СТ РК ISO 20638-2016
Смеси для детского питания. Определение содержания нуклеотидов с помощью жидкостной хроматографии

Балаларлын тамактануына арна.и ан коспалар

СУЙЫКТЫК ХРОМАТОГРАФИЯ КОМЕI I.МЕН НУКЛЕОТИД МОЛШЕРШ АНЫКТАУ

Смеси для детского питания

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НУКЛЕОТИДОВ С ПОМОЩЬЮ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

КРСТ ISO 20638-2016

Ресми басылым

Казаке гаи Республикасы Пнвестнииялар жопе даму мминеi p.iiri Техникалык реттеу жане метрология комитетi (Мемстандарт)

Балалардын тамактануына арнал*ан коспалар

СУЙЫКТЫК ХРОМАТОГРАФИЯ КОМЕГ1МЕН НУКЛЕОТИД МОЛШЕРШ АНЫКТАУ

КРСТ ISO 20638-2016

Реем и басылым

Казакстан Республикаеы Инвестнцнялар жэне даму министрлт Техника.1ык репсу жане метрологня комитет! (Мемстандарт)

Л косымшасы

(спрюраттьиО

Хроматограмма y.irLiepi

Шартты белплер:

А - Стандартты нуклеотияп epnituii косна,

В -Сияр суп непзждеп балалардын тамактануына арналган коспа;

С - Соя непзждеп балалардын тамактануына арналган коспа;

D - Белок непзждеп балалардын тамактануына арналган гидролизденген сут коспасы;

1    - Цнтиднн-5'-монофосфат (СМР);

2    - Урндин-5'-монофосфат (UMP);

3    - Гуанознн-5'-монофосфат (GMP);

4    - Инознн-5’-монофосфат (IMP);

5    - Тимидин-5'-монофосфат (ТМР);

6    - Аденознн-5'-монофосфат (АМР).

А.1 сурет! - Хроматограмма улгтлер1

В косымшасы

(ацпа/>атты*0

Деректер далдИ

В 1 - В 7 кестелерде бержген деректер зертхана аралык зертгеулерде алынган жэне ISO 5725-2 [6] стандартына жэне талдау эдкшщ сипаттамасынын дэлдтн багалау ушж б1рлескен зерттеу процедуралары ушж AOAC-1UPAC б1регенленген хаттамасына сэйкес [7] 2015 жылы жарияланды [4-5]. Зерттеу бержген талаптар непзжде багаланды [8].

Oflicri тексеру туралы толыгырак акпарат мыла саГгтта бершген: http://standards.iso.ora/iso/20638

В.1 кестеа - Сертнфнкатталган NIST 1849а стандартты практнкалык улпге ар налган деректер лэлл1п

Параметр!	СМР	UMP	GMP	IMP	АМР
Жалпы зертханалар саны, п	12	12	12	11а	12
Жалпы кайталаулар саны, 2 п	24	24	24	22	24
Барлык деректерд1н жалпы орташа мэн1 (жнынтыгы боиынша орташа). х, мг/100 г	28,14	11,76	15,07	Н/д	10,87
Кайталанушылыкты орташа квадратгык ауыткуы. Sn мг/100 г	0,46	0,30	0,38	Н/д	0,22
Жангыртушылыктын орташа квадраттык ауыткуы, SR, мг/100 г	1,36	0,59	0,68	Н/д	0,47
Кайталанушылык шеп SMPR-мен	<6%	<6%	<6%	Н/д	<6%
Кайталанушылыктын турлену коэффициент!, О . г. %	1,6	2,5	2,5	Н/д	2,1
Жангыртушылык шеп SMPR-мен	<11%	<11%	<11%	Н/д	<11%
Кайталанушылыктын турлену коэффициент!, С ГД, %	4,8	5,0	4.5	Н/д	4,4
Хорвитц коэффициент! н!к мзш	0,7	0,6	0,6	Н/д	0,6
*2/9-лан кем тертхапалар статиегнкапак талдаудам пиларылдм 11/д - Деректер жок.

В.2 Kccieci- Ьалалардын тамактануына арналган лактозасыз коснанын icciLii yjii icine apiia.ii ан дерек'гер дзлд!Г1

Параметр!	СМР	UMP	GMP	IMP	АМР
Жалпы зертханалар саны, //	12	12	24	12	12
Жалпы кайталаулар саны, 2 п	24	24	1,45	24	24
Барлык деректердщ жалпы орташа мзш (жиынтыгы бойынша орташа), х, мг/100 г	11,42	3,84	0,03	1,65	3,34

И. 2 кеапеспйц жшгасы

Параметр! СМР UMP GMP IMP АМР Кайталанушылыкгы орташа квадраттык ауыткуы, Sr, мг/100 г 0.12 0,09 0,04 0,05 0,05 Жангыртушылыктьщ орташа квалраттык ауыткуы, Sr, мг/100 г 0,89 0,30 24 0.10 0,09 Кайталанушылык men SMPR-мен <6% <6% <6% <6% <6% Кайталанушылыктын турлену коэффициент!. Cl .г. % 1,1 % 2,4 % 1.8% 2,8 % 1,4% Жангыртушылык шеп SMPR-мен <11% <11% <11% <11% <11% Жангыртушылыктын турлену коэффициент!, Cvft.% 7,8 % 7,9 % 2,8 % 6,1 % 2,7 % Хорвитц коэффициент!Hi н мэт 1,0 0,9 0,3 0,6 0,3

В. 10 кестес! - Крахмал непзшдеп балаларлын i амикт пну ына арналган коспанмк тестип улпсше арналган деректер долдп i

Параметр!	СМР	UMP	GMP	IMP	АМР
Жалпы зертханалар саны, п	11а	11а	11а	11а	11а
Жалпы кайталаулар саны, 2 п	22	22	22	22	22
Барлык деректерд!н жалпы орташа мэш (жиынтыгы бойынша орташа), х, мг/100 г	10,99	3,88	1,67	1,66	3,54
Кайталанушылыкты орташа квадраттык ауыткуы, Sr. мг/100 г	0,30	0,21	0,03	0,02	0,08
Жангыртушылыктын орташа квадраттык ауыткуы, Sr, мг/100 г	0,81	0,31	0,07	0,17	0,11
Кайталанушылык шеп SMPR-мен	<6%	<6%	<6%	<6%	<6%
Кайталанушылыктын турлену коэффициент!, С Г г, %	2,7 %	5,4 %	1,6%	1,4%	2,1 %
Жангыртушылык шеп SMPR-мен	<11%	<11%	<11%	<11%	<11%
Жангыртушылыктын турлену коэффициент!. Суд, %	7,4 %	8,4 %	4,2%	10,3%	3,0%
Хорвитц коэффициент!Hi н мэт	0,9	0,9	0,4	1,0	0,3
* 2Л)-дан кем тсргчаналар сгагнстикалык талдаулан шыгары.1ды.

