МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ГЛАВНОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ УПРАВЛЕНИЕ

«УТВЕРЖДАЮ» Заместитель Главного Государственного санитарного врача СССР А. И. ЗАЙЧЕНКО № 4050—85 от 6. 12. 85 г.

ПОСТАНОВКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ ПО ИЗУЧЕНИЮ ХАРАКТЕРА

КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ С ЦЕЛЬЮ

РАЗРАБОТКИ

ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ МЕРОПРИЯТИЙ

Методические рекомендации

МОСКВА, 1987 г.

В разработке методических рекомендаций принимали участие: Свердловский НИИ гигиены труда и профзаболеваний, Институт гигиены труда и профзаболеваний АМН СССР (г. Москва), 1 ММИ им. И. М. Сеченова, Всесоюзный НИИ гигиены и токсикологии пестицидов, полимеров и пластических масс, Львовский государственный медицинский институт, Криворожский НИИ гигиены труда и профзаболеваний, Новосибирский научно-исследовательский институт гигиены, Центральный институт усовершенствования врачей (ЦОЛИУВ), НИИ краевой патологии МЗК К аз ССР, Уфимский НИИ гигиены и профзаболеваний, Киевский НИИ общей и коммунальной гигиены.

Исполнители:

Кацнельсон Б. А,, Неизвестнова Е. МДавыдова В. ИБезель В. С., Балезин С. Л., Конышева Л. К.

Саноцкий И. ВУланова И. ПМельникова Н. НТимофиевская Л. А. Румянцев Г. И., Новиков С. М.

Каган Ю. ССветлый С. ССова Р. ЕРакитский В. Н.

Штабский Б. М., Федоренко В. ИШатинская И. ГМаменко А. К. Нагорный П. А.

Сперанский С. В.

Рощин А. В., Казимов М. А,

Ачтабаров Б. А., Айтабаев Т. X.

Карамова Л. М._л Максимов Г. Г.

Сватков В. И., Мудрый И. В., Слободской Д. С,

зом, на этапе 1). Выбор способа введения при специальном изучении механизмов комбинированного действия (этап IV) диктуется конкретными задачами такого исследования.

2.5.    Как правило, эксперименты по изучению характера комбинированного действия могут проводиться на тех же видах животных, которые регламентируются методическими указаниями, упомянутыми в п. 2.2, причем для комбинации веществ, ранее хорошо изученных, можно ограничиться на всех этапах одним видом, отличающимся наибольшей чувствительностью к действию наиболее опасного компонента. Однако, в тех случаях, когда анализ механизмов комбинированного действия указывает на его зависимость от тех или иных функциональных или метаболических особенностей определенного вида животных, заведомо не присущих либо существенно менее свойственных человеческому организму, вопрос о выборе биологического вида для наиболее адекватного экспериментального моделирования комбинированного действия должен рассматриваться специ-ал ьно с учетом указанных особенностей.

2.6.    Основной целью этапа 1 является предварительное ориентирование в характере комбинированного действия изучаемой комбинации с определением потенциально наиболее опасного количественного соотношения компонентов.

2.6.1. При выборе соотношения доз (концентраций) для количественной оценки летального эффекта изучаемой комбинации следует исходить из характера ранее изученной зависимости «доза-эффект» при изолированном действии компонентов, а также учитывать данные о типах и механизмах комбинированного действия ранее изученных структурно близких к ним соединений.

В случае равенства углов наклона прямых «доза-эффект» число изучаемых соотношений может быть ограниченным, и, в частности, близким к LD₅₀ для каждого вещества при изолированном воздействии, а для математического анализа типа действия может применяться метод Финни либо тот или иной из его вариантов, предлагавшихся различными авторами, например, по Ю. С. Кагану (см. приложение 1).

В случае неравенства углов наклона прямых «доза-эффект» для компонентов, входящих в комбинацию, а также при отсутствии соответствующей предварительной информации, исследование должно охватить весь диапазон соотношений между компонентами с предпочтительным использованием для математического анализа метода болограмм Леве либо множественного регрессионного анализа (см. приложение 1). Первый из названных методов реко-

9

мендуется использовать в модификации, предложенной Н. Н. Мельниковой и Л. А. Тимофиевской (см. приложение 2) с вероятностной оценкой зоны аддитивности.

Для успешного применения множественного регрессионного анализа важное значение имеет выбор уровней воз* действия компонентов. С этой целью рекомендуется использование методов математического планирования экспериментов, излагаемых в руководствах по математической статистике, а также в приложении 5.

