ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЯ

ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ

МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЙ ОПТИЧЕСКОЙ ПЛОТНОСТИ КУЛЬТУРЫ ВОДОРОСЛИ ХЛОРЕЛЛА (Chlorella vulgaris Beijer) ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ПИТЬЕВЫХ, ПРЕСНЫХ ПРИРОДНЫХ И СТОЧНЫХ ВОД, ВОДНЫХ ВЫТЯЖЕК ИЗ ГРУНТОВ, ПОЧВ, ОСАДКОВ СТОЧНЫХ ВОД, ОТХОДОВ ПРОИЗВОДСТВА И ПОТРЕБЛЕНИЯ

ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.10-04 Т 16.1:2:23:3.7-04

Методика допущена для целей государственного экологического контроля

МОСКВА (издание 2014 г.)

Право тиражирования и реализации принадлежит разработчику.

Методика рассмотрена и одобрена федеральным бюджетным учреждением «Федеральный центр анализа и оценки техногенного воздействия» (ФБУ «ФЦАО»).

Настоящее издание методики действует до выхода нового издания.

Заместитель директора ФБУ «ФЦАО»

Разработчик:

ФГАОУ ВПО «Сибирский федерал 660041, Красноярск, пр. Свободный, Телефон: (391)206-21-34 Факс: (391)244-86-25 E-mail: яг2897(а).ятаИ. сот

Полное или частичное тиражирование, копирование и размещение в Интернете и на любых других носителях информации данных материалов без письменного разрешения разработчика преследуется по ст. 146 Уголовного Кодекса Российской Федерации.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Назначение и область применения методики...................................................................2

1 Принцип методики..........................................................................................................2

2.    Требования к показателям точности измерений..........................................................3

3.    Оборудование, материалы, реактивы............................................................................4

3.1    Средства измерений.................................................................................................4

3.2    Вспомогательное оборудование..............................................................................4

3.3    Тест-культура, реактивы и материалы....................................................................5

4.    Условия безопасного проведения работ.......................................................................6

5.    Требования к квалификации лиц, проводящих биогсстирование...............................6

6.    Условия выполнения биотсстирования........................................................................6

7.    Подготовка к биотсстированию....................................................................................7

7.1.    Подготовка посуды для отбора, хранения проб и биотестирования....................7

7.2.    Отбор, транспортировка и хранение водных проб................................................7

7.3.    Подготовка водных проб к биотестированию.......................................................9

7.4.    Отбор, транспортировка, хранение проб грунтов и почв...................................10

7.5.    Приготовление водной вытяжки из грунтов и почв...........................................11

7.6.    Отбор, транспортировка и хранение проб осадков сточных вод, отходов

производства и потребления...........................................................................................13

7.7.    Приготовление водной вытяжки из осадков сточных вод, отходов производства

и потребления...................................................................................................................14

7.8.    Приготовление разбавлений исследуемых вод и водных вытяжек для

биотестирования..............................................................................................................16

7.9.    Приготовление тест-культуры водоросли...........................................................17

8.    Проведение биотестирования......................................................................................18

9.    Получение результатов и их обработка......................................................................19

9.1.    Снятие результатов токсикологического эксперимента.....................................19

9.2.    Величина токсичной кратности разбавления (ТКР)...........................................20

10.    Контроль погрешности методики токсикологического анализа.............................21

10.1.    Контроль качества культуры водоросли хлорелла............................................21

10.2.    Обработка (вычисление) результатов измерений (определений).....................22

10.3.    Оформление результатов измерений (определений)........................................22

10.4.    Оценка приемлемости результатов, получаемых в условиях

воспроизводимости..........................................................................................................23

10.5.    Контроль качества результатов измерений при реализации методики в

лаборатории......................................................................................................................23

Список литературы..........................................................................................................25

Приложение 1...................................................................................................................27

Приложение 2...................................................................................................................28

Приложение 3.....................................................................................................................

Приложение 4.....................................................................................................................

Приложение 5.....................................................................................................................

Приложение 6.....................................................................................................................

Приложение 7.....................................................................................................................

