Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

48 страниц

Купить РД 39-3-897-83 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку "Купить" и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Методика разработана в целях изучения бактерицидной активности химических реагентов с различной растворимостью в воде и подбора химических бактерицидов для опытно-промышленных испытаний; выявления среди реагентов, применяющихся при добыче нефти, соединений, которые являются бактерицидами или, наоборот, стимуляторами роста сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ) и других микроорганизмов; поиска эффективных бактерицидов среди веществ биологического происхождения

 Скачать PDF

Оглавление

1 Общая часть

2 Определение бактерицидной активности химических реагентов с различной растворимостью в воде

3 Проведение испытаний бактерицидной активности химических реагентов

4 Проведение испытаний бактерицидной активности веществ биологического происхождения (антибиотиков)

5 Заключение

6 Техника безопасности

7 Литература

Приложение 1 (рекомендуемое). Приготовление питательной среды для СВБ т отбор проб нефтепромысловой воды

Приложение 2 (рекомендуемое). Приготовление питательных сред для аэробных бактерий гетеротрофов

Приложение 3 (рекомендуемое). Среда для накопительной культуры углеводородокисляющих бактерий

Приложение 4 (рекомендуемое). Стерилизация питательных сред, посуды и материалов и отбор проб нефтепромысловой воды

Приложение 5 (рекомендуемое). Определение количества бактерий в исходной пробе

Приложение 6 (рекомендуемое). Хранение бактериальных культур под минеральным маслом

Приложение 7 (рекомендуемое). Определение общей и биологической концентрации микроорганизмов (БК) в исследуемой пробе

Приложение 7 (рекомендуемое). Определение сероводорода

Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18
Стр. 19
стр. 19
Стр. 20
стр. 20
Стр. 21
стр. 21
Стр. 22
стр. 22
Стр. 23
стр. 23
Стр. 24
стр. 24
Стр. 25
стр. 25
Стр. 26
стр. 26
Стр. 27
стр. 27
Стр. 28
стр. 28
Стр. 29
стр. 29
Стр. 30
стр. 30

МЕТОДИКА ИСПЫТАНИЙ БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ РЕАГЕНТОВ С РАЗПИЧНОЙ РАСТВОРИМОСТЬЮ В ВОДЕ РД 39 3-897-83

1983


УТВЕРЖДАЮ

Заместитель Министра медяной промилле н вое ти

у MV^^Mhfrt>eBcRH й " Of ОЯ* 1963 г.

МЕТОДИКА

ИСПЫТАНИИ Б1КГВРИШШЮ.1 АКТИВНОСТИ РЕАГЕНТОВ С РАЗЛИЧНОЙ РАСТВОРИМОСТЬ!) В ВОДЕ

РД 39-3-897-Ю

НАСТОЯШИ ДОКУМЕНТ РАЗРАБОТАН:

Н. С. Мари нин

Сибирским научно-исследовательским институтом нефтяной промдалеччости (Сибниинп)

Зам.директора но научной работе в области добычи нефти, к.т.н.

Ответственный исполнители:

Б.Б.Банзаракцаев

Зав.сектором микробиологических исследований отдела техники и технологии добычи нефти и газа, к.б.н.

СОГЛАСОВАНО:

Начальник Технического управления Миннефтепрома

Начальник управления по добыче нефти и газа Главтше нне^те газа

Туда же вносят по 2-3 мл нефтепромысловой воды, 8ершенной баж-тержлии; прооирки закрывают ьатныьд пробками и помешают в термостат при температуре 30°С на 7 сут. Мя испытаний реагентов используют пятичиастисуточную лаборато1«ую культуру гетеротрофные бактерий, выделенную из нефтепромысловой воды ■ поддерживаемую периодическим переоевои на скошенную ГЩПО в пробирке (роз в 2-3 месяца) и хранящуюся под слоем стерильного технического вазелина [5] (приложение 6).

Для испытания используется 1-5 млн. клеток бактерий и 1 ш воды, определенных методом, приведенным в приложении 7< Следует отметить, что количество клеток бактерий гетеротрофов устанавливается для опытов По д я предварительных исследований ыефтепрошиловых вод.