При анализе результатов экспериментов в соответствии с определениями, приведенными в п. 1.6, оценка статистической значимости отличия наблюдаемого эффекта комбинированного действия от ожидаемого в случае аддитивности может производиться с помощью критерия хи-квадрат. При постоянном количественном соотношении компонентов изучаемой комбинации выявление и анализ зависимостей «доза (концентрация)-эффект» и «время-эффект» с оценкой соответствующих среднесмертельных величин и индекса кумуляции могут быть проведены также по способу предложенному Б. М. Штабским и соавт. (приложение 3)*

2.6.2.    Метод болограмм в модификации Н. Н. Мельниковой и Л. А. Тимофиевской может быть рекомендован также для планирования и математического анализа результатов эксперимента на уровне порогов острого действия, что позволит, в частности, определить на этом уровне то соотношение концентраций (доз) изучаемых веществ, при котором эффект комбинированного действия в наибольшей степени превышает аддитивный при статистически значимом отличии от него с учетом зоны аддитивности и коэффициента усиления. Это соотношение может рассматриваться как потенциально наиболее опасное.

2.6.3.    Наряду с этим, в определенных случаях порог острого действия изучаемой комбинации может находиться в экспериментах при однократном воздействии 3—4 концентраций (доз) этой комбинации при фиксированном соотношении компонентов, причем параллельно определяются пороги острого действия для входящих в комбинацию веществ при их изолированном воздействии. Каждому из этих порогов дается вероятностная оценка в соответствии с рекомендациями методических указаний, упомянутых в п. 2.2, причем статистически значимое отличие величины Lim_ac вещества, воздействующего в комбинации с другими, от соответствующего параметра, определенного по тому же самому функциональному показателю при изолированном воздействии, свидетельствует о соответствующем типе комбинированного действия.

Для оценки типа комбинированного действия на уровне

Ю

Little может быть использован также тот подход, который предложен ниже для соответствующей оценки на уровне Lim_Cb (см. п.2.8.3).

Следует учитывать, что этот тип может оказаться различным, в зависимости от того, по каким показателям интоксикации определяется величина порога. Подход к подобным случаям с позиций оценки определяющего типа комбинированного действия изложен в п.1.9.

Указанное выше фиксированное соотношение должно соответствовать тому, которое наблюдается в производственных условиях (в тех случаях, когда изучаемая комбинация характерна лишь для определенного технологического процесса или связана с применением смесей постоянного состава). В других случаях оно может быть выбрано как наиболее опасное (по формулировке п.2.6.2) при болографическом анализе данных экспериментов на летальном уровне. Наряду с этим в качестве определенного уровня сравнения рекомендуется всегда испытывать действие комбинации, в которую все компоненты входят в равных долях от соответствующих величин LD₅₀ (при изолированном действии).

2.6.4. При наличии предварительно найденной линейной зависимости тех или иных биологических эффектов, используемых для нахождения порога острого действия, от воздействующих доз (концентраций) или от их логарифмов, может проводиться сравнительный анализ таких зависимостей для комбинации (при фиксированном или при различных соотношениях компонентов) и для отдельных компонентов в соответствии с приложением 4.

2.7. Основной целью этапа II является сопоставление кумулятивной способности изучаемой комбинации по летальному или пороговому эффекту) с кумулятивной способностью входящих в нее веществ при их изолированном подостром воздействии на организм. Коэффициенты кумуляции определяются одним из широко распространенных методов при ежедневном введении комбинации (с выбранным соотношением компонентов) и изолированных веществ в дозах, равных определенным долям от соответствующих LD₅o либо ED₅₀.

Поскольку величина LD₅₀ (ED₅₀) как при разовом, так и при повторных введениях вещества определяется со значением ее статистической ошибки, постольку ошибка коэффициента кумуляции может быть оценена как ошибка отношения по формуле:

11

где Z — величина отношения (в данном случае — коэффициент кумуляции);

Sr — его ошибка;

х, у — величины, отношение которых равно z (т. е. в данном случае LD₅₀ или ED₅₀ при однократном и повторном введениях);

Sr, Sу — соответствующие ошибки этих величин.

Таким образом, легко может быть оценена статистическая значимость разности между значениями коэффициента кумуляции при изолированном введении данного вещества и при его введении в комбинации с другими.

Одновременно на этом этапе, а в ряде случаев уже на I этапе исследования (т. е. при однократном введении доз, близких к пороговым) желательно получить данные о материальной кумуляции и метаболизме изучаемых веществ при их изолированном и комбинированном воздействии. Это может служить одной из предпосылок к проведению исследований на этапах III и IV.

2.8. Основной целью этапа III является проверка того, сохраняется ли на уровне концентраций, оказывающих вредное действие на организм лишь при хроническом ингаляционном поступлении, тот основной тип комбинированного действия, который был выявлен в исследованиях на уровне пороговых доз (концентраций) при однократном воздействии. Решение вопроса о проведении хронического эксперимента принимается с учетом рекомендаций п.2.1. На этом этапе также желательно получение данных о материальной кумуляции и метаболизме; возможно сочетание данного этапа с этапом IV.

2.8.1.    Соотношение концентраций комбинируемых веществ для хронического эксперимента выбирается с учетом тех же соображений, которые рекомендованы для выбора фиксированных соотношений при определении порога острого действия комбинации (см. п.2.6.3). Учитывая трудоемкость хронического эксперимента, параллельное исследование действия различных соотношений одной и той же комбинации при нескольких ее концентрациях не представляется в большинстве случаев реальным.

