct microscopic somatic cell count, FDA/2400d, check list

(Министерство здравоохранения и социального обеспечения. Здравоохранение. Управление по контролю за продуктами и лекарствами. Образец лабораторной оценки молока. Прямой микроскопический подсчет соматических клеток, FDA/2400d, контрольный лист)

PACKARD, V.S. et al. 1992. Direct microscopic methods for bacterial or somatic cells. In Standard methods for the examination of dairy products. American Public Health Association. Washington, DC, pp. 309-325

(Прямые микроскопические методы для бактериальных или соматических клеток. В стандартных методах для исследования молочной продукции. Американская ассоциация общественного здравоохранения)

DULIN et al. 1982, Differentiation and enumeration of somatic cells in goat milk. J.Food Prot. 45, pp. 435-439

(Дифференциация и подсчет соматических клеток в козьем молоке)

QUERVEL, X. & TROSSAT, Ph. 2005, Study report - Enumeration of somatic cells in goat milk. Cecalait (France)

(Протокол исследования. Подсчет соматических клеток в козьем молоке)

15

Ответственный за выпуск В. Л. Гуревич

Сдано в набор 14.02.2012. Подписано в печать 02.03.2012. Формат бумаги 60x84/8. Бумага офсетная. Гарнитура Arial. Печать ризографическая. Уел. печ. л. 2,20 Уч.-изд. л. 1,31 Тираж экз. Заказ

Издатель и полиграфическое исполнение: Научно-производственное республиканское унитарное предприятие «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации» (БелГИСС) ЛИ № 02330/0552843 от 08.04.2009. ул. Мележа, 3, комн. 406, 220113, Минск.

СТБ ISO 13366-1-2012

Содержание

1    Область применения............................................................................................................................1

2    Термины и определения......................................................................................................................1

3    Сущность метода..................................................................................................................................1

4    Реактивы................................................................................................................................................1

5    Аппаратура............................................................................................................................................3

6    Отбор проб............................................................................................................................................3

7    Подготовка пробы к испытанию..........................................................................................................3

8    Методика испытания............................................................................................................................4

9    Подсчет и выражение результатов.....................................................................................................9

10    Прецизионность..................................................................................................................................10

11    Протокол испытания...........................................................................................................................11

Приложение А (справочное) Совместное испытание..........................................................................12

Приложение В (справочное) Окрашивание козьего молока................................................................13

Приложение С (справочное) Распределение Пуассона......................................................................14

Библиография..........................................................................................................................................15

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

МОЛОКО Часть 1

Метод определения количества соматических клеток с применением микроскопа

(контрольный метод)

МАЛАКО Частка 1

Метад вызначэння колькасц1 саматычных кпетак з выкарыстаннем м1краскопа

(кантрольны метад)

Milk Part 1

Method for determinaton of number of somatic cells using microscope

Дата введения 2012-07-01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения количества соматических клеток в сыром и химически консервированном молоке. Метод применяется для проведения испытаний исследуемых проб и для градуировки механизированных и автоматизированных систем подсчета клеток.

Предостережение. При применении настоящего стандарта могут использоваться опасные вещества и оборудование. Настоящий стандарт не предусматривает рассмотрения всех проблем безопасности, связанных с его применением. Ответственность за соблюдение техники безопасности и охраны здоровья, а также установление соответствующих ограничений по применению настоящего стандарта несет пользователь.

2    Термины и определения

В настоящем стандарте применяют следующий термин с соответствующим определением:

2.1    соматические клетки (somatic cells): Ядросодержащие клетки лейкоцитов и эпителия.

3    Сущность метода

Порцию исследуемой пробы молока распределяют тонким слоем на предметном стекле. Подсушивают и окрашивают, затем под микроскопом подсчитывают количество окрашенных клеток. Для определения количества клеток в 1 мл пробы число клеток, подсчитанное на определенной площади, умножают на рабочий коэффициент.

4    Реактивы

Используют реактивы только требуемой аналитической чистоты, дистиллированную и/или деминерализованную воду или воду, эквивалентную по чистоте.