Выделение накопительной культуры н 3 р о о и j X углеводородокисляющи бактерий (У ОБ)

2.17. Накопительная культура УОБ выделяется по методике [4] (приложение 3).

3. ПРОЬЩаШБ ИСШТАНИа ШТВРИШШЮЙ АКТИВНОСТИ 1ЖШ РйАГШОВ

Иооытанин на накопительной культуре О Ь В

3*1. Выдержка (контактирование) испытуемого реагента с лиеткаыл СПБ

3*1.1. В ряд ьариироьатшж пробирок иавестиого обьема (20-26 ш) Наливают по 10 мл кипяченой и охлажденной пресной воды.

3.1•£« Накопительную культуру СЬй, находящихся в оугилочке или пробирке; тщательно перемеаиаегт, выдерживал до оседания

осанка сульфидов, отбирают стерильной пипеткой жидкость над осадхом, в которой определяют количество клеток в I мл методом разведения исходной пробы или фильтрования на мембранном фильтре (приложение 5).

Из раствора, содержащего клетки СВБ (10s клеток в I мл раствора), отбирают стерильной пипеткой но 0,6 мл и вводят в каждую пробирку о пресной водой и дозируют туда же эмульсию (илж суспензию) испытуемого реагента с таким расчетом, чтобы концентрация его в пересчете на объем пробирки составляла 200, 150, 100, 50 мг/л {можно брать и другие желаемые концентрации). Затем пробирки закрывают стеклянными притертыми или резиновыми пробкам без пузырьков воздуха, выдерживают при температуре 20-22°С от 2 до 24 ч.

3.2. Разделение клеток СВБ от бактерицида

3.2.1.    При разделении бактерицида (хорошо растворимого в воде) от цроконтактировавших о нам клеток СВБ поступах>т следующим о.разом. По истечении времени контактирования стерильной пипеткой отбирают из пробирок по 5 мл жидкости и переносят на мембранные фильтры (ом.приложение 5, п.2-5). Осадок (бактерии) на фильтрах промывают 2-3 раза пресной стерильной водой путем ее фильтрования через фильтр о осадком.

3.2.2.    Разделение бактерицида (плохо растворимого в воде) от СВБ проводят следущим образом.

После выдержки (контактирования бактерицида с СВБ) стержль-кы!пИ пипетками отбирают из про$к по 5 мл жидкости, переносят в стерильные центрифужные пробирки, которые закрывают ватныь« пробками. Затем растворы бактерицидов с клетками СВБ дважды центрифугируют в течение 20-30 кин при 800-1000 об/мин в целях осаждения клеток СВБ и их промывания. Прокалвание производят еле-

линиям образом. После разового двадцатм-тркдцатмгкьутного цен три-фугирования растворов бактерицида с клетками СЬБ верхнюю часть раствора в пробярко сливают иди отбирают стерильные ишрицеы ■ снова доливают восстановленной средой до цервоначального уровня. Затем центрифугирование раствора повторяется.

Коли раствор состоит из мельчайших суспензированных твердых веществ, то необходимо эти частицы вначале осадить легким центрифугированием в течение 1-3 мин при 5L0-700 оборотах в минуту. Затем верхнюю часть жидкости надо слить в другую стерильную центрифужною пробирку и осаждение клеток бактерий производить, как описано выше.

Коли же испытуемый реагент эмульгвропчы в воде и его удель-вый вес больше удельного веса воды, то его необходимо также осадить легким центрифугированием в течение 1-5 мин при 500-1000 оборотах ротора центрифуги в .лнуту. Дальнейшие операции производятся, как описано вше.