Приложение 8.....................................................................................................................

ПНДФТ 14.1:2:3:4.10-04    Редакция    2014    г.

Т 16.1:2:2.3:3.7-04

ФР. 1.39.2015.20001

НАЗНАЧЕНИЕ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДИКИ

Настоящий документ устанавливает методику определения токсичности проб вод (поверхностных пресных, грунтовых, питьевых, сточных) и водных вытяжек из грунтов, почв, осадков сточных вод, отходов производства и потребления по изменению оптической плотности тест-культуры зеленой протококковой водоросли хлорелла (Chlorella vulgaris Beijcr) в лабораторных условиях. Оптическая плотность тест-культуры водоросли после 22 часов роста измеряется с помощью фотоэлектроколориметра.

1. ПРИНЦИП МЕТОДИКИ

Методика основана на регистрации различий в величине оптической плотности тест-культуры водоросли хлорелла, выращенной на среде, не содержащей токсических веществ (контроль) и в тестируемых пробах вод и водных вытяжек (опыт), в которых эти вещества могут присутствовать. Измерение оптической плотности суспензии водоросли позволяет оперативно контролировать изменение численности клеток в контрольном и опытном вариантах токсикологического эксперимента, проводимого в специализированном многокюветном культиваторе. Критерием токсичности воды является снижение на 20% и более (подавление роста) или увеличение на 30% и более (стимуляция роста) величины оптической плотности культуры водоросли, выращиваемой в течение 22 часов на тестируемой воде по сравнению с ее ростом на контрольной среде, приготовленной на дистиллированной воде.

В экспериментах по определению токсического действия устанавливают токсичную концентрацию отдельных веществ или токсичную кратность разбавления вод и водных вытяжек, вызывающих снижение на 20 % и более или увеличение на 30 % и более величины оптической плотности тест-культуры водоросли по сравнению с контролем за 22 часа световой экспозиции.

Контроль качества культуры водоросли хлорелла проводится один раз в квартал. Он осуществляется посредством определения ее чувствительности к «модельному» токсиканту - бихромату калия (K2O2O7). При хорошем состоянии культуры водоросли и правильно поставленном эксперименте после 22 часов культивирования 50%-ное подавление прироста по сравнению с контролем должно наблюдаться в диапазоне концентраций бихромата калия (0,4-1,6) мг/дм³. При этом оптическая плотность культуры водоросли в контрольном варианте за этот период должна достигнуть величины 0,15±0,03.

ПНДФТ 14.1:2:3:4.10-04 Т 16.1:2:2.3:3.7-04 ФР. 1.39.2015.20001

2. ТРЕБОВАНИЯ К ПОКАЗАТЕЛЯМ ТОЧНОСТИ ИЗМЕРЕНИЙ

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значения метрологических характеристик результатов измерений не превышают значений, приведенных в таблице I.

Таблица I

Диапазоны измерений определяемой характеристики, значения показателей повторяемости и воспроизводимости

Диапазон измерений оптической плотности культуры водоросли хлорелла, единицы оптической ПЛОТНОСТИ	Показатель повторяемости (относительное среднее квадратическое отклонение результатов полученных, в условиях повторяемости). Or, %	Показатель воспроизводимости (относительное среднее квадратическое отклонение результатов полученных, в условиях воспроизводимости), а„.%	Предел повторяемости (относительное значение допускаемого расхождения между четырьмя результатами параллельных определений), г. %	Предел воспроизводимости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами, полученными в условиях воспроизводимости), R.%
от 0,05 до 0,2 включ.	S	13	29	36

Значения пределов повторяемости и внутрилабораторной прецизионности методики используют при:

-    оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;

-    оценке качества проводимых лабораторией измерений;

-    проверке приемлемости результатов единичных измерений при реализации методики в лаборатории. ¹

Редакция 2014 г

3. ОБОРУДОВАНИЕ, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

Для проведения исследований по данной методике необходимы следующие средства измерений, материалы и реактивы:

3.1    Средства измерений

-    фотоэлектроколориметр ИПС-03 (ТУ 4437-003-26218570-2006);