4.1    Красящие растворы

Предостережение. Тетрахлорэтан - яд. Этидиум бромид - токсичен. При проливе необходимо немедленно принять меры по обеззараживанию. Приготовление и применение красящих растворов необходимо проводить в вытяжном шкафу, используя средства индивидуальной защиты.

4.1.1    Модифицированный красящий раствор Newman-Lampert (модификация Lewowitz-Weber)

4.1.1.1    Состав

Этанол с объемной долей спирта 95 %    54,0    мл

Тетрахлорэтан    40,0    мл

Издание официальное

Метиленовый синий    0,6 г

Ледяная уксусная кислота    6,0 мл

Примечание - Допускается заменять тетрахлорэтан таким же количеством ксилола.

4.1.1.2    Приготовление

В колбе смешивают этанол и тетрахлорэтан, укупоривают пробкой. Смесь нагревают на водяной бане (5.1) до температуры 65 °С. Добавляют метиленовый голубой в вытяжном шкафу и тщательно перемешивают. Охлаждают в холодильнике до 4 °С и затем добавляют ледяную уксусную кислоту. Раствор фильтруют через фильтр (5.2) в герметичную колбу и в ней хранят.

Красящий раствор Newman-Lampert фильтруют перед использованием.

4.1.2    Красящий раствор бромида этидия

4.1.2.1    Основной красящий раствор

4.1.2.1.1    Состав

Бромид этидия    0,25 г

Деминерализованная вода    100 мл

4.1.2.1.2    Приготовление

Бромид этидия растворяют в деминерализованной воде, предварительно нагретой до 40 °С. Охлаждают раствор до комнатной температуры. Доводят до 100 мл деминерализованной водой.

Основной красящий раствор бромида этидия хранят не более двух месяцев в темном месте при температуре (2 ± 2) °С.

4.1.2.2    Буферный раствор

4.1.2.2.1    Состав

Г идрофталат калия    0,51 г

Гидроксид калия    0,162 г

Деминерализованная вода    100 мл

4.1.2.2.2    Приготовление

Г идрофталат калия и гидроксид калия растворяют раздельно в деминерализованной воде. Буферный раствор хранят не более двух месяцев в темном месте при температуре (2 ± 2) °С.

4.1.2.3 Красящий рабочий раствор бромида этидия

4.1.2.3.1    Состав

Красящий основной раствор бромида этидия (4.1.2.1)    2 мл

Буферный раствор (4.1.2.2)    8 мл

Triton Х-100    0,1 мл

Деминерализованная вода    90 мл

Примечание - Высокая температура может снизить красящую способность бромида этидия.

4.1.2.3.2    Приготовление

Добавляют последовательно красящий основной раствор бромида этидия, буферный раствор и Triton Х-100 в деминерализованную воду, тщательно перемешивают.

Красящий рабочий раствор бромида этидия готовят непосредственно перед использованием.

4.2    Фосфатно-буферный раствор (ФБР)

4.2.1 Состав

NaCI    8 г

KCI    0,2 г

Na₂HP0₄-7H₂0    1,15 г

КН₂Р0₄    0,2 г

Деминерализованная вода 1 000 мл

4.2.2 Приготовление

Растворяют соли в деминерализованной воде. Доводят объем раствора водой до 1 000 мл и перемешивают.

Регулируют уровень pH на (7,2 ±0,1).

Примечание - Допустимо использовать имеющийся в продаже фосфатно-буферный раствор с уровнем pH = 7,2. ¹

СТБ ISO 13366-1-2012

5    Аппаратура

Применяют следующее лабораторное оборудование:

5.1    Водяные бани, обеспечивающие поддержание температуры в диапазонах (40 ± 2) °С, (50 ± 2) °С и (65 ± 2) °С.

5.2    Фильтр, устойчивый к применяемым растворам, с размером пор 10-12 мкм.

5.3    Микроскоп с увеличением 500х - 1000*. Допустимо использовать объективы для масляной иммерсии.

При использовании бромида этидия применяют люминесцентный микроскоп.

5.4    Микрошприц для распределения фиксированного объема 0,01 мл молока с предельно допускаемой погрешностью 2 %.

5.5    Микрометр сертифицированный.