Когда удельный вес эмульгированного или суспензированного в воде реагента меньше удельного веса воды, поступают следующим образом. После окончания контактирования клеток СЬБ с реагентом раствор следует оставить на З-ti ч в покое. За это время мельчайшие пузырьки реагента всплывут на поверхность. Они удаляются стерильной пипеткой. Дальнейшая операция по разделению клеток СЬБ от частично растворенных в иоде кощоыентов исходного реагента производится, хаи описано вниз *

3.3. Определение степени подавления роста СЬБ бактерицидом

3.3.1. После двух-трехразового промывания осацка (СЬБ) на мемб|анних фильтрах аооледние переносят в стерильные маркированные пробирки фондированным пинцетом * Затем пробирки доливают питательной срепсй до верха, закрывают пробками и термостатвру-

ются при 32-35°С. Каждой концентрации соответствуют две парал-дельнь'е пробирки со средой. Две пробирки с питательной средой и культурой СВБ, не побывавшие в контакте с реагентом, являются контрольными.

За пробирками наблюдают в течение пятнадцати суток, отмечая ежедневно появление черной окраски. Эффективными считаются реагенты, не дающие потемнения или слегка окрашенные. Они отбираются для дальнейших заключительных испытаний. Ре агенты,вызвавшие интенсивное потемнение окраски среды за короткий период времени (по сравнению о контролем), также отбираются для дальнейших испытаний.

Через пятнадцать суток в пробирках определяют количественное содержание сероводорода и рассчитывают степень подавления по методике [i] (см. приложение 8).

3.3.2. Окончательные ьаводы о степени подагпения роста СВБ испытуемым реагентом делают после определения жизнеспособных клеток СВЬ методом кякроскопярования осадка на мембранных фильтрах ж посева их на плотную питательную среду (см. приложение 5, п.2-4).

После окончания фильтрования пробы и двух-трехреэового прокивания осадка на фильтре последние помещают на плотную питательную среду (среда П.стгейта с добавлением 2-3< выщелоченного агара, приложение 5, п.5.3) вниз стороной, на которой осаждены бактерии. Сверху фильтр заливают толстым слоем агара,охлажденного до 45°с. Испытания лучше проводить в глубоких чашгаис Коха.

Количество жизнеспособных клеток СВБ колониеобразугиие единицы (КОЕ) выражают в процентах по отношению к КОЕ в контроле (контроль-СВБ, не побывавшие в контакте с испытуемым реагентов) .

При r/лкроскопврованин осадка на ыембраыном фильтре и подсчете живых и мертвых клеток СББ следует иметь в виду, что СВБ обоих ролов(Нч.спорообразупцие г2)ми1{о\гСьгло н спорообразующие    fotomaco £vm) имеют вид прда.асс или изогнутых пало

чек 0,3-0 х 2-6 ним. Первые часто имеют изогнутые сшгрилловвд-ные клеткв, вторые - вздутые клетки веретенэобраз Л формы.Грам-отрнцательны, подвижны. Споры овальные или круглые, расположение субтермальное и терминальное. Жгутики полярные или перетри-хальные.

После окончания испытаний проводят статистическую обработку полученных данных одним из известных в микробиологии и токсикологии методом.

Испытания на промысловой воде, зараженной СВБ

3.4.    Бактерициды, показавшие положительный эффект ж реагенты, стимулирующие рост СВБ на накопительной культуре, испытывают непосредственно за свежевзятой промысловой Воде, зараженной СВБ.

3.5.    Промысловую воду отбирают в стерольпые маркированные кочбч емкостью IOC мк, при этом вытесняется несколько объемов поды, быстро дозируют в них спроделеиное количество приготовленного (как описало вале) испытуемого рергента с таким расчетом, чтобы концентрация его в пересчете на объем колбы составляло 5, 10, 25, 50... иг/л. Колбы закрывают стеклянными притертыми пробками без пузырьков воздуха ж выдерживают от 2 до 24 ч.

3.6.    После выдержки стерильными пипетками отбирается из колб по 5 мл ЖИДКОСТИ, переносятся в стерильные центрифужные пробирки для центрифугирования и также для фильтрования на мембранных фильтрах .Дальнейшие опеоецпл проводят так, как описано выше (см.п.З.1-3.3)•

Испытания реагентов на накопительной культуре аэробных гетеротрофных бактерий к нефтепромысловой в о д е,з а р а ж е н н о й бактериями

3.7.    Выдержка (контактирование) испытуемого реагента с бактериями.