2.8.2.    Абсолютные значения концентраций каждого компонента, входящего в комбинацию, а также при параллельно исследуемом изолированном действии этого же вещества, должны подбираться с учетом предварительной токсикометрической информации таким образом, чтобы минимальные из этих концентраций были близки к пороговым при изолированном хроническом действии, а второй уровень соответствовал отчетливо действующему в тех же

условиях. Как правило, нецелесообразно заведомо ориентироваться только на концентрации, не действующие в хроническом эксперименте, например, на соответствующие надежно установленным ПДК, поскольку даже при эффекте более аддитивного (но с коэффициентом усиления, не пре-выщающем коэффициент запаса, принятый при установлении этих ПДК) комбинация изучаемых веществ может оказаться недействующей. Вместе с тем в качестве третьего уровня изучаемого воздействия недействующие концентрации могут оказаться полезными, повышая обоснованность суждения о пороге хронического действия комбинации.

2.8.3. Учитывая необходимую ограниченность уровней и соотношения воздействий, изучаемых на этом уровне, оказываются практически нереальными почти все методы математического анализа комбинированного действия, рекомендуемые для случая острого токсического действия. Однако возможно сопоставление оцененных в хроническом эксперименте пороговых концентраций веществ при их изолированном и комбинированном действии. Так, если С_х и С₂ — концентрации двух веществ в комбинации при ее пороговом эффекте, a Lim^ и him_cfl2 — пороговые концентрации тех же веществ при изолированном действии, то аддитивному действию соответствует уравнение:

а величину

“1 Umchl 1 Л итсИг 1 С1 1 + i'P

можно принять в качестве коэффициента комбинированного действия (см. п.1.8).

При К = 1 действие является аддитивным; при К> 1— более, чем аддитивным; при К<1—менее, чем аддитивным.

Вместе с тем, практическая невозможность в большинстве случаев оценить статистическую значимость отличия от 1,0 полученного в эксперименте значения К делает подобные выводы лишь ориентировочными. Их надежность существенно повышается и они могут быть приняты в качестве основы предложений по регламентации в тех случаях, когда тот же тип комбинированного эффекта, но с более достоверной математической оценкой был получен на уровне порогов острого действия. Вместе с тем накопленный опыт не позволяет утверждать, что характер комбинированного эффекта в ряде случаев не может оказаться су-

13

щественно различным на рассматриваемых пороговых уровнях (Lirriac и Lim_Ch)- Данный принципиально важный вопрос нуждается в дальнейшем тщательном изучении.

2.8.4.    При наличии хотя бы у одного из входящих в комбинацию токсических веществ выраженной специфичности действия следует особое внимание уделить оценке значения Lim_Ch по показателям, характерующим это действие. Следует иметь в виду, что как и на уровне порогов острого действия, комбинированный эффект нередко имеет различный тип при оценке его по показателям, характеризующим состояние разных органов и систем. Подход к подобным случаям с позиций оценки определяющего типа комбинированного действия изложен в п.1.9.

2.8.5.    Наряду с попыткой математической оценки типа комбинированного действия по соотношению значений 1лт_сЛ (см. п.2.8.3), при анализе результатов хронических экспериментов важную роль играет прямое количественное сопоставление среднегрупповых сдвигов отдельных функциональных, морфологических и биохимических показателей интоксикации — в особенности в тех случаях, когда соответствующие ее проявления специфичны для одного из компонентов, но оказываются усиленными либо ослабленными при его действии в комбинации с другими.

При отсутствии строгой специфичности рассматриваемого эффекта для только одного из веществ вопрос о типе комбинированного действия может быть решен с помощью методов дисперсионного анализа, изложенных в руководствах по математической статистике, а также в «Методических рекомендациях по планированию эксперимента и оценке эффекта комбинированного действия химических веществ при многократном воздействии», подготовленных ВНИИГИНТОКС и утвержденных М3 СССР 06.06.77 за № 1738—77.

Наконец, для оценки типа комбинированного действия в хронических экспериментах особое значение имеет усиленная разработка диагностических подходов, упоминаемых ниже (п. 2.10).

2.9. Исследования, условно выделенные в этап IV, в зависимости от их назначения могут проводиться на разных уровнях воздействия яда (остром летальном, остром пороговом, хроническом) и на различных уровнях биологической организации от субклеточного до организменного. Общей целью этих исследований является выявление тех механизмов, которые лежат в основе того или иного типа комбинированного действия (в первую очередь — действия, отличного от аддитивного) для развития теоретической базы, которая позволит в дальнейшем более надежно прог-

14

нозировать тип действия новых комбинаций и рациональнее планировать их экспериментальное изучение (см. п.1.4). Кроме того, понимание причин того или иного типа действия непосредственно изучаемой комбинации делает более обоснованной оценку результатов экспериментов на этапах I—III (см. п.1.9—в).