-    термометр цифровой «Замер-1» (ТУ 4215-002-13245171-01) или аналогичный;

-    мерный цилиндр на 25, 50 и 100 см¹ (ГОСТ 1770-74);

-    весы лабораторные общего назначения (ГОСТ Р 53228-2008);

-    гири (ГОСТ OIML R 11 М-2009);

-    pH-метр электронный любого типа, например, pH-420 (ТУ 4215-008-81696414-2007);

-    перестраиваемая автоматическая пипетка вместимостью 1-5 см¹ или стеклянные пипетки градуированные вместимостью I, 2, 5 и 10 см¹ (ГОСТ 29227-91).

3.2    Вспомогательное оборудование

-    многокюветный    культиватор    водорослей    КВ    М-05

(ТУ 3615-006-26218570-2007);

-    культиватор КВ-05 (ТУ 3615-006-26218570-2007);

-    центрифуга лабораторная с комплектом пробирок 50-100 см¹, скорость вращения ротора 4000-5000 об/мин;

-    холодильник бытовой, обеспечивающий замораживание (-20 ± 1) °С и хранение проб (от +2 до +4) °С;

-    аппарат универсальный для встряхивания жидкостей в колбах и пробирках АВУ-6С (ТУ 64-1-2451-78);

-    сушильный шкаф, любого типа, обеспечивающий поддержание температуры в диапазоне от (+40) до (+200) °С;

-    воронки лабораторные (ГОСТ 25336-82);

-    воронка Бюхнера (ГОСТ 9147-80);

-    стаканы стеклянные лабораторные вместимостью 100, 200, 250, 1000 см¹ (ГОСТ 25336-82);

-    сита почвенные (ТУ 46-47-885-73);

-    шпатели металлические (ГОСТ 19126-2007);

-    пробоотборник объемом 500-700 см¹ (ГОСТ 6859-72);

-    батометр-бутылка на штанге тип ГР-16М (ТУ 25-04-1749);

-    буры почвенные (ГОСТ 27753.1-88);

-    щупы винтообразные с продольным вырезом, поршневые (ГОСТ 2517-2012);

-    ножи почвенные (ГОСТ 23707-95);

-    лопаты (ГОСТ 19596-87); ²

ПНДФ т 14.1:2:3:4.10-04 Т 16.1:2:2.3:3.7-04 ФР. 1.39.2015.20001

-    склянки и банки стеклянные с винтовым горлом, с прокладкой и крышкой или с притертой пробкой для отбора и хранения проб вместимостью 500, 1000, 2000, 5000 см³ (ТУ 6-19-6-70);

-    флаконы и банки цилиндрические полиэтиленовые или политетрафторэ-тановые с навинчивающимися крышками для отбора и хранения проб и реактивов вместимостью 100, 250, 500, 1000,2000 см³ (ТУ 6-19-45).

3.3 Тест-культура, реактивы и материалы

-    культура зеленой водоросли Ch/ore/la vulgaris Bcijer, термофильный штамм, соответствующая критериям чувствительности к модельному токсиканту;

-    вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72);

-    калий двухромовокислый ХЧ или ЧДА (ГОСТ 4220-75);

-    калий азотнокислый ХЧ или ЧДА (ГОСТ 4217-77);

-    калий фосфорнокислый однозамещенный ХЧ или ЧДА (ГОСТ 4198-75);

-    магний сернокислый 7-водный ХЧ или ЧДА (ГОСТ 4523-77);

-    железо лимоннокислое Ч (ТУ 6-09-2562-77);

-    кислота борная ХЧ (ГОСТ 9656-75);

-    аммоний ванадиевокислый мета Ч или ЧДА (ГОСТ 9336-75);

-    марганец хлористый Ч или ЧДА (ГОСТ 612-75);

-    молибдена окись Ч (ТУ 6-09-4471-77);

-    цинка сульфат 7-водный ХЧ или ЧДА (ГОСТ 4174-77);

-    кислота соляная ХЧ или ЧДА (ГОСТ 3118-77);