5.6    Предметные стекла с предварительно нанесенным контуром (прямоугольным или круглым), с площадью 1 см¹ + 5 % (95 - 105 мм¹) или стандартные предметные стекла в комплекте с шаблоном размером 20 х 5 мм или диаметром d = 11,28 мм.

5.6.1    Подбор предметных стекол

Рекомендуется работать с предварительно нанесенным контуром или шаблоном, чтобы избежать пересчета рабочего фактора при каждом подсчете.

5.6.2    Контуры

При использовании прямоугольного контура внутренние размеры противоположных сторон не должны различаться более чем на 0,2 мм.

При использовании круглого контура вертикальный и горизонтальный внутренние диаметры не должны различаться более чем на 0,2 мм.

6    Отбор проб

Проба, представленная в лабораторию для исследования, не должна быть поврежденной или измененной во время транспортирования или хранения.

Метод отбора проб не регламентирован настоящим стандартом. Рекомендуемый метод отбора проб приведен в ISO 707.

Используемые автоматические пробоотборники должны быть предварительно аттестованы.

7    Подготовка пробы к испытанию

7.1    Хранение

До начала испытаний или консервации исследуемые пробы хранят при температуре (4 ± 2) °С.

Если отобранные пробы не были испытаны в течение 6 ч, то их необходимо законсервировать, добавляя химические консерванты, например борную кислоту, бронопол или дихромат калия. Максимальная концентрация борной кислоты должна быть не более 0,6 г на 100 мл исследуемой пробы. Максимальная концентрация бронопола должна быть не более 0,05 г на 100 мл исследуемой пробы. Максимальная концентрация дихромата калия должна быть не более 0,1 г на 100 мл исследуемой пробы. Срок хранения консервированных проб при температуре (4 ± 2) °С - не более 6 дн.

Во избежание негативного влияния на экологическую обстановку рекомендуется ограничить использование дихромата калия в пробах, законсервированных для хранения.

7.2    Подготовка пробы

Исследуемую пробу (см. 7.1) нагревают на водяной бане (5.1) до температуры 40 °С. Тщательно перемешивают. Охлаждают пробу до температуры, на которую калиброван микрошприц (5.4), например до 20 °С.

Разводят исследуемые пробы с предполагаемым количеством соматических клеток выше 1 000 000 клеток/мл фосфатно-буферным раствором (4.2), чтобы получить количество соматических клеток выше 500 000 клеток/мл в каждой разведенной исследуемой пробе.

где d - коэффициент разведения для получения в исследуемой пробе содержания соматических клеток 500 000 клеток/мл; ²

V_s- объем, исследуемой пробы, мл;

V_b - объем буферного раствора, используемого для разведения исследуемой пробы, мл.

Фиксируют искомый коэффициент разведения d, объем исследуемой пробы V_s и объем буферного раствора V_b, используемые для получения требуемого разведения.

8 Методика испытания

Из каждой анализируемой пробы готовят и распределяют на предметном стекле минимум два препарата. Стекла (5.6) моют, например этанолом (с объемной долей спирта 95 %), сушат чистой фильтровальной бумагой, фламбируют и охлаждают.

8.1    Приготовление мазка и окрашивание

Приготовление мазка и окрашивание проводят в соответствии с 8.1.1 или 8.1.2.

Примечание - Окрашивание мазка козьего молока представлено в приложении В.

8.1.1    Приготовление мазка и окрашивание красящим раствором Newman-Lampert

Микрошприцом (5.4) отбирают 0,01 мл исследуемой пробы (разведенной соответствующим образом) (см. 7.2). Промывают микрошприц исследуемой пробой. При необходимости тщательно и осторожно протирают наружную сторону шприца, которая соприкасалась с исследуемой пробой.

Пробу помещают на чистое предметное стекло площадью 1 см² (5.6) и равномерно распределяют иглой по всей указанной площади, контролируя равномерное покрытие площади, близкой к периметру. Мазок полностью высушивают при комнатной температуре.

Погружают высушенный мазок на предметном стекле в модифицированный красящий раствор Newman-Lampert (4.1.1) не менее чем на 15 мин. Мазок высушивают при комнатной температуре.

Затем осторожно промывают водопроводной водой для удаления излишков краски. Опять высушивают и хранят, защищая от пыли.