Исследования, относящиеся к этапу IV, могут как сочетаться с проведением токсикометрических экспериментов, рассмотренных выше, так и планироваться самостоятельно. Характер этих исследований определяется в зависимости от типа токсических веществ, входящих в комбинацию, и имеющейся информации о механизмах их действия. Как свидетельствует накопленный опыт, особого внимания заслуживают следующие подходы:

2.9.1.    Изучение влияния одних компонентов смеси на метаболизм других как важнейший путь исследования механизма комбинированного действия органических соединений на организм и основа построения общей теории этого действия. Эти исследования должны предусматривать как регистрацию уровня накопления и элиминации метаболитов, так и оценку активности ферментных систем, обеспечивающих биотрансформацию компонентов изучаемой комбинации. В частности, важное значение имеет исследование активности микросомальных монооксигеназ (для липотропньгх веществ), реакций конъюгации и механизмов антирадикальной защиты.

В связи с тем, что в зависимости от концентрации и времени воздействия могут изменяться пути метаболизма ядов, распределение между тканями и скорость выведения метаболитов, указанные исследования следует проводить в широком временном интервале с охватом достаточно большого диапазона действующих доз или концентраций (от летальных до пороговых), стремясь к получению зависимостей типа «доза-время-эффект» для показателей биотрансформации изучаемых веществ как при обособленном, так и при комбинированном их действии.

2.9.2.    Изучение возможности взаимного или одностороннего влияния веществ, входящих в комбинацию,также на другие ообенности их то кси ко кинетики (поступление, задержку, распределение и элиминацию из организма), особенно для токсических веществ с выраженной способностью к материальной кумуляции (тяжелые металлы, фтор, мышьяк и др. токсические элементы).Существенную роль в анализе этого механизма играет математическое описание токсикокинетических процессов, например, с помощью разгрузочных (одно- и мультиэкспоненциальных) функций, характеризующих клиренс вещества из крови.

а также путем построения «камерных» («частевых») моделей для каждого из веществ, входящих в комбинацию, при изолированном и комбинированном поступлении в организм с сопоставлением констант соответствующих моделей.

Задача идентификации параметров линейной «камерной» модели с одновременной их статистической оценкой может быть решена последовательным применением метода случайного поиска и метода последовательных приближений Гаусса-Ньютона. Универсальная программа «COMPAR» для решения этой задачи с помощью ЭВМ разработана Институтом экологии растений и животных Уральского отделения АН СССР (г. Свердловск).

Для получения экспериментальных данных, лежащих в основе такого моделирования, важнейшим методческим приемом является использование меченых соединений, вводимых однократно либо интактным животным (при изолированном или комбинированном введении), либо на фоне развившейся подострой или хронической интоксикации тем же веществом, вторым компонентом комбинации и всей комбинацией веществ, причем исследования на всех этих группах должны проводиться параллельно. При наличии радиометрического спектрометра кинетика обеих радиоактивных меток может изучаться одновременно. Могут использоваться также высокочувствительные физико-химические методы идентификации изучаемых веществ и их метаболитов в тканях и выделениях.

Выбор структуры камерной модели определяется рядом специальных соображений, не рассматриваемых данным документом. Однако, необходимо стремиться к выделению в отдельные «камеры»: (а) основного органа-накопителя веществ, входящих в комбинацию; (б) органов-мишеней токсического действия: (в) тех органов и тканей, по которым получены экспериментальные данные, свидетельствующие об изменении кинетики в результате комбинированного действия.

При получении данных, свидетельствующих о существенном изменении токсикокинетики в результате комбинированного действия, целесообразно планировать углубленное изучение того влияния на определенные органы, ткани или процессы в организме, которое в свою очередь является причиной указанного изменения (например, на тканевую проницаемость, лигандные характеристики плазменных и тканевых белков, функцию выделительных органов, морфогенез и инволюцию депонирующих тканей и. т. д.) либо его предполагаемым следствием.

2.9.3. В том случае, если хотя бы одно из веществ, входящих в комбинацию, присутствует в аэрозольной форме.

16

особенно — при умеренной или низкой растворимости аэрозольных частиц, следует уделить внимание влиянию комбинированного действия на физиологические механизмы, обусловливающие задержку этих частиц в легких и их транслокацию в желудочно-кишечный тракт(альвеолярный фагоцитоз, мукоцилиарный транспорт), а в случае значительного усиления такой транслокации — специальному анализу ее значения с позиций так называемого комплексного действия веществ.

2.9.4. Анализ физиологических и патофизиологических механизмов комбинированного действия на организмен-ном уровне с позиций таких обобщающих концепций, как ОАС, СНПС и т. п., с соответствующей постановкой специальных экспериментов. Близкий смысл имеют исследования, посвященные выявлению роли изменения реагирования нейро-эндокринных регулирующих систем (например, фармакодинамический анализ роли холинэргических и адренергических рецепторов в развитии того или иного типа комбинированного действия по летальному или острому пороговому эффекту; анализ состояния системы адаптивных гормонов, простагландинов и т. п.).