-    натрия гидрооксид ХЧ или ЧДА (ГОСТ 4328-77);

-    фильтры бумажные обеззоленные «белая лента» (ТУ 6-09-1678-77, ГОСТ 12.026-76);

-    фильтры мембранные с диаметром пор 0,45; 3,5 мкм «Владипор» марки МФАС-ОС-2 (ТУ 6-55-221-1029-89), МФАС-Г1-4 (ТУ 6-55-221-903-88) или аналогичные зарубежного производства;

-    вата хлопковая медицинская гигроскопическая (ГОСТ 5556-81);

-    бинт марлевый медицинский (ГОСТ 1172-93).

Примечание:    допускается    использование    средств измерений,

вспомогательных устройств, реактивов и материалов другого типа. имеющиханалогичные метрологические и технические характеристики.

Редакция 2014 г.

4. УСЛОВИЯ БЕЗОПАСНОГО ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТ

При работе с химическими веществами, загрязненными грунтами, почвами, осадками сточных вод, отходами и сточными водами соблюдают требования техники безопасности по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.008-76.

При пробоподгоговке загрязненных грунтов, почв, осадков сточных вод и отходов пользуются средствами индивидуальной защиты по ГОСТ 12.4.016-83, ГОСТ 12.4.020-82, ГОСТ 12.4.034-2001.

К воздуху производственных помещений предъявляют санитарно-гигиенические требования по ГОСТ 12.1.005-88.

Безопасность при работе с электроустановками обеспечивают по ГОСТ Р 12.1.019-2009 и в соответствии с требованиями инструкций к оборудованию.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91, СИиП 21-01-97.

Рабочие столы и поверхности должны содержаться в чистоте. После завершения работ проводится влажная уборка рабочих поверхностей.

Работающий персонал должен пройти обучение безопасности труда по ГОСТ 12.0.004-90.

5. ТРЕБОВАНИЕ К КВАЛИФИКАЦИИ ЛИЦ, ПРОВОДЯЩИХ БИОТЕСТИРОВАНИЕ

К биотестированию допускаются специалисты, имеющие опыт работы в лаборатории, освоившие методические приемы водной токсикологии и уложившиеся в нормативы контроля при освоении методики.

6. УСЛОВИЯ ВЫПОЛНЕНИЯ БИОТЕСГИРОВАНИЯ

Биотестирование проводят в нормальных лабораторных условиях. Помещение не должно содержать токсичных паров и газов.

Температура окружающего воздуха в лаборатории должна быть в пределах от +17 до +27    °С,    атмосферное    давление    84-106    кПа

(630-800 мм.рт.ст.). Освещение помещения не ограничено особыми требованиями и может быть естественным или искусственным. К влажности помещения также не предъявляются особые требования.

6

ПНДФТ 14.1:2:3:4.10-04 Т 16.1:2:2.3:3.7-04 ФР 1.39 2015.20001

7. ПОДГОТОВКА К БИО ТЕСТИРОВАНИЮ

Перед началом работ по биотсстированию необходимо подготовить посуду, пробоотборники, места хранения отобранных проб. Подготовительные процедуры должны исключать попадание токсичных, органических и других веществ из окружающей среды в тестируемую воду или в водные вытяжки из грунтов, почв, осадков сточных вод и отходов.

7.1.    Подготовка посуды для отбора, храпения проб и биотесптрос.шшя

Отбор проб воды обычно производится в посуду из пластика, либо в банки из темного стекла в случае, если в воде содержатся нефтепродукты, хюкицие средства или пестициды.

Отбор проб грунтов, почв, осадков сточных вод и отходов следует производить в банки из темного стекла.