3.7.1. Из накопительной культуры бактерий гетеротрофов, находящихся в пробирке с пептонно-дрожкевэй жидкой средой,отбирают 2-3 мд среды. Среду разбавляют стерильной пресной водой до концентрация в ней 1-5 млн. клеток бактерии в I мд вочы.Количество клеток в пробе опре еляется по методике, приведенной в приложении 7, Затем по 2 мл культуральной среды вводится в ряд >.яркированных стерильных колб объемом 100 ом9, заполненных кипяченой И охлажденной пресной водой (по 50 мд), и дозирует туда же испытуемый бактерицид в виде раствора, эмульсии иля суспензии. Колбы закрывают стерильными ватными араками, выдерживают ы ' термостате при температуре 28-30° С от 2 до 24 ч при постоянном первые1 здании на магнитных мешалках. До перемешивания сред стеклянные ампулы с металлическими магнитными стержнями пробиваются дистиллированной водой, высушиваются в стерилизуются над пламенем спиртовки.

3.8.    Способы разделения клеток бактерий от испытуемого реагента.

3.B.I. При разделении реагента (хорошо растворимого в зоде) от проконтактировавших о ним клеток бактерий поступают следующим образом. После выдержки реагента о бактериями в течение 2-24 ч стердльн^мг пипетками отбирают из колб по 5 мд жидкости, переносят на стеркльнке мембранные фйл;гри (сю.приложение 5,

а.2-5). Осадок (бактерии) на фильтрах проживают 2-3 раза пресной стерильной водой нутом ее фильтрования черва фильтр с бактериями.

3.8.2.    Другой способ разделения клеток бактерий от реагента заключается и осаждении бактерии центрифугированием среды, как описано ачше (см.раздел 32.) После видераки испытуемого реагента (хорояо растворимого в воде) отбирают из колб по 5 мд жидкости переносят в стерильные центрифужные пробирки, которые закрываются ватными пробками. Осаждение клеток центрифугированием производится дважды в течение 20-30 мин при 3000-5000 об/мин ротора центрифуги. Промывание клеток стерильной пресной водой производится следующим образом. После разового 20-30-минутного центрифугирования жидкости часть раствора и пробирке сливают или отбирают отеральным шприцем и пипеткой и снова доливают водой до первоначального уровня. Затем центрифугирование повторяетса.

3.8.3.    Разделение клеток бактерий от бактерицида, плохо растворимого в воде, проводят так же, как описано в разделе 3.2.2, с той лиль разницей, что осаждение с последующим промыванием клеток бактерий делают при 3000-5000 тыс. оборотов ротора центрифуги Ж минуту.

3.8. Определение степени подавления роста бактерий

3.9.1. После двух-трехраэоього промывания осадка (бактерии) на мембранных фильтрах, последние переносят в стерильные маркированные чашки Петри о плотной питательной средой (ШШС) вверх стороной, на которой осаждены оактерии. После инкубации посевного материала при температуре 38-30°С подсчитывают выросшие колонии бактерий через 24 ч i ни Третьи гутии. Степень подавления роста бактерий иопытуешк: бактерицидом выражают в процентах по отношению к контролю.Контроль-колбы о бактериями, не побывавши; .;! в контенте с бакТернцядоы.

3.9.2. После окончания осаждения клеток бактерии центрифугированием и прокывания в содержимое каждой пробирки определяют количество жизнеспособных клеток бактерии по методике,приведенной в приложении 7.

3.10.    Реагенты, показавшие бактерицидным эффект на накопительной культуре гетеротрофных бактерий,испытывают непосредственно на свежевзятой неф^етромлеловой воде, зараженной имж.

3.I0.I. Промысловую воду в объеме 50-60 мл отбирают в стерильные маркированные колбы емкостью 100 мл, которые закрывают отерильныьи ватными пробками (в целях доступа воздуха). В колбы с нефтепромысловой водой дозируется эмульсия (или суспензжя) испытуемого реагента с таким расчетом, чтобы концентрация его в пересчете на объем колбы составляла 5, 10, 25, 50 мг/л и т.д. После выдержки проводят разделение клеток бактерий от испытуемого реагента и определение степени подавления ростг бактерии одним из способов, описанных выше (п.3.7-3.10).