В.4 кестеа - Гндролизат негпшлеп балаларлын тамактануына арналган коспанын Tccrui улricinc арналган деректер дол.пп

Параметр!	СМР	UMP	GMP	IMP	АМР
Жалпы зертханалар саны, п	12	12	12	11а	12

И. 4 кестесЬйц жалгасы

Параметр! СМР UMP GMP IMP АМР Жадны канталаулар саны, 2 п 24 24 24 22 24 Барлык деректердш жалпы орташа мэш (жиынтыгы боиынша орташа), х, мг/100 г 9,72 4,15 1,38 2,46 4,73 Каиталанушылыкты орташа квадраттык ауыткуы, Sr. мг/100 г 0,26 0,13 0,05 0,04 0,19 Жангыртушылыктын орташа квадраттык ауыткуы. Sr, мг/100 г 0,69 0,36 0,11 0,13 0,30 Каиталанушылык шеп SMPR-мен <6% <6% <6% <6% <6% Каиталанушылыктын турлену коэффициент!, С|-,П % 2,7 % 3,1 % 3,9 % 1,8% 3,9 % Жангыртушылык шеп SMPR-мен <11% <11% <11% <11% <11% Жангыртушылыктын турлену коэффициент!, (\я. % 7,1% 8,7% 7,7 % 5,5 % 6,2% Хорвитц коэффициент! Hi н мэт 0,9 1,0 0,7 0,6 0,7 * 2/9-дан кем зертханалар стат истикалык талдаудан шыгарылды.

B.l I icecTeci - Соя нсгшндеп балалардын тамакгануына арналган косианыц тестЫ улricinr арналган деректер лаллнэ

Параметр!	СМР*	UMP*	GMP*	IMP*	АМР*
Жалпы зертханалар саны, //	12	12	12	12	12
Жалпы канталаулар саны. 2 п	24	24	24	24	24
Барлык деректердш жалпы орташа мэ»н (жиынтыгы боиынша орташа), х, мг/100 г	0,50	0,19	0,22	0,16	0,54
Каиталанушылыкты орташа квадраттык ауыткуы. Sr. мг/100 г	0.19	0,05	0,05	0,07	0,11
Жангыртушылыктын орташа квадраттык ауыткуы, Sr, мг/100 г	0,34	0,14	0,18	0,25	0,30
Каиталанушылык шеп SMPR-мен	<8%	< 10%	< 10%	< 10%	<8%
Каиталанушылыктын турлену коэффициент!. С гг. %	38,5 %	25,0 %	22,9	43,7 %	20,4 %
Жангыртушылык шеп SMPR-мен	< 16%	< 20 %	< 20 %	< 20 %	< 16%
Жангыртушылыктын турлену коэффнцнен-ri, Сгя. %	67,1 %	72,0 %	82,7 %	156,2%	55,7 %
Хорвитц коэффициент! ni н маж	5,3	5,0	5,8	10,5	4.5
I cKcpiuc Соя нспнидсп балалардын 1амак1ануына apiio.ii ап коспа-iap нуклсотидпс байЫ1ы:1ма1ан жэнс тек ■)ндогснд1 дсн1сй| бар.
* Ырнсшс scpixana осы icpiic-iciin к\ра\ ыш тар унпн кол на i и жоп хабарлады. ючен д.м.нккс а или xc.ui

В.6 Kccrcci- Су i сарысуы непзшлеп балалардын тамактануына арналган 1 косианын тест!Л1 ул! icme арналган леректер дэлдп i

Параметр! СМР UMP GMP IMP АМР MdHi Мэш Мэш Мэт Мэт Жалпы зертханалар саны, п 12 12 12 10а 12 Жалпы каиталаулар саны, 2 п 24 24 24 18 24 Барлык деректердж жалпы орташа мэт (жиынтыгы бойынша орташа), х, мг/100 г 5.47 3,52 1,05 Н/д 3,51 Кайталанушылыкты орташа квадраттык ауыткуы, Sr, мг/100 г 0,15 0,05 0,02 Н/д 0,06 Жангыртушылыктын орташа квадраттык ауыткуы, Sr, мг/100 г 0,48 0,31 0,04 Н/д 0,18 Кайталанушылык шеи SMPR-мен <6% <6% <6% Н/д <6% Кайталанушылыктын турлену коэффициент!. Су.* % 2,7 % 1,5% 2,2 % Н/д 1,7% Жангыртушылык шеп SMPR-мен <11% <11% <11% Н/д <11% Жангыртушылыктын турлену коэффициент!. Суд, % 8,7 % 8,8 % 4,1 % Н/д 5,0% Хорвитц коэффициент!Hi н мэн1 1,0 0,9 0.4 Н/д 0,5

* 2/9-дан кем чертханалар стагистикалык талдаудан uiui арылды. 11/д - Леректер жок._

В. 14 кестес!- Сут негшндеп балалардын тамаюануына арна.и ан 2-коснанын тестЫ улпеше арналган леректер дэлсип

Параметр!	СМР	UMP	GMP	IMP	АМР
	Мэт	Мэш	Мэш	Мэш	Мэт
Жалпы зертханалар саны,;/	11*	12	11а	10*	И*
Жалпы кайталаулар саны, 2 п	22	24	22	22	22
Барлык деректердж жалпы орташа мэш (жиынтыгы бойынша орташа), х, мг/100 г	5,43	3,54	1,05	Н/д	3,51
Кайталанушылыкты орташа квадраттык ауыткуы, Sr. мг/100 г	0,09	0,11	0,04	Н/д	0,05
Жангыртушылыктын орташа квадраттык ауыткуы, Sr, мг/100 г	0,43	0,32	0,05	Н/д	0,15
Кайталанушылык шеп SMPR-мен	<6%	<6%	<6%	Н/д	<6%
Кайталанушылыктын турлену коэффициент!, Су.п %	1.6%	3,2	3,4 %	Н/д	1,3%

Библиография

[1]    Codex Standard 72-1981 Standard for Infant Formula and Formulas for Special Medical Purposes Intended for Infants (72-1981 кодека Hi н стандарты. Балаларга арналган арнайы медициналык максатты балалар жэне сут коспасы).