2.10, К перспективным направлениям исследований по проблеме комбинированного действия, разрабатываемым в настоящее время в связи с развитием общей методологии гигиенической регламентации токсических веществ в окружающей среде, следует отнести поиск формализованных способов разграничения (с использованием тех или иных интегральных критериев, а также на основе дискриминантного анализа и др.) состояния нормы, различных степеней патологии и состояний на грани нормы и патологии с целью построения и анализа зависимостей типа «доза (концентрация) — состояние». Сопоставление таких зависимостей для изучаемых комбинаций веществ и для тех же веществ при изолированном воздействии повысит гигиеническую значимость оценки типа комбинированного действия, особенно в хронических экспериментах на уровнях, близких к пороговым.

Приложение 1

МЕТОДЫ МАТЕМАТИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ХАРАКТЕРА КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ ВОСТРЫХ ОПЫТАХ

Метод Финни

Данный метод применим для оценки комбинированного действия смесей веществ, обладающих так называемым простым подобным действием. Предполагается, что компоненты смеси воздействуют сходным образом на одну и ту же биологическую систему. В этом случае наклоны прямых доза-эффект в координатах «пробит-логарифм дозы» для изолированного и комбинированного действия веществ должны быть одинаковыми.

В предварительных исследованиях при помощи метода наименьших квадратов или графическим способом выявляется зависимость летальности от уровней воздействия отдельных компонентов. Данная зависимость выражается для 1-го и 2-го компонентов уравнениями прямой линии: У = а_х + MgQ и У = а₂ + 61gC₂ где У — величина эффекта в пробитах;

Q и С₂ — дозы или концентрации 1-го и 2-го вещества.

При использовании графического метода коэффициенты «а» и «6» могут быть оценены по формуле:

Более точным является расчет коэффициентов уравнения при помощи метода наименьших квадратов. Для этого проводится вычисление ряда вспомогательных величин:

S

где S — знак суммы; x — логарифм дозы;

w — весовой коэффициент (см. Бессмертный Б. С.); п — число животных в группе.

При помощи найденных величин рассчитываются коэффициенты уравнения:

18

. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1.1.    Настоящие методические рекомендации разработаны в дополнение к «Методическим указаниям к постановке исследований для обоснования санитарных стандартов вредных веществ в воздухе рабочей зоны», утвержденным Главным Государственным санитарным врачем СССР П. Н. Бургасовым 4 апреля 1980 г. за № 2163—80 и должны использоваться в комплексе с другими документами, созданными в развитие тех же «Указаний», в качестве методической основы изучения и регламентации загрязнителей производственной среды по отдельным специфическим эффектам (например, раздражающее действие, аллергизи-рующее действие), либо по отдельным типам загрязнителей (например, для аэрозолей), либо по специальным способам оценки действия (например, морфологическим). Частные вопросы оценки комбинированного действия изложены в «Методических рекомендациях по планированию эксперимента и оценке эффекта комбинированного воздействия химических веществ при многократном воздействии» (ВНИИГИНТОКС, 06.06.77 г. за № 1738—77).

1.2.    На первом этапе целесообразно поставить задачу накопления опыта и конкретных материалов изучения одновременного действия на организм бинарных комбинаций токсических веществ как непосредственно в практических целях, так и в целях развития теории комбинированного действия. Переход к изучению типов комбинированного действия трех и большего числа химических веществ должен рассматриваться как последующая задача.

1.3.    В тех случаях, когда многофакторное воздействие является неизбежным результатом многокомпонентного состава используемого в производстве либо получаемого продукта (например, каменноугольные смолы и пеки, комбинированные пестициды и т. п.) или технологического выброса в производственную среду (например, сварочные аэрозоли) и когда такое многокомпонентное загрязнение среды отвечает условиям, сформулированным в п. 1.5, может оказаться необходимым специальное изучение действия на организм как всей конкретной комбинации в це- ¹

а также среднеквадратические ошибки: для любой дозы

(*к) ^:

для эффекта:

для коэффициента регрессии:

т(6) = 1/1П.

~ ^Л'Х

Расчет доверительных границ проводится с применением критерия Стьюдента при (2п*—1) степенях свободы.

После того как получены уравнения регрессии для изолированного и комбинированного действия компонентов вычисляют относительную эффективность веществ:

1    Оо Я1

Теперь дозы второго вещества в смеси можно легко перевести в эквивалентные дозы первого компонента. При аддитивности ожидаемый комбинированный эффект будет равен:

Ут = а_г + big (Сх + С₂р),

или если представить дозы компонентов в виде величин:

П _ Cl    р     С    2    .

¹ С_г + с₂ '    ²    “    с_х    +    с₂¹

ТО _Ут = а_х + Ъ lg (Р_г + Р₂р) + big (С_г + С₂).