Посуда для отбора проб и биотестирования должна быть химически чистой. Ее промывают 10 %-ным раствором азотной кислоты. Стенки посуды сначала смачивают этим раствором, после этого оставляют на 2-3 часа и затем тщательно промывают водопроводной водой. Возможные остатки кислот нейтрализуют раствором пищевой соды, в заключении посуду 3-4 раза промывают дистиллированной водой. Сильно загрязненную посуду, а также новую посуду промывают водой, затем заполняют 10 %-ным раствором азотной кислоты и выдерживают не менее суток. После этого ее промывают раствором соды, водопроводной и несколько раз дистиллированной водой. Не следует использовать для мытья посуды хромовую смесь, синтетические поверхностно-активные вещества и органические растворители. Для сушки и стерилизации посуду, кроме мерной, помещают на один час в сушильный шкаф при 160±5°С. Если емкости могут разрушаться при температуре 160 °С, то их стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 121 ± 2 °С (10⁵ Па) в течение 20 мин.

7.2.    Отбор, транспортировка и хранение водных проб

Общие процедуры отбора проб вод, а также требования к устройствам для пробоотбора, определены в следующих нормативных документах (если условия, указанные в данных документах, противоречат требованиям настоящей методики, следует руководствоваться последней):

-    ГОСТ 31861 -2012 «Вода. Общие требования к отбору проб»;

-    ГОСТ 31862-2012 «Вода питьевая. Отбор проб»;

-    ГОСТ 17.1.5.05-85 «Охрана природы. Гидросфера. Общие требования к отбору проб поверхностных и морских вод, льда и атмосферных осадков»;

-    ГОСТ 17.1.5.04-81 «Охрана природы. Гидросфера. Приборы и устройства для отбора, первичной обработки и хранения проб природных вод. Общие технические условия»;

-    Р 52.24.353-2012 «Отбор проб поверхностных вол суши и очищенных сточных вод»;

7

Редакция 2014 г

- ПНД Ф 12.15.1-08 «Методические указания по озбору проб для анализа сточных вод».

Место отбора проб и периодичность отбора устанавливают в соответствии с программой исследования в зависимости от водного объекта (ГОСТ 31861-2012).

В зависимости от задач исследования определяют тип пробы: точечная, составная или другая в соответствии с ГОСТ 31861-2012.

Для проведения токсикологического анализа объем взятой пробы должен составлять не менее 500 см³.

Способы отбора, транспортировки, хранения, подготовки к выполнению биотестирования должны обеспечить неизменность состава проб в период между отбором проб и их анализом.

Пробы отбирают вручную специальными приспособлениями или с применением автоматических пробоотборников, при этом емкости для проб должны быть изготовлены из нетоксичного материала, легко выниматься из пробоотборника для очистки и мытья.

При отборе пробы с поверхности водоема или водотока используют стеклянную или полиэтиленовую бутыль (Р 52.24.353-2012).

Для отбора глубинных проб воды из озер, водохранилищ, прудов и рек следует использовать батометры.

Отбор проб питьевых вод перед поступлением в распределительную сеть осуществляется из кранов на водоводах, расположенных на входе в установку обеззараживания. Пробы воды распределительной сети отбирают в периоды наибольшего расхода воды (ГОСТ 31862-2012).

Водопроводную воду отбирают из-под крана после интенсивного слива, многократно ополоснув его отбираемой водой. Кран антисептической обработке не подвергается.

Отбор сточных вод следует производить в местах наибольшего перемешивания в той части потока, где взвешенные частицы распределены более равномерно. Очищенные сточные воды необходимо отбирать до их хлорирования.

Для проведения анализа сточных вод на токсичность предпочтительно отбирать составную среднесуточную пробу, собирая ее порциями с периодичностью один час. Точечные (разовые) пробы допустимо использовать только в исключительных случаях.

Пробы, предназначенные для исследования на токсичность, нельзя подвергать консервированию. Отобранные пробы наливают до краев в дважды промытые отбираемой водой банки или флаконы и закрывают без пузырьков воздуха пришлифованными стеклянными пробками или полиэтиленовыми крышками. Пробы упаковывают в деревянные ящики для переноски проб и прокладывают бумагой или ветошью. В жаркую погоду пробы для обеспечения лучшей сохранности рекомендуется транспортировать в контейнерах-холодильниках при пониженных положительных темперагурах. Зимой для предохранения проб от промерзания контейнеры должны быть оборудованы термоизолнрующими мро-

8

1

2