[2]    GILL B.D., 1NDYK Н Е., KUMAR М.С., SIEVWR1GHT N К., MANLEY-HARRIS М . A liquid chromatographic method for routine analysis of 5'-mononucleotides in pediatric formulas. J. AOAC Int. 2010, 93 pp. 966-973 (Гилл Б Д , Индык X.E., Кумар М.К., Снвраит НК., Мэнли-Харрис М. Балалардын тамактануына арналган коспалардагы 5‘-мононуклеотидт! рутинд1 талдау ушш суйыктык хроматография эд|С1. J АО AC Int. 2010, 93 бет. 966-973).

[3]    GILL B.D., INDYK Н Е., MANLEY-HARRIS М. Analysis of nucleosides and nucleotides in infant formula by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 2013, 405 pp. 5311-5319 (Гилл Б Д., Индык X.E., Мэнли-Харрис M. Суйыктык хроматография мен тандемд! масс-спек*трометрня кемепмен балалардын тамактануына арналган коспадагы нуклеозндтер мен нуклеотидтерд1 талдау. Анал. Бионал. Хим. 2013,405 бет.5311-5319).

[4]    ОМА 2011.20, Analysis of Nucleotide 5'-Monophosphatcs in Infant Formulas by HPLC-UV: Collaborative Study (OMA 2011.20, HPLC-UV кемепмен балалардын тамактануына арналган коспалардагы 5’-монофосфатты нуклеотид™ талдау: Б1рлескен зертгеу).

[5]    GILL В D , INDYK Н Е.. Analysis of Nucleotide 5'-Monophosphates in Infant Formulas by HPLCUV: Collaborative Study, Final Action 2011.20. J. AOAC Int. 2015, 98 pp 971-979 (Гилл БД, Индык X.E HPLC-UV кемепмен балалардын тамактануына арналган коспалардагы 5*-монофосфатты нуклеотид™ талдау: Б1рлескен зерттеу, Сонгы жумыс 2011.20. J. AOAC Int. 2015, 98 бет. 971-979).

[6]    ISO 5725-2:1994. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results — Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method (Олшеу wicTcpi мен нэтижелержш дэлдт (дурыстыгы мен прецизиондыгы). 2-бел1м. Олшеудж стандартты эдюшн каГггаланушылыгы мен жангыртушылыгын аныктаудын непзп OAici).

[7]    AOAC International AOAC Official Methods Program, Associate Referee’s Manual on development. Study, Review, and Approval Process. Part IV AOAC Guidelines for Collaborative Studies, 1995, pp. 23-51. (AOAC INTERNATIONAL. AOAC ресми эдютержж багдарламасы, Эз1рлеу, зерделеу, карау жэне бемту npoueci бойынша кауымдаскан соттар нускалыгы. IV бшнм, Б1рлескен зерттеулерге арналган нускаулык АОАС, 1995 ж., 23-51-бет).

[8]    AOAC SMPR 2011.005, Standard Method Performance Requirements for Vitamin В12 in infant formula and Adult/Pediatric Nutritional formula (AOAC SMPR 2011.005, Балалардын тамактануына жэне ересектерге арналган коспадагы В12 витамнжне арналган стандартты эд1стердщ снпаттамасына койылатын талаптар).

[9]    КР СТ 2.79-2004 Казакстан Республикасынын Мемлекетт1к олшем б1рл!пн камтамасыз ету жуйес1. Шетел шыгаратын заттар мен материалдардын Kacnerrepi курамынын стандарттык улплер1 Колдануга руксат тэртзбг Жалпы ережелер

ООЖ 637.1:543.544.5:006.354    МСЖ    67.050

Туй1н,11 сезлер:    балалар    тамагына    арналган    коспа.    мононуклеотндтер,

нуклеотидтер, суйыктык хроматография, хроматограмма

НАЦИОНАЛЬНЫМ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

Смеси для детского питания

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НУКЛЕОТИДОВ С ПОМОЩЬЮ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФ!! И

СТ РК ISO 2063&-2016

И манне официальное

Комитет технического регулирования и метрологии Министерства по инвестициям и развит ню Республики Казахстан

(Госстандарт)

Астана

Предисловие

1    ПОДГОТОВЛЕН И ВНЕСЕН Товариществом с ограниченной ответственностью «Kazakhstan Business Solution» (Технический комитет по стандартизации ТК 91 «Химия»)

2    УТВЕРЖДЕН II ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Председателя Комитета технического регулирования и метрологии Министерства по инвестициям и развитию Республики Казахстан от № 296-од от 23 ноября 2016 года

3    Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 20638:2015 Infant formula Determination of nucleotides by liquid chromatography (Смеси для детского питания. Определение содержания нуклеотидов с помощью жидкостной хроматографии)

Международный стандарт разработан Техническим комитетом 1SO/TC 34 «Пищевые продукты» совместно с ассоциацией АОАС INTERNATIONAL

Перевод с английского языка (еп).

Официальный экземпляр международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий национальный стандарт и на которые даны ссылки, имеется в Едином государственном фонде нормативных технических документов

Официальной версией является текст на государственном и русском языке

Степень соответствия - идентичная (IDT).