испытание реагентов на накопительной культуре аэробных уГлеводородокисляющих бактерий ж нефтепромысловой воде, зараженной У О Б

3.11.    Испытания на накопительной культуре УОБ ж промыслово! среде, зараженной ими, проводятся аналогично испытаниям реагентов на накопительной культуре аэробных гетеротрофных бактерий (п.3.7-3-10) с той лишь разницей, что в опытах используются УОБ, выращенные в минеральной среде (приложение 3) я на этой же среде с добавлением 2-3? выщелоченного агара. На внутренней поверхности крышки чашки Петри наносят 2-3 капли нефти, которую растирают стеклянным шпателем по поверхности, или чашки Петри с посев-

ным материалом    помещаются в эксикатор, на дно которого

заливается 100-200 мл нефти. Для испытании используют 1-2 мгя жизнеспособных клеток аэробных УОБ в I мл среды, определенных по методике, рекомендуемой в приложении 7.

4. ПРОВЕДЕНИЕ ИСШТАНИЙ БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВ БИОЛОГИЧЕСКОГО ШЮИСХОЗДЕЮЙ (АНТИБИОТИКОВ)

Сущность метода

4.1.    Метод основан на спхобностж двффундированного в агар антибиотика подавлять рост колоний оактерий. В микробиологической практике методом диффузии в агар определяют количество антибиотиков, продуцирующих микроскопическими грибами и другими микроорганизмами. Нам рекомендуется этот метод для определения бактерицидной активности антибиотиков, а также вводится в качестве контроля наиболее активный антибиотик, эффективность которого поиникается за 100£. Эффективность испытуемого соединения рассчитывается (в сравнении с контрольным) по формуле, приведенной ниже (раздел 4.2).

Испытания антибиотиков на накопительной культуре бактерий гетеротрофов

4.2.    На горизонтальную поверхность стола ставят стерильные чаики Петри одинакового размера. Расплавляют ЦЦПЛ в колбе,охлаждают до 50-55°С и вносят ее в эти чаппл.После застывания среды

в чашках в последние вносят 5-6 мл густой суспензии аэробных бактерий гетеротрофов, отобранных путем смыва со скошенной среды ШЛЮ в пробирках. Суспензию бактерии на поверхности среды в чашках Петри растирают стерильным стеклянным шпателем по всей поверхности сое ды. Затем чашкп погещают на бумажный трафарет, на

котором нанесены точка на расстоянии 2 см друг от друга, а над втнмв точками вырезают в агариэованной среде стерильный металлическим сверлом или стеклянной трубкой лунки. Агаровые столбики из сверла выталкиваются стеклянной палочной. Затем мккропипеткой вносится в лунки строго определенный объем раствора испытуемого реагента, подготовленного к анализу.

Каждую рабочую концентрацию раствора реагента вносят параллельно в две лунки. Б качестве контроля в две лунки вносится определенный объем раствора антибиотика, наиболее активного для данной культуры бактерии. Контрольные лунки делают в каждой чашке. Затем чашки помещают в термостат при температуре 23-30°С и через 24 ч измеряют (в мм) диаметры зон отсутствия роста бактерий вокруг лунок. Чашки при инкубации бактерий переворачивают крышкой вниз.

Средняя величина диаметров зон отсутствия роста бактерий вокруг лунок с раствором контрольного антибиотика берется за 100$. Эффективность испытуемых реагентов () рассчитывают по формуле:

$ (S) - J-^SQ_ .

а

где в - средняя величина диаметров зон отоутствия роста бактерий вокруг лунок с раствором испытуемого вещества,мь; а - средняя величина диаметров зон отсутствия роста бактерий вокруг лунок о контрольным антибиотиком, мм. Летальную концентрацию антибиотика определяют статистическим методом.