Мерой отклонения от аддитивности является показатель:

M_s = -¹- - !g (Pi + л?) =    - !g~~,

о    о    Cj    И^-    С₂

где а₃ — коэффициент в уравнении комбинированного действия.

19

лом, так и отдельных входящих в нее веществ (а в каких-то случаях — и их более простых комбинаций) с целью непосредственного решения задач гигиенической регламентации. В этих случаях, в зависимости от конкретных особенностей комбинации, такая регламентация может осуществляться либо по суммарной весовой концентрации, либо по ведущему (в клинике отравлений) компоненту, либо по компоненту, характеризующему источник выделения (характерному). Общие вопросы нормирования ПДК для многокомпонентных комбинаций нуждаются в разработке и данными рекомендациями не рассматриваются.

Настоящие методические рекомендации не рассматривают также особые подходы к оценке роли химического или физического взаимодействия веществ непосредственно в окружающей среде с позиций гигиено-токсикологической оценки их комбинаций (что может иметь серьезное значение, в первую очередь, для газо-аэрозольных смесей).

1.4.    Наряду с исследованиями, непосредственно направленными на установление основного типа и выраженности комбинированного действия, необходимо развивать исследования, ставящие своей целью изучение его механизмов. Только на основе понимания этих механизмов в частных случаях и построения их общей классификации может развиваться теория комбинированного действия. Такая теория необходима для того, чтобы в будущем можно было значительно расширить и одновременно упростить конкретные исследования по оценке тех многочисленных комбинаций, которые характерны для современного производства. Вместе с тем, уже на данном этапе изучение механизма комбинированного действия существенно помогает в выборе тех показателей, на которые следует ориентироваться при оценке основного типа этого действия (см. п.1.9).

1.5.    Первоочередному изучению характера действия на организм подлежат те комбинации веществ:

а)    которые наиболее часто встречаются в различных отраслях промышленности;

б)    которые даже при их наличии лишь в условиях отдельных производств воздействуют на численно значительные контингенты работающих;

в)    а также комбинации промышленных и наиболее часто встречающихся бытовых химических веществ (этанол, компоненты дыма табака, препараты бытовой химии и др.).

При выборе комбинаций веществ для первоочередного изучения следует учитывать также класс токсичности и опасности каждого их них; наличие клинических данных, свидетельствующих о возможности развития профессиональной патологии смешанной химической этиологии;

2

имеющиеся сведения о токсикокинетике и токсикодинамп-ке веществ, входящих в комбинацию, позволяющие предположить возможность того или иного комбинированного действия. При планировании исследований, посвященных токсикологической оценке и регламентации комбинаций из более чем 2-х компонентов наряду с перечисленными в этом параграфе соображениями следует исходить также из приоритетности смесей постоянного состава.

1.6.    В соответствии с рекомендациями Комитета экспертов ВОЗ (1981) принимаются в качестве основных следующие определения типов комбинированного действия:

а)    аддитивное действие — такой тип комбинированного действия химических веществ, при котором их совместный эффект равен сумме эффектов каждого из веществ при изолированном воздействии на организм;

б)    более чем аддитивное действие (потенцирование) — такой тип комбинированного действия, при котором совместный его эффект превышает сумму эффектов каждого из веществ, входящих в комбинацию, при их изолированном воздействии на организм;

в)    менее чем аддитивное (антагонизм) — такой тип комбинированного действия, при котором совместный эффект меньше суммы эффектов каждого из веществ, входящих в комбинацию, при их изолированном действии на организм.

Показателем типа и выраженности комбинированного действия может служить отношение наблюдаемого эффекта к эффекту, теоретически ожидаемому при аддитивном типе действия. Всюду, где это допускается применяемым методом математической обработки результатов, должна проводиться оценка статистической значимости отличия рассматриваемого отношения от 1,0; при обнаружении эффекта комбинированного действия, для которого это отношение значимо более или менее, чем 1,0, речь идет, соответственно, о потенцировании или антагонизме. Конкретное численное значение этого отношения учитывается при определении подходов к гигиенической оценке производственной среды, загрязненной данной комбинацией токсических веществ (особенно в случае потенцирования).

1.7.    Наряду с определением аддитивности, приведенным в п.1.6, в современной токсикологии широко исполь зуется также другое понятие, основанное на предположении, что при однонаправленном действии смесь ведет себя как одно вещество. С этих позиций аддитивное действие определяется как такой тип комбинированного действия, при котором отдельные компоненты смеси являются взаимозаменяемыми в пропорциональных частях их изоэффек-тивных доз. В этом случае в уравнении:

3

где С_ъ С₃...С_Л— дозы или концентрации компонентов смеси,

М_1т М₂...М_П — их изоэффективные дозы или концентрации при изолированном воздействии; (например, соответствующие LD₅₀), коэффициент К принимается равным 1,0, т. е. эффект действия смеси равен эффекту, наблюдаемому при изолированном воздействии компонентов в соответствующих изоэффективных дозах или концентрациях.