4    В настоящем стандарте реализованы нормы законов Республики Казахстан «О техническом регулировании» от 9 ноября 2004 года № 603-11, «О языках в Республике Казахстан» от 11 июля 1997 года № 151-1

5    СРОК ПЕРВОЙ ПРОВЕРКИ ПЕРИОДИЧНОСТЬ ПРОВЕРКИ

6    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Нормативные документы по стандартизации», а текст изменений и поправок в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты»

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен без разрешения Комитета технического регулирования и метрологии Министерства по инвестициям и развитию Республики Казахстан

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

Смеси для детского питания

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НУКЛЕОТИДОВ С ПОМОЩЬЮ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Дата введения 2018-01-01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод количественного определения содержания 5-мононуклеотидов в адаптированных или частично адаптированных начальных или последующих молочных смесях в твердых (т. е. порошки) или жидких (т. е. готовые к употреблению жидкости и жидкие концентраты) формах с помощью жидкостной хроматографии,

2    Термины и определения

В настоящем стандарте применяются следующие термины с соответствующими определениями:

Адаптированные или частично адаптированные начальные или последующие молочные смеси (infant formula): Искусственный заменитель грудного молока, специально изготовленный для удовлетворения потребности младенцев в питании в течение первых месяцев жизни до использования соответствующего прикорма (согласно Стандарт Кодекса 72-1981 [1]).

3    Сущность метода

Пробу растворяют в растворе с высоким содержанием соли для ингибирования взаимодействия белка и жира. 5-мононуклеотиды - уридин-5-монофосфат (UMP), инознн-5-монофосфат (IMP), аденознн-5'-монофосфат (АМР), гуанознн-5-монофосфат (GMP), и цитидин-5-монофосфат (СМР) - выделяют из отобранной пробы путем твердофазной экстракции (SPE) с сильным анионообменным носителем с последующим хроматографическим исследованием с использованием С18 неподвижной фазы с градиентным элюированием. UV-детектированием и количественном анализом по внутренней стандартной методике с использованием тимиднн-5'-монофосфата (ТМР) [2].

4    Реагенты и вещества

Во время исследования, если не указано иное, используют реагенты известной аналитической степени чистоты и дистиллированную или деминерализованную воду, или воду эквивалентной степени чистоты.

Издание официальное

Л.1ГЫС01

1    «Kazakhstan Business Solution» жауапкериллт uieicreyni cepikTecriri (TK 91 «Химия» стандарту бойыншатехникалыккомитет)ДАЙЫНДАП ЕНГ13Д1

2    Казакстан Республнкасы Инвестициялар жэне даму миннстрлт Техникалык реттеу жзне метрология комитет! Терагасынын 2016 жылгы 23 карашадагы № 296-од б^ирыгымен БЕКТПЛ1П КОЛДАНЫСКА ЕНГ131ЛД1

3    Осы стандарт ISO 20638:2015 Infant formula Determination of nucleotides by liquid chromatography (Балалардын тамактануына арналган коспалар. Суйыктык хроматография кемепмен нуклеотид мелшерш аныктау) халыкаралык стандартына сэйкес келедг

Халыкаралык стандартты АОАС INTERNATIONAL кауымдастыгымен б1рлесш ISO/TC 34 «Тамак ежмдерЬ техникалык комитеп .тйрледг

Агылшын тшнен ауларылган (еп)

Осы улттык стандарт халыкаралык стандарттын реемн нускасы непз1нде эз1рленд1 жэне осында бермген алтсмслер Норматив™ техникалык кужаттардын б1рынгай мемлекетпк корында бар.

Мемлекетпк жэне орыс ттлдерЫдеп мэтж реемн болып табылады

Сэйкеспк денгейп - бiрдей (IDT).

4    Осы стандартта Казакстан Республикасынын «Техникалык реттеу туралы» 2004 жылгы 9 карашадагы № 603-11, «Казакстан Республикасындагы -плдер туралы» 1997 жылгы 11 mi л деде п № 151 Зандарынын нормалары icKe асырылды

5    ЫРН1Ш1 ТЕКСЕРУ MEP3IMI    2023    жылы

ТЕКСЕРУДЩ КЕЗЕНД1Л1Г1    5 жыл

6    АЛГАШ РЕТ ЕНГ131ЛД1

Осы стандартна енггйлген озгерктер туралы аппарат «Стандарттау бойынша нормативппк н\ жаттар» алтеместде, at озгерк M.vniui «Мелиекетппк стандарттар» ан саиынгы аутраттын ЬлтемеЬнде жаршианады. Осы стандарт natima к/ецниган (жоиылган) немесе ауыстырылган жагдаида muiemi аппарат «МемлекеттЫ стандарттар» ацпараттын алтеместде жарияюнады.

Осы стандарт Казакстан Республнкасы Инвестициялар жэне даму миннстрлт Техникалык реттеу жэне метрология комитеп ж н руксатынсыз реем и басылым peri нде Казакстан Республнкасы аумагында толыктай немесе белшектелт басылым шыгарыла, кебейпле жэне таратыла алмайды

4 1 Стандартные растворы со степенью чистоты не менее 99 % (Sigma¹⁾ или эквивалент). Нуклеотидные соли натрия или гидраты солей натрия можно заменить, если формы свободной кислоты недоступны в продаже.

4.1.1    ТМР, тнмндин-5'-монофосфат, CAS-номер: 365-07-1.

4.1.2    АМР. аденозин-5’-монофосфат, CAS-номер: 61-19-8.

4.1.3    СМР, цитидин-5'-монофосфат, CAS-номер: 63-37-6.

4.1    4 GMP, гуанозин-5'-монофосфат, CAS-номер 85-32-5.

4.1.5    IMP, инознн-5'-монофосфат, CAS-номер: 131-99-7.

4.1.6    UMP, уриднн-5'-монофосфат, CAS-номер: 58-97-9.

4.2    Бромистый калий (КВг).

4 3 Дипшрофосфат калия (KH;POj)

4.4    Ортофосфорная кислота (Н3РО4).

4.5    Гидроксид калия (КОН).

4.6    Этнленднамннтетрауксусная кислота, двуводная двунатриевая соль (EDTA).