Испытания антибиотиков на накопительной культуре аэробных углеводородокисляхщих бактерик

4.3. Исцсльвуют тот же способ и к.етод расчета, описанный

Продолжение титульного диета Руководящий документ № 39 - 3-897-83

Заместитель начальника Управления по повышению нефтеотдачи пластов


В.Д.Москвин

выше (о.4.2), с той лишь ризницей, что в расплавленную плотную минеральную среду вносят 5-и мш смывы густой суспензии накопительной культуры углеводородсыжлыщил бактерии. На внутренние поверхность крышка чашки Петри наносят 3-4 капли нефти, которая затем размазывается стерильный шпателем.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5.1. Сравнительные испытания бактерицидной активности химических бактерицидов и веществ биологического происхождения рекомендуете.! проводить на одних и тех ко лабораторных накопительных культурах бактерии, выделении.: из нефтепромысловой виды.

Исоытыварь бактерицидную активность реагентов оциоаюшии метода»а ыожго также на чистых культурах отдельных видов оакте-ржя, выделенных известными в микробиологии методами 13,4.]

5.2.    Заключлтедыше лабораторные испытания отобранных бактерицидов необходимо проводить иа накопительной культуре бактерий, отобранных иа свежеьзятой нефтепромысловой воды того месторождения, где предполагаются их прогшиенные испытания. Минимальная лабораторная эффективная летальная концентрация выбранных бактерицидов уточняется (за 1-2 недели до проведения опытно-промышленных испытаний. ) на овежеоторбанной промысловой воде, зараженной бактериями. Это связано с изменением активности и величественного содержания бактерии в средахt где предполагается применить бактерицид, а Также о возможным отличием (по сравнению с Предыдущими анализами) хймческого состава заваливаемой

в нефтяной пласт воды.

Методика определения бактерицидной активности реагентов с различной растворимостью в воде на культуре микроорганизмов, выделенных из нефтепромысловой среды, основана на способах, позволяющих получать устойчивые диспергированные растворы испытуемых реагентов, увеличить возможность взаимодействия бактерий с реагентом, устранять воздействие их на клетки бактерий в пнтате.1ьной среде. В итоге повышается воспроизводимость опытов и их достоверность.

Настоящая методика делит применяться в отраслевых институтах и центральных научно-исследовательских лабораториях ыефте-добыващих предприятий Шпшефтепрома, занимающихоя додоором бактерицидов для опытно-промышленных испытаний. Методика разработана в секторе микробиологических исследований отдела техники в технологии добычи нефти Сибниинп. В ее разработке принимали участие отдел коррозии ШИЛ Главтетленяефтогаза, Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии.

Авторы: Б.Б.Банззракцнев, Л.С.Дьякова, В.М.Котляров,3.И.Кудряшова, Н.У.Минеева, Ю.В.Опарин, Л.И.Чириков, С.Н.Файзудлина,

О.Н.Таюиева.

СО) Сибирский научно-исследовательский институт нефтяной прокыолшшости (Сйбниинп), 1963

РУКОВОДЯЩИЙ ДОКУМЕНТ

МЕТОДИКА ИСШТАНИЙ БАКГЕРИЦЩНОЙ АКТИВНОСТИ геАГЙГГОВ С РАЗЛИЧНОЙ РАСТВОРМЮСТН- в воде

РД 39-3-697-83 Вводится впервые

Приказом Министерства нефтяной промышленности от 25,07,1983г. Я 395    Срок    введения    установлен с&цнвВ

Срок действия по 15.09.87 г.

I. ОБЩАЯ ЧАСТЬ

I.I. Методика разработана в соответствии с письмами Министерства нефтяной промышленности от II.04Л977. ЯНБ-2326 и Главтюменнефгегаза от 26.04Л977 0 013-4-62, а также решением Всесоюзного научно-технического семинара "Особенности заражения нефтяных пластов микроорганизмами, соверяенствование сио-тем подготовкГ'Ъля закачки ее в продуктивные пласты и методы борьбы с микробиологической коррозией (1980 г.)*, обяэывагшимк усилить микробиологический контроль за качеством воды, используемой в системах заводненения нефтяных пластов и подобрать бактерицид для ее обработки.