Действию, более чем аддитивному (потенцированию) соответствует значение коэффициента К > 1,0; действию менее чем аддитивному (антагонизму) — значение К < 1,0. Сказанное в п.1.6 об оценке статистической значимости и величины отношения эффектов полностью применимо и к оценке рассматриваемого коэффициента, который в данном случае является мерой отличия наблюдаемого типа действия от аддитивного.

Приведенные в этом параграфе формулировки используются при оценке типа комбинированного действия на основе его сопоставления с изолированным действием компонентов смеси в изоэффективных дозах или концентрациях (см. напр. п.2.6.1, 2.8.3 и приложение 1,2 и 4). Формулировки, приведенные в п.1.6, используются в тех случаях, когда проводится сопоставление эффектов изолированного и комбинированного действия при одном соотношении компонентов смеси (см. напр. п.2.8.5 и приложение 3). В тех случаях, когда экспериментальный материал допускает анализ математическими методами, основанными на обоих существующих понятиях аддитивности, рекомендуется проводить такой анализ с целью более углубленной оценки изучаемой комбинации, а также накопления данных для последующих обобщений.

1.8. Под комбинированным принято понимать не только одновременное, но и последовательное действие на организм двух или большего числа токсических веществ. Для этого варианта комбинированного действия существенную роль играет длительность временных интервалов между последовательными экспозициями в сопоставлении с длительностью тех циклических фаз, через которые обычно протекает реакция организма на однократное воздействие токсического вещества, причем как длительность, так и выраженность таких фазовых сдвигов зависят от силы воздействия. Поэтому при различных временных и силовых соотношениях между последовательно воздействующими ве-

ществами тип комбинированного действия может меняться. Это обстоятельство требует специального планирования исследований и обоснования не только выбираемого соотношения доз, но и интервалов между воздействиями с учетом как моделируемых гигиенических ситуаций, так ифазовости реагирования, которая к тому же может иметь существенные межвидовые различия. Следует, в частности, иметь в виду, что в реальных ситуациях разрыв во времени между последовательными токсическими воздействиями может измеряться как часами или даже минутами (например, на разных стадиях технологического процесса), так и неделями и даже месяцами (сезонная работа с ядохимикатами) при весьма вариирующей продолжительности каждого из воздействий.

Детальная методическая разработка соответствующих экспериментальных подходов и моделей требует дальнейшего развития исследований в этой области и данными рекомендациями не предусматривается.

1.9. Накопленный опыт изучения одновременного комбинированного действия токсических веществ свидетельствует о том, что тип этого действия может оказаться различным:

а)    на разных уровнях токсического действия (острое летальное и пороговое, подострое, хроническое);

б)    при разных количественных соотношениях между компонентами, входящими в изучаемую комбинацию;

в)    в зависимости от того, на какие показатели токсического эффекта ориентируется исследователь даже при одном и том же уровне действия.

Поэтому для решения вопросов гигиенического нормирования целесообразно ввести понятие об основном, или определяющем типе комбинированного действия. Делая вывод о том, какой из наблюдавшихся типов действия может быть принят в качестве основного, следует учитывать:

а)    преимущественное значение того типа действия, который характерен для концентраций или доз, вызывающих хроническую интоксикацию, а при острой интоксикации ■—для доз, близких к пороговым;

б)    в тех случаях, когда рассматриваемая комбинация встречается в реальных условиях промышленности лишь при узком диапазоне соотношений между компонентами (подобная ситуация характерна также для комбинированного действия промышленных химических соединений и некоторых бытовых химических факторов — этанола, факторов курения, косметических препаратов, пищевых добавок и т. д.)— преимущественное значение типа действия, характерного для этого диапазона;

5

в)    в тех случаях, когда на основании изучения механизмов комбинированного действия (роли тех или иных эффектов на уровне ферментных систем; значения количественных изменений распределения яда внутри организма с изменением накопления в «критических органах», а также изменений кинетики метаболизма и элиминации яда; роли сдвигов адаптационно-компенсаторного характера со стороны регуляторных систем и т. п.) или на основании анализа клинических данных удается выделить те органы и системы, реагирование которых в наибольшей степени вовлечено в поражение организма при комбинированном действии — преимущественное значение того типа действия, который преобладает по сдвигам, относящимся к органам и системам;

г)    в тех случаях, когда для изучаемых веществ характерны те или иные патогномоничные признаки интоксикации или выраженная специфичность действия (в особенности, когда на основании именно последней были установлены стандарты ПДК или ОБУВ для этих веществ) — преимущественное значение того типа действия, который выявляется по соответствующим показателям;

д)    особое значение того типа действия, которое выявляется по так называемым отдаленным эффектам; в частности, следует уделить внимание выявлению ко-канцероген-ного или ко-мутагенного влияния веществ, входящих в комбинацию с химическими канцерогенами и мутагенами, в том числе бытовыми химическими факторами (например, компонентами дыма табака).