4.7    Хлорид натрия (NaCI).

4 8 Метанол (СН₃ОН).

4.9    Приготовление реагентов

4.9.1    Буферный раствор (КН2РО4, с = 0,25 моль/л, pH = 3,5). Растворить 34,0 г КН2РО4 (см. 4.3) в 900 мл воды и довести уровень pH ортофосфорной кислотой (см. 5.4) до 3,5. Разбавить до 1 л.

4.9.2    Экстрактный раствор (NaCI, с = 1 моль/л, EDTA с = 4 ммоль/л). Растворить

58,5 г NaCI (см. 5.7) и 1,5 г EDTA (см. 4.6). Развести в 1 л воды.

4.9.3    Отмывающий раствор (КВг. с = 0,3 моль/л). Растворить 3,6 г КВг (см. 4.2) в 100 мл воды.

4.9.4    Элюентный раствор (КН2РО4, с = 0,5 моль/л, pH = 3). Растворить 6,8 г КН2РО4 (см. 4.3) в 90 мл воды и довести уровень pH ортофосфорной кислотой (см. 4.4) до 3,0. Развести до 100 мл.

4.9.5    Подвижная фаза А (КН2РО4. с = 10 ммоль/л, pH = 5,6). Растворить 1,4 г КН2РО4 (см. 5.3) в 900 мл воды и довести уровень pH до (5,6 ± 0,1) с помощью раствора КОН (10 % м/об ). Развести водой до 1 л. Готовить ежедневно, так как при комнатной температуре часто происходит рост микробов в фосфатных буферах, которые содержат малое количество органического растворителя или совершенно его не содержат.

4.9.6    Подвижная фаза В, 100 %-ный метанол (см, 4 8).

4.10    Подготовка стандартных растворов

4.10.1 Исходные стандартные растворы, р приблизительно 1 мг/мл. Взять точную навеску 50 мг каждого 5'-монофосфатного нуклеотида в отдельные мерные колбы вместимостью 50 мл. Добавить 40 мл воды, перемешать до растворения и развести водой до нужного объема

4 10.2 Чистые стандартные растворы. Отмерить пипеткой 1,0 мл каждого исходного стандартного раствора (см . 4.10.1) в отдельные мерные колбы вместимостью 50 мл, развести стандартизирующим буфером до нужного объема (см. 4.9.1) и измерить поглощающую способность при соответствующем Х„,_лх для определения концентрации

'' Пример подходящего продукта, имеющегося в продаже. Данная информация приведена дтя удобства пользователей настоящего стандарта и не является подтверждением того, что данный продукт одобрен ISO и IDF. ')квивале1ггныс проду кты могут использоваться, если продемонстрировано, что они прико;1ЯТ к тем же результатам.

KPCT ISO 20638-2016

КАЗАКСТАН РЕСПУБЛИКАСЫНЫН УЛТТЫК СТАНДАРТЫ_

Балаларлын тамакгануына арналган коспалар

СУЙЫКТЫК ХРОМАТОГРАФИЯ КОМЕ ИМЕН НУКЛЕОТИД МОЛ ШЕРШ АНЫКТАУ

Енг iii.ii ен кут 2018-01-01

1    Колданылу саласы

Осы стандарт суйыктык хроматография кемепмен катты (ягни, у итак) немесе супы к (ягни, тутынуга лаПын суйыктык пен суйык концентратгар) турждеп балалардын тамактануына арналган коспадагы 5'-мононуклеотидтер мелшерж сандык аныктау эдюн белплейдг

2    Термнндер мен аныктамалар

Осы стандартта тиигп аныктамаларымен oipre мынадай термнндер колданылады:

Аданталган немесе жартмлай адапталган бастапкм немесе сонгы сут коспалары (infant formula): Ом1ржщ oipinmi айынан бастап Tiiicri тамакты колдану кужне дейпн (72-1981 [1] Стандарт Кодекс'ше сэйкес) тамактануда сзбилерд1н кажетт1л1пн канагаттандыру ушш арнайы дайындалган емшектеп сутпн жасанды алмастыргышы.

3    O.nci iH Maui

Сынаманы белок пен майдын езара эсерш басу yuiiH туздын жогары мелшер1 бар ер1т1нд1де epiTefli. 5'-мононуклеотидтер - урнднн-5-монофосфат (UMP), инознн-5'-монофосфат (IMP), аденознн-5'-монофосфат (АМР), гуанознн-5'-монофосфат (GMP), и цитидин-5'-монофосфат (СМР) -градие»ггп аласталган жылжымайтын фазанын С18 пайдаланып кейпннен хроматографнялык зерттеп куигп аннон алмасу тасыгышпен катты фазалык шайгындау (SPE), тимиднн-5'-монофосфатты (ТМР) пайдаланып iuiKi стандартты эд1етеме бойынша сандык талдау мен UV-детектнрлеу жолымен ipik-теу сынамасынан б©лед1 [2].

2 Реагенттер мен заттар

Егер езгелей жазылмаса, зерттеу кез1нде белпл1 аналнтпкалык тазалык денгейн бар реагенттер мен тазартылган немесе мннералсызданган суды немесе балама тазалык денгейн бар суды пандаланады

Реемн басылым

4.1    99 %-дан кем емес тазалык денгеш бар стандартты ертндшер (Sigma¹⁾ немесе балама). Егер ерк1н кышкыл niumui сатылымда болмаса. натрийдж нуклеотидты тузы немесе натрии тузынын гидратын ауыстыруга болады.

4.1.1    ТМР, тнмидин-5'-монофосфат, CAS-H6Mipi: 365-07-1

4.1.2    АМР, аденозин-5’-монофосфат, CAS-HeMipi: 61-19-8

4.1.3    CMP, цитидин-5'-монофосфат, CAS-HeMipi: 63-37-6.

4.1    4 GMP, гуанозин-5'-монофосфат, CAS-HeMipi: 85-32-5.

4.1.5    IMP, ннознн-5’-монофосфат, CAS-HeMipi: 131-99-7.

4.1.6    UMP, урнднн-5'-монофосфат, CAS-HeMipi: 58-97-9.

4.2    Бромды калий (KBr).