Предлагаемая методика разработана в целях: изучения бактерицидной активности химических реагентов с различной растворимостью в воде и подсоса химических бактерицидов для опытно-промышленных испытаний;

выявления среди реагентов, применяюинхоя при добыче нефти, соединений, которые являются бактерицидами влг9 наоборот, стимуляторами роста сульфатвосстанавливапаих бактерий (СВБ) и других микроорганизмов;

поиска эффективных бактерицидов среди веществ биологического происхождения (антибиотиков).

1.2. По рассматриваемому вопросу имеется два методических руководства fl,2j . Согласно им вначале готовится желаемая концентрация испытуемого химического бактерицида из 0,5 иди 1,0$ водного раствора. Затем бактерицид в течение определенного времени контактирует с клетками СЬБ, после чего клетки бактерии переносятся на питательную среду для инкубации в термостатирур-щнх условиях.

В вышеотмеченных руководствах имеются следующие методические недочеты, которые в процессе испытаний бактерицидов и других химических реагентов, nj меняющихся при добыче нефти,отрицательно сказываются на воспроизводимости g результаты их испытаний. Во-первых, невозможно приготовить желаемую концентрацию реагента, плохо растворимого в воде. Во-вторых, не учитывается фактор воздействия бактерицида на СЕВ в культуральной среде.

При отборе для посева клеток СВБ, проконтактировавших с бактерицидом, в питательную среду вместе с ними вносится часть раствора бактерици~э, который в какой-то мере продолжает воздействовать на рост и развитие СВБ в питательной среде. В зависимости от ei*o концентрации действие реагента в культуральной среде мо-хет быть различным, т.е. оно выражается в виде эффекта стимуляции или подавления роста СББ.

Руководствуясь данной методикой, можно испытывать реагенты с различной растворимостью в воде ж устранять воздействие испытуемого реагента в культуральной среде. Она является первых руководством для испытания бактерицидной активности химических реагентов не только на культуре сульфатвосстанавливащих бактерий (СЬБ), но и на культуре ав1>обны:: гетеротрофных микроорга-

нжзыоа и ут.чеводородокисмлхца бактерий. Кроив того, методика предусматривает испытания бактерицидной активности веществ биологического происхождения (антибиотиков).

2. (заддашк штЕРишиной шишости ашм&жих

«АГЕНТОВ G РАЗЛИЧНОЙ PACTbOhWOCTbjj Б ЬОДЕ Сущность метода

2.1.    Метод основан на приготовлении желаемой концентрации испытуемого реагента из 0,5 - 1)4-ыой водной эмульсии или суспензии, приготовленной методом ультразвуковой обработки s разделении клеток бактерий от ис1штуемо1\> реагента центрифугированием , осаждением и промыванием клеток бактерий мембранном фильтре.

Аппаратура, материалы, посуда, раствори испытуемых реагентов, накопите л ьная иультура бактерий, пробы нефтепромысловых сред

2.2.    Аппаратура:

ультразвуковой генератор УЗГ-З-04 с ванной очистки;

ыемграяыыь фильтры В 1 ямы Л 2;

центрифуга;

автоклав ила аппарат Коха; суховоздушшй с умильный шкаф; термостат,

2.3.    Материалы: пробки ватные; пробки резиновые.

2.4.    Посуда стеклянная:

жолбы ешюотъю 100 , 500, 1000 , 2000 мд; пипетки мерные емкостью I, 2, 5 см3;

пробирки бактериологические ■ центрифужные; нашем Летрм;

покровные в предметные стекла.

2.5.    Водные растворы испытуемых реагентов.

2.6.    Пробы нефтепролкуювых вод, зараженные бактериями вода сточная;

вода пресная;

вода шгастовая я нефть;

вода вэ призабойной зоны нагнетательных скважин.

2.7.    Питательная среда для СВЬ: среда Постгейта.