1.10. При обосновании подходов к гигиенической регламентации изученной комбинации вредных веществ по их содержанию в воздухе рабочей зоны следует исходить из выбранного в соответствии с рекомендациями пункта 1.9 основного типа комбинированного действия. При этом:

1.10.1.    В случае аддитивного действия представляются материалы к апробации на Секцию токсикологии Проблемной комиссии «Научные основы гигиены труда и профпа-тологии» с последующим утверждением Главным Государственным санитарным врачом СССР специального определения об отнесении рассматриваемой комбинации веществ к числу тех, на которые распространяются действие параграфа 2.2 ГОСТ ССБТ «Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования», регламентирующего условия соблюдения стандарта ПДК для комбинации «веществ однонаправленного действия».

1.10.2.    В случае доказанного в эксперименте эффекта потенцирования необходима организация тщательного клинико-гигиенического наблюдения за производственной сре-

6

док и состоянием здоровья работающих для подтверждения такого потенцирования, а возможно —и планирование дополнительных экспериментов для более надежной количественной оценки степени этого потенцирования, с тем чтобы на основании результатов всех этих исследований могло быть принято решение о внесении для данной комбинации соответствующего корректива в формулу параграфа 2.2 вышеуказанного ГОСТ. Вопрос о целесообразности принятия временного решения по регламентации как для случая аддитивного действия (т. е. в соответствии с изложенным в п. 1.10.1) должен быть рассмотрен специально в каждом конкретном случае.

1.10.3. В случае антагонизма после соответствующей апробации материалов исследования вышеуказанная Секция информирует через журнал «Гигиена труда и профессиональные заболевания» или непосредственно заинтересованные предприятия и органы контроля о том, что на рассматриваемую комбинацию распространяется действие параграфа 2.3 того же ГОСТ, устанавливающего, что для «веществ, не обладающих однонаправленным действием, ПДК остаются такими же, как и при изолированном воздействии».

1.11. При обосновании токсикологического прогноза характера и степени нарушений здоровья работающих в условиях комбинированного токсического воздействия следует не только исходить из выбранного основного типа действия, но и учитывать иные типы действия, если они выявлены по отношению к определенным органам и системам. Так, например, ослабление отдельных проявлений интоксикации в результате выявленного по ним антагонистического характера эффекта (при основном аддитивном действии или даже потенцировании) может смазать типичную картину той или иной интоксикации, изменить отношение клинициста к диагностической ценности указанных проявлений, повлиять на его лечебную тактику и т. д.

2. ПЛАНИРОВАНИЕ И ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Эксперименты, посвященные изучению комбинированного действия веществ, следует планировать таким образом, чтобы на определенных этапах исследования мог быть решен вопрос о целесообразности его дальнейшего развития. Основные этапы предполагают:

I. Исследование при однократном воздействии на уровне как смертельных, так и пороговых доз или концентраций.

7

II.    Исследование характера действия изучаемой комбинации в подостром эксперименте.

III.    Исследование характера действия изучаемой комбинации в хроническом эксперименте.

IV.    Проведение в случае необходимости специал ьных дополнительных исследований (на тех или иных уровнях воздействия), направленных на выяснение токсикодннами-ческих и токсикокинетических механизмов комбинированного действия.

Как правило, исследования, соответствующие этапам III и IV, являются необходимыми лишь в тех случаях, когда на предыдущих этапах обнаружен эффект более аддитивного (при всех или хотя бы при некоторых соотношениях между компонентами). Однако, в случаях, имеющих особо важное значение с позиций гигиенической регламентации (см. п. 1.5), они могут быть проведены и при обнаружении на первых этапах лишь аддитивного типа действия. Чаще всего нецелесообразно переходить к последующим этапам при обнаружении на первом этапе явного антагонизма (при любых соотношениях между компонентами).

2.2.    Условия проведения исследований должны соответствовать требованиям «Методических указаний к постановке исследований для обоснования стандартов вредных веществ в воздухе рабочей зоны», упоминаемых в п. 1.1.

2.3.    Принимая во внимание вариабельность биологических эффектов, обусловленную неуправляемыми факторами и приводящую не только к межлабораторным, но и к внутрилабораторным различиям токсикометрических параметров одного и того же вещества, следует опасаться того, что такие различия окажутся более значительными, чем те или иные изменения этих параметров, обусловленные комбинированным действием. Поэтому независимо от степени предварительной изученности токсического действия отдельных компонентов изучаемой комбинации, эксперимент ты с ними должны обязательно проводиться параллельно с соответствующим этапом экспериментального изучения действия комбинации.

2.4.    Ингаляционный способ воздействия на организм является обязательным на этапе III. На этапе I и II допустимо (а при работе с нелетучими веществами — и наиболее целесообразно) использовать внутрижелудочное или парентеральное введение. В тех случаях, когда в производственных условиях серьезное значение может иметь проникновение компонентов изучаемой комбинации через кожу, этот путь воздействия также должен служить предметом экспериментального моделирования (главным обра-

8

1