4.3    Калий дгидрофосфаты (KH2PO4)

4 4 Ортофосфор кышкылы (Н3РО4).

4.5    Гидроксид калия (КОН).

4.6    Этилендиаминтетра cipKecy кышкылы, кос сулы кос натрий тузы (EDTA).

4.7    Натрий хлоршй (NaCI).

4 8 Метанол (CHjOH).

4.9    Реагенттер дайындау

4.9.1    Стандарттаушы буфер (КН2РО4, с = 0,25 моль/л, pH = 3,5). 34,0 г КН₂Р0₄ (5.3 кара) 900 мл суда ерптп, ортофосфор кышкылымен pH денгешн 3,5-ке дешн жетюзу керек (5.4 кара) 1 л-ге дешн араластыру керек

4.9.2    Шагындау epi riнд1с1 (NaCI, с = 1 моль/л, EDTA с = 4 ммоль/л). 58,5 г NaCI (5.7 кара) жэне 1,5 г EDTA (4.6 кара) epiTy керек. 1 л суда араластыру кажет.

4.9.3    Шаятын epnituii (КВг, с = 0,3 моль/л). 3,6 г КВг (5.2 кара) 100 мл суда epiTy керек.

4.9.4    Элюентп epmtiai (КН₂Р0₄, с = 0,5 моль/л, pH = 3,0). 6,8 г КН₂Р0₄ (5.3 кара) 90 мл суда epiTy жэне pH денгешн ортофосфор кышкылымен 3,0-ге дешн жетюзу керек. 100 мл-ге дешн араластыру кажет.

4.9.5    Жылжымалы фаза А (КН2РО4, с = 10 ммоль/л, pH = 5,6). 1,4 г КН2РО4 (см. 5.3) 900 мл суда epiTy жэне pH денгешн (5,6 ±0,1) дешн КОН (10 % м/кел.) ертндюшн кемелмен жетюзу керек. 1 л-ге дешн сумей жетюзу керек. Белме температурасында органикалык ерлюштж азгана мелшер1 бар немесе мулдем жок фосфатты буферде микробтын ecyi жш орын алатындьисган кунделтт дайындайды.

4.9.6    Жылжымалы фаза В, 100 %-дык метанол (5.8 кара)

4.10    Стандартты ертнднн дайындау

4.10.1    Шамамен 1 мг/мл бастапкы стандартты ертн.щ р. Сыйымдылыгы 50 мл жеке елшеу кутысына 9poip 5’-монофосфатты нуклеотидтщ 50 мг дэл елшенд1с1н алады. 40 мл су косып, epiтенге дешн араластырады жэне кажетп келемге дешн сумей араластыру кажет.

4.10.2    Стандартты таза ертндг Сыйымдылыгы 50 мл жеке елшеу кутысына 1,0 мл 3poip бастапкы стандартты ертщиш (4.10.1 кара) тамшуырмен елшеп алып, кажет™ келемге дешн стандарттаушы буфермен араластырып (4.9.1 кара), нуклеотидтщ 3p6ip бастапкы стандартты ертндюшн шогырлануын аньпсгау учли сэйкес кез1нде жуту кабшетж елшеу керек 1-кесте мен кездерд! [2) жэне [3] кара

¹¹ Сатылымда бар колаПлы oniMiiiii y.nici Осы акиарат осы ста1иартгы пайлала11ушыларлыц катаПлылыты yuiiii Kc.rnpu.ii жэне осы ошмл1 ISO ма^ллаганына растау батып табылмайды. Егер олар сат НЭ1ИЖСГС алып катспн1Н корсстисс, ба;|ама отмлер паПл&таны.туы мумкш

1-кесте. Максимальные значения (JV-поглощення и коэффициенты и 5’-монофосфа ггы нуклеотндгер уинн эксгинкцнянын максималды млн

5'-монофосфатты нуклеотид	XnMK.HM	vi% ulcm
Аденознн-5'-монофосфат	257	428,6
Цнтиднн-5'-монофосфат	280	390,9
Гуанознн-5'-монофосфат	254	392,0
И нозн н-5'- монофосфат	249	356,5
У риднн-5'-монофосфат	262	312,7
Тимнднн-5'-монофосфат	267	288,5

4.10.3    IiuKi стандартты ертшй, р шамамен 80 мкг/мл. 4 мл бастапкы стандартты сртндж1 ТМР (4.10.1 кара) 50 мл суда араластыру ксрек.

5.10.4    Шамамен 40 мкг/мл жумыстык стандартты epinwii р. Opoip бастапкы стандартты ертншш 2 мл тамшуырмен сынымдылыгы 50 мл елшем кутысына олшеп салады (4.10.1 кара) (AMP, CMP, GMP, IMP и UMP) жэне кажетп келемге дешн сумей араластырады.

5.10.5    КалнбреГтн стандартты ертндг КалнбрлеГгпн стандартты epinnai нуклеотидшщ номнналды шогырлануын алу уинн 2-кестеш кара

4.10.5.1    КалнбреГтн стандартты 1-ертндГ Сынымдылыгы 25 мл елшем кутысына тамшуырмен 0,25 мл жумыстык стандартты ертнд1ш (4.10.4 кара) жэне 1 мл iuiKi стандартты ертндЫ (4.10.3 кара) елшеп алу жэне кажетп келемге деГнн сумей араластыру керек

4.10.5.2    КалнбреГтн стандартты 2-ер1пнд1. Сынымдылыгы 25 мл елшем кутысына тамшуырмен 0,5 мл жумыстык стандартты ертшнш (4.10.4 кара) жэне 1 мл iuiKi стандартты ертшнж (4.10.3 кара) елшеп алу жэне кажетп келемге дешн сумей араластыру керек

4.10.5.3    КалнбреГтн стандартты З-ертндг Сынымдылыгы 25 мл елшем кутысына тамшуырмен 2 мл жумыстык стандартты ерткшж (4.10.4 кара) жэне I мл iuiKi стандартты ертшнж (4.10.3 кара) елшеп алу жэне кажетп келемге дешн сумей араластыру керек

4.10.5.4    КалнбреГтн стандартты 4-ертндг Сынымдылыгы 25 мл елшем кутысына тамшуырмен 5 мл жумыстык стандартты ертндж1 (4.10.4 кара) жэне I мл iuiKi стандартты ертшйж (4.10.3 кара) елшеп алу жэне кажетп келемге дешн сумей араластыру керек.

