Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Иммунологические методы лабораторной диагностики паразитарных болезней

Методические указапия МУК 4.23533—18

Издание официальное

Москва • 2018

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Иммунологические методы лабораторной диагностики паразитарных болезней

Методические указания МУК 4.2.3533—18

нальна концентрации иммуноглобулинов к антигенам паразитов в анализируемом образце сыворотки. Выявление антител класса М свидетельствует о недавнем заражении, присутствие в анализируемой пробе специфических IgG при отсутствии IgM характерно для хронических форм инвазий.

3.3.2. В настоящее время на рынке представлены зарегистрированные ИФА-тест-системы для определения антител разных классов к антигенам аскарид, анизакид, токсокар, трихинелл, описторхисов, кло-норхисов, эхинококков, стронгилоидеса, лямблий, токсоплазм.

3.4. Илшуноферментное определение концентрации аллергенспецифических IgE к антигенам паразитов

3.4.1.    Метод является разновидностью иммуноферментного анализа антител к антигенам паразитов.

Принцип метода. Метод основан на применении твердофазного иммуноферментного анализа и проводится в три стадии.

3.4.2.    На первой стадии калибровочные образцы с известной концентрацией IgE, контрольный и исследуемые образцы инкубируют в лунках стрипироваиного планшета с иммобилизованными моноклональными антителами (МКАТ) к иммуноглобулину класса IgE человека. Затем планшет отмывают.

3.4.3.    На второй стадии в лунки с калибровочными образцами добавляют биотинилированные анггитела к IgE (конъюгат 1), а в лунки с контрольным и исследуемыми образцами вносят соответствующие биотинилированные аллергены. После инкубации планшет отмывают и в лунки планшета добавляют конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена (конъюгат 2).

3.4.4.    На третьей стадии конъюгат 2 связывается с биотинилированным агентом (с аллергеном или с конъюгатом 1). Количество связавшегося конъюгата 2 пропорционально концентрации аллергенспс-цифического IgE в контрольном и в исследуемых образцах, или общего IgE в калибраторах. Иммунный комплекс «иммобилизованные МКАТ-^Е-аллерген-конъкмдт» выявляют цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы - перекиси водорода и хромогена - тетраметил-бензидина. В реакцию вносят стоп-реагент. Результаты учитываются фотометрически. Степень окрашивания раствора в лунках с исследуемыми образцами пропорциональна концентрации аллергенспецифических IgE.

Метод применяется для повышения эффективности иммунологической диагностики.

3.5. Иммуноферментное определение индекса авидности антител класса IgG к антигенам паразитов

3.5.1.    Определение ИА иммуноглобулинов класса G к антигенам паразитов в сыворотке крови человека может быть использовано для подтверждения диагноза острой инфекции, уточнения сроков инфицирования и дифференцирования острой и