2.8.    Среда для аэробных гетеротрофов: пептсняо-дрожжевая жидкая среда (ЩЯС); пептонао-дрожжевая плотная среда (ШШС).

2.9.    Среда для аэробных углеводородокисляклшх бактервй: минеральная среда.

Подготовка реагентов к испытаниям

2.10.    Приготовление 0,3-ной или 1%-ной водной эмульсвж или суспензия:

аа аналитических весах отвешивают навеску испытуемого реагента, помещенную на оттарированное покровное стекло. Затем навеску реагента вместе с покровным стеклом переносят в колбу емкостью на 200-250 мл. В колбу приливают дистиллированную воду,объем которой доводят до 150-200 мл. Если реагент маслообразной консистенции и плохо растворим в воде, его эмульгируют ультразвуковой обработкой. Аналогично поступают, если реагент порошковидный и также плохо растворяется в воде. В том случае, корца испытуемый реагент хорошо растворим в воде ограничиваются обыч-

hhv встряхиванием колбы с содержимом или перемешиванием магнитной мешалкой в течение 1-2 минут.

Эмульгирование или суспензироваяие испытуемого реагента производят генератором ультразвука типа УЗГ-З-04 или другого типа до получения устойчивой эмульсии (суспензии). Обработку производят при частоте 19 кГц и мощности 400 Вт в еченне 10-60 минут. Например, время вкспозии для реагента Север-1 составляет 20-30 мин, в течение которого получается устойчивая водная эмульсия этого реагента.

Из приготовленной эмульсии (или суспензии) составляет несколько концентраций иопытуемого реагента в расчете на I литр воды. Причем одну концентрацию реагента (500 или 200 мг/л ■ тщ.) готовят мжню-г “м в четырехкратной повторности и используют немедленно охлажденной до комнатной температуры.

Приготовление питательных оред для бактерий

2.11.    Среду Постгейта для СВБ готовят согласно прбпяси, указанной в методике [i] (приложение I).

2.12. Среды ЦД1С и ЩЩС для аэробных бактерий гетеротрофов готовят согласно рецептуре, приведенной в приложении 2.

2.13.    Минеральную среду для накопительной культуры угле-яодородоюсляадж бактерий готовят по рецептуре, описанной в руководстве [4] (приложение 3).

Стерилизация питательных сред, посуды, материалов и отбор проб нефтепромысловой воды

2.14.    Производится согласно методическим руководствам [1,3,4] (приложение 4).

Выделение накопительной к у л ' туры СВБ

2.15.    Накопительную культуру выделяют из нефтепромясловой среды того месторождения, где предполагается использование бактерицида и другого реагента. Для этого из отобранной пробы промысловой среды стер’ътьным шприцем отбирают I мл воды и впрыскивают в пенициллиновую бутылочку, наполненную питательной средой, и тщательно перемешивают. Перед впрыскиванием пробы пенициллиновые сутылочхи, закрытые полиэтиленовой пленкой, протирают сшр-том. Для испытаний бактерицидной активности реагентов используют четырех- или пятисуточные культуры СЬБ после предварительного трехразового пересева на свежую питательную среду исходной лабораторной культуры, выделенной из нефтепромысловой воды и поддерживаемой периодически!, пересевом (раз в один месяц) на свежую питательную среду и хранящейся при температл» 1-5°С ( в холодильнике) .

Бутылочки с питательной средой после отбора пробы или пересева СВБ помещают в термостат при температуре 30-35°С на 4-5 суток. Для контроля стерильности питательной среды в каждом случае термостатчруют в тех же условиях две-три бутылочки со средой без добавления проьысловой воды или пересеваемой культуры СВБ.

Для испытаний используют водную среду, содеривдую СВБ в количестве 10^ клеток в I ил, определенных методом разведения или фильтрования исходной пробы (приложение 5).

Выделение накопительной культуры гетеротрофов

2.16.    Выделение накопительной культуры аэробных бактерий-гетеротрофов Производится следущп: образо?/. Готовят 50-100 ил ШШС, разливают в пробирки низким слоем (2/3 объема тюбиркж).