2 -кесте. Калибрлейтш стандартты ергпндшщ номнналды шо( ырлануы

КалнбрлеГгпн	Эр нуклеотидпн шогырлануы:	ТМР шогырлануы.
стандартты ертнд1	AMP, CMP, GMP, IMP жэне UMP, мкг/мл	мкг/мл
1	0,4	3,2
2	0,8	3,2

2-кестенщ жалгасы

Калнбрлейтж стандартты epmuoi Эр нуклеотид-пн шогырлануы: AMP, CMP, GMP, IMP жэне UMP, мкг/мл ТМР шогырлануы, мкг/мл 3 3,2 3,2 4 8,0 3,2

5 Жабдык

Стандартты зертханалык ьщыс пен жабдык, этап айтканда мыналар

5.1    Соргымен, 50 мкл ммекп мелшерлепин бар у^лг*^леР мел шерле ri mi мен, дегазатормен жэне фотодиодты матрицамен жаракталган HPLC жуйесг

5.2    Ваган С18, Gemini⁰ С18, 5 мкм, 4,6 мм * 250 мм (Phenomenex^l>).

5.3    Спектрфотометр. уирден кеш и 3 белпге дешн санауга кабшетп.

5.4    pH елшеуге арналган жабдык.

5.5    Центрифуга.

5.6    Центрифугалык сынауыктар, Amicon Ultra MWCO 3k, 4 мл (Millipore)⁰.

5.7    Полипропилен центрифугалык сынауыктар, сыйымдылыгы 50 мл.

5.8    Bip pern к шприцтер, сыйымдылыгы мл.

5.9    Ацетатцеллюлоза мембранасы бар 0,2 мкм шприц сузлштер.

5.10    SPE арналган вакуумды жннагыш.

5.11    Кушп анион алмасатын полипропилен SPE картридждер, 6 мл ^х 1000 мг, Chromabond SB⁰.

5.12    Сузпш аракабырга, 0,45 мкм, полиамида.

Ескертпе. Ьарлык салыстырып тсксеру куралдары ca.iuci ырып тексерыугс/калибрлс11у1с (а!тсстаттал\та) тик жэнс колданысташ салыстырып тскссру/калибрлсу (аттсстаггау) ссртфикагтар (кулмкигр) жэнс/нсмссе калнбрлсу бспгиерпнн салысгырын тсксеру гацбасынык oc.inci болуia, ал стандартты улплер колданута ж1бершугс жэнс [9J сэйкес KI* МОЖ тпшмше енп-йлугс тшс.

6 Улплердв данындяу

a)    Ашканга дешн улпге арналган контейнерд1 шайкау немесе араластыру керек.

b)    10 мл тутынуга дайын/балалар тагамына арналган суйык сут копасын немесе 1 г унтактын дол елшендюн алый, сыйымдылыгы 50 мл ушрткд сынауыгына салады.

c)    30 мл шайгын ертндюн косу керек (4.9.2 кара).

d)    1,0 мл iuiKi стандартты ертндюн косу керек ТМР (4.10.3 кара).

e)    сынауыкты жабу жэне унтактолык epireHuie алюп, араластыру керек.

0 толык гидратацияны камтамасыз ету ушж улпш 10 минутка калдыру керек.

g)    сонгы колемге дешн шамамен 50 мл суды араластыру кажет.

h)    крахмал непзждеп ешмдер ушж 2 * 4 мл дайындалган улпш ек\ жеке ультра ушртю сынауыгына салып, 60 минут бойы 3500 г кезжде ушртюлеу жэнс ем сынауыкган сузглген cpi riнл1 Hi 6ipiicripy кажет.

¹¹ Сатылымда бар колайлы oiiimhih ynrici. Осы акпараг осы стандартты найдаланун1ылардын колаПлылы! ы унии Kcrripi.ni жэнс осы ошм;и ISO макулдаганмна растау болып табылмайды. Егер олар сол нэшжсгс алии кстстннн керссплое, 6a.ia.Ma ешмдер пайдаланылуы му.мкж.

7 Сынок журпзу

7.1    Шыгару

Шыгарулын барлык процедурасында картриджге кургак жумыс iereyre жэне тегуд1 картридж Heri3inin устшп белтне жузеге асыруга мумкшдш бермеу керек.

Картриджд1 тегу кезшде агын жылдамдыгы 2 мл/минуттан кем болмауга тшс.

a)    эр улп ушш вакуумды жинагышта 6ip SPE картриджд1 салу керек;

b)    4 мл метанол косып жэне кеншнен 2 есе су мелшерш косып (эр жолы 5 мл) жэне картридж непзшш устшп белтне тегуд1 жузеге асырып бага иды устау керек,

c)    улп Hi н 4 мл ертцшсш картриджге жуктеу жэне картридж непзшш устшп белтне тегуд1 жузеге асыру кажет;

d)    4 мл шаю ертндюмен езара байланысты жою ушш картриджд1 жуу (5.9.3 кара) жэне картридж непз1н1н успнп бел1пне тегуд1 жузеге асыру кажет;

e)    SPE уиин жинагышта улпш жинау ymin сынауыкты салу керек;

0 улпн1 тегуге арналган сынауыктагы 4 мл аластау ертшианщ нуклеогидтерд1 аластау (5.9.4 кара) жэне картриджд1 толыктан кегтпру керек;

g) автоматты сынама жинау туппнде кеуепшн елшека 0,2 мкм шприц сузпшпен шамамен 2 мл элюент аликвотасын сузу кажет.

7.2    Хроматография

а) 3-кестеде бер1лген процедура кемепмен нуклеотнлп бел1п жогары емес кысымиын А жэне В жылжымалы ею фазасын араластыру жолымен градиенттер курау.