8.1.2    Окрашивание красящим раствором этидиум бромида и приготовление мазка

Смешивают 1 мл подготовленной исследуемой пробы (см. 7.2) с 1 мл красящего рабочего раствора бромида этидия (4.1.2.3) в пробирке. Избегают попадания света на смесь. Нагревают пробирку на водяной бане (5.1) до 50 °С в течение 3 мин. Охлаждают до комнатной температуры.

При помощи микрошприца (5.4) отбирают 0,01 мл смеси. Промывают микрошприц смесью. При необходимости тщательно и осторожно протирают наружную сторону шприца, которая соприкасалась со смесью.

Помещают смесь на чистое предметное стекло площадью 1 см² (5.6). При помощи иглы равномерно распределяют исследуемую пробу по всей указанной площади, одновременно проверяя, чтобы площадь, близкая к периметру, была равномерно покрыта. Высушивают мазок при комнатной температуре.

8.2    Определение

8.2.1 Оптимизация показаний микроскопа

С помощью микроскопа (5.3) в полученном мазке (8.1.1 или 8.1.2) подсчитывают ядра клеток на полях, полностью покрытых мазком молока. Выбирают наиболее приемлемое увеличение (500* -1 000*), чтобы получить в среднем не более 20 клеток в каждом поле.

Клетки содержат окрашенные ядра. Размер клеток, как правило, не менее 8 мкм. При подсчете не учитывают клетки менее 4 мкм (см. рисунок 1). При подсчете учитывают фрагменты при возможности идентификации более 50 % ядерного материала. При подсчете кластеры клеток учитывают как одну клетку, если ядерные единицы разделены не отчетливо. См. также рисунки 2 и 3. ³

СТБ ISO 13366-1-2012

Эпителиальная клетка

10 -14 мкм

Ядро круглое. Цитоплазма слабо окрашена

Макрофаг

8-30 мкм

Высокое соотношение цитоплазма/ядро. Фагоцитоз, представление антигена, секреция хемоаттрактантов

Полиморфонуклеарные лейкоциты (PMN)

10 -14 мкм 90 % - острый мастит,

60 % - хронический мастит. Низкое соотношение цитоплазма/ ядро. Фагоцитоз. Первая линия защиты от мастита

Лимфоцит

5-10 мкм

Низкое соотношение цитоплазма/ядро. Интенсивно окрашенное ядро Т-хелпера, Т-супрессора, В-клетки

Рисунок 1 - Примеры клеток

Длины клеток:    L1    =    9,79 мкм и

L2 = 2,77 мкм

Рисунок 2 - Примеры клеток коровьего молока (увеличение 1 000*)

5

L27

(увеличение 500*)    (увеличение    1    ООО*) Длина клетки: L22 = 9,08 мкм; L23 = 8,27 мкм; L24 = 4,95 мкм; L25 = 7,39 мкм; L26 = 6,37 мкм и L27 = 3,58 мкм

Рисунок 3 - Примеры клеток коровьего молока

В примере кластера, приведенного на рисунке 3, следует считать пять клеток. Клетка L27 пропущена, так как ее диаметр меньше 4 мкм.

Примечание - Высокая квалификация лаборанта является основным условием получения объективных результатов метода. Для ее повышения необходимо частое использование метода и участие в межлабораторных исследованиях.

Как правило, клетки в молоке расположены согласно распределению Пуассона (см. приложение С). Минимальное число клеток N, которое следует подсчитать в зависимости от уровня подсчета клеток для получения приведенного коэффициента вариации, установлено в таблице 1.

Достоверность результатов обеспечивается подсчитыванием минимально приведенного числа клеток. Поля и полосы, на которых проводят подсчет, выбирают таким образом, чтобы получить репрезентативное количество на всем мазке.