3-кесте. Хромаroi рафия.ii>iк белуге арналган гра/дненттi процедура

Уакыты, мин Агыннын жылдамдыгы, мл/мин Жылжымалы фаза А, % Жылжымалы фаза В, % 0 0,6 100 0 25 0,6 80 20 26 0,6 100 0 40 0,6 100 0

b)    Сандык аныктау уш1н толкыннын теменде бер1лген узындыгы кезшде хроматограммамен фотоднодты матрицамен акаугапкы кемеНмен 210 нм жэне 300 нм арасындагы спектральд1 деректерд1 алу керек.

1)    IMP: 250 нм кезшде толкын узындыгы.

2)    AMP, GMP жэне ТМР: 260 нм кезшде толкын узындыгы.

3)    СМР и UMP: 270 нм кезшде толкын узындыгы.

c)    40 °С температурага батана термостатын белплеу керек.

Хроматограмма улпа А косымшасында бер1лген

8 Есептеу

8.1 Стандартты таза epiTinflifle (4.10.2 кара) эр нуклеотид тазалыгынын папызын есептеу керек (бос кышкыл турпше). мына формуланы пандаланып (1):

Тазалыгы,% =    _x    —    x    -    x    1000,

mSS 1

мундагы AbSxmax - толкыннын макснмалды узындыгы кезшде УФ-жутылуы;

Е}* -нуклеотид ушш экстинкциянын шогырлануы;

mSS - бастапкы стандартты ертндшеп нуклеотидтер шогырлануы, мг;

50 - бастапкы стандартты сртндшщ жалып келсмк мл;

50 - таза стандартты ертнджш жалпы келемк мл;

1 - стандартты таза ертшйге косылган бастапкы стандартты ертшн келемк мл;

1000 - массанын мг-нан г-ra турленуг

8.2    бастапкы стандартты ертндщеп нуклеотидтер шогырлануын есептеу керек (SS) (4.10.1 кара), мына формуланы паПдаланып (2):

55(мкг/мл) = ^x^xlO³,    (2)

мундагы mSS - бастапкы стандартты ертндщеп нуклеотидтер шогырлануы, мг;

50 - жалпы колем SS, мл;

10³ - шогырланудын турлену1 (мг/мл-ден мкг/мл-га;

PS% - тазалык панызы;

100 -массанын турлен>ч (% -дан ондык санга дешн).

8.3    iuiKi стандартты ертндщеп ТМР шогырлануын есептеу керек (IS) (4.10.3 кара), мына формуланы паПдаланып (3):

/5(мкг/мл) = 55 х^,    (3)

мундагы 55 - бастапкы стандартты ертндщеп ТМР шогырлануы, мкг/мл;

4 - iujKi стандартты ертнддоге ТМР бастапкы стандартты ертшн колемк мл;

50 - iuiKi стандартты ертндщжж жалпы келем1, мл.

8.4    Жумыстык стандартты ертндщеп нуклеотидтер шогырлануын есептеу керек (WS) (4.10.4 кара), мына формуланы паПдаланып (4):

1У5(мкг/мл) =55х—.    (4)

мундагы 55 - бастапкы стандартты ертндщеп нуклеотидтер шогырлануы, мкг/мл;

2 - жумыстык стандартты ертндщеп бастапкы стандартты ертнд1 нуклеотидтержж келемк мл;

50 - жумыстык стандартты ертнджж жалпы келемк мл.

8.5    калибрлеуип стандартты ертндщеп шогырлануды ТМР есептеу (CS) (см. 4.10.5), мына формуланы паПдаланып

С5(мкг/мл) = /5х^,    (5)

мундагы /5 - 1шю стандартты ертндщеп нуклеотндтердж шогырлануы, мкг/мл;

1 -калибрлеуип стандартты ертндщеп 1S келемк мл;

25 - калибрлеуип стандартты ертнджж жалпы келем1, мл.

8.6    калибрлеуил стандартты ертндщеп нуклеотидтер шогырлануын есептеу керек (CS) (4.10.5 кара), мына формуланы паПдаланып (6):

С5(мкг/мл) = WS х ^,    (6)

мундагы WS - жумыстык стандартты ертндшеп нуклеотидтер шогырлануы, мкг/мл;

V_ws - калибрлеуий стандартты ертндшщ жумыстык стандартты epiTin,iiniit келе\п, мл;

25 - калнбрлеуии стандартты ертндшщ жалпы келем1, мл.

8.7    Калибрлеуий стандартты ертшй уийн шогырланулар катынасына (нуклеотнд/ТМР, ось х) карай шын ауданына катынасы (нуклеотнд/ТМР; ось у) уиин сызыктык регрессия кисыгын аныктау жоне координат басы аркылы осьпен кпылысатын кеашймен ewicTi есептеу керек.

8.8    Осы калнбрлеу кнсыгынын белпаз улпсшдеп нуклеотид мелшерш интерполяциялау керек.

а) кургак ежмдер уийн:

Нуклеотид, мг/100 г = ^ х х    х

^}    '    A,_s    L    т,    1000

(7)

Ь) тутынуга даиын суйыкгыктар уийн:

Нуклеотид мг/100 г = ^ _х I хх

^}    **    '    Л/s    L    V_s    1000

(8)

мундагы A_nt - улпдеп нуклеотид шынынын нуктеск Л,5 - улпдеп ТМР шын ауданы;

1. -калнбрлеу кнсыгы емк ий и сызыктык регрессия;

C,_s- улпге косылган imxi стандартты ертндшщ шогырлануы, мкг/мл;

V_IS - улНге косылган iuiKi стандартты ертндшщ к еле Mi, мл; m_s - улпнщ массасы, г;

V_s - улпнщ колем!, мл;

100 -массанын немесе нэтнже келемшщ турлену1 (100 г-да г-нан немесе 100 мл-ге мл-ден);

1000    -    нэтиже    массасыныц турлену!' (мкг-нан мг-fa).

9 Нагижелер

Нэтижелер упрден кешн 6ip белпге дешн мг/100 г немесе мг/100 мл-мен жазылады.