Таблица 1 - Минимальное число клеток N

Концентрация (* 1 000 кпеток/мл) CV (коэффициент вариации), % N (число клеток) < 150 10 100 150-250 7 200 250 - 400 6 300 >400 5 400

8.2.2 Подсчет ядер в полях, следующих друг за другом

Подсчитывают ядра в следующих друг за другом полях, в вертикальных участках в полях, расположенных на равном расстоянии друг от друга (см. рисунок 4 и таблицу 1).

a)    Начинают подсчет с левой стороны приблизительно с расстояния При использовании круглого контура подсчет начинают с левой стороны горизонтального диаметра с соответствующего расстояния d_L, так, чтобы можно было провести подсчет минимум на пяти полях вверху участка. Для прямоугольного и круглого контура, как правило, используют расстояние d_L, равное 0,5 мм.

b)    Помещают верхний и нижний край поля окружности тангенциально на внутреннюю верхнюю или нижнюю границу шаблона (последний не должен появляться на поле). В случае непокрытой плоскости рядом с границей шаблона регулируют поле в соответствии с границами мазка.

СТБ ISO 13366-1-2012

c)    После подсчета на первом поле смещают объектив микроскопа на фиксированное расстояние с/н вниз или вверх к следующему полю в направлении нижнего или верхнего края и на новом поле проводят подсчет. Как правило, используют расстояние d_H, равное 1 мм.

d)    После подсчета на последующем поле повторяют действия, описанные в перечислении с), до достижения противоположной стороны (вверху или внизу) участка. Далее выбирают один из следующих вариантов:

-    вариант 1. На следующем поле не проводят подсчет.

-    вариант 2. При появлении нижней или верхней границы, занимающей меньше половины плоскости поля, смещают объектив до тех пор, пока граница вновь полностью не исчезнет с поля, которое после этого покрывает только мазок, и выполняют подсчет.

e)    Затем перемещают объектив вправо на расстояние d_w (например, d_w= 1,5 мм или d_w= 2 мм, в зависимости от числа требуемых полей) и начинают подсчет на новом участке в противоположном направлении (вверх или вниз).

f)    Повторяют методику, описанную в перечислениях Ь) - е), до достижения правой стороны шаблона.

д) Если для проведения подсчета не достаточно полей (см. таблицу 1), подсчитывают на дополнительных полях. Для этого необходимо сфокусировать объектив микроскопа на другие места (например, изменяя исходную точку и/или постепенно изменяя расстояния перемещения) так, чтобы получить соответствующие числа клеток на полях, которые являются репрезентативными для всего мазка.

h) Проводят подсчет согласно 9.1 при использовании прямоугольного контура или согласно 9.3 при использовании круглого контура.

Примечание - При использовании прямоугольного контура на вертикальных участках размещают 5 полей на расстоянии 1 мм и 10 участков на расстоянии 2 мм, что позволяет производить подсчеты на 50 полях. Приблизительно такое же число полей получают при применении контура крутой формы, используя те же расстояния. Длины отступа (промежутка) измеряют от одного и того же места на поле при помощи верньера (регулировка по верхней или нижней границе) так, чтобы они включали диаметр поля.

8.2.3 Подсчет при помощи полос с использованием прямоугольного контура

Подсчитывают ядра в вертикальных полосах, расположенных на равном расстоянии друг от друга (см. рисунок 5 и таблицу 1).

a)    Начинают подсчет с левой стороны на расстоянии Как правило, используют расстояние d_L, равное 0,5 мм.

b)    Начинают подсчет с верхней или нижней границы прямоугольной области. Помещают границу области в середину поля микроскопа. После подсчета всех клеток перемещают объектив в направлении противоположной границы и подсчитывают все клетки, которые появились в данной полосе, пока не будет достигнута противоположная граница. Записывают число подсчитанных клеток.

c)    Затем перемещают объектив вправо на расстояние rf_w (например, d_w = 3 - 4 мм, в зависимости от числа полос, необходимых для репрезентативного количества всего мазка) и начинают подсчет на новой полосе.

Повторяют Ь) и с), пока не будет достигнута правая сторона шаблона.

Если для проведения подсчета не достаточно полос (см. таблицу 1), подсчитывают на дополнительных полосах. Для этого необходимо сфокусировать объектив микроскопа на другие места (например, изменяя исходную точку и/или постепенно изменяя расстояния перемещения rf_w) так, чтобы получить числа клеток на полях, репрезентативные для всего мазка.

Подсчитывают результат, как описано в 9.2.

7

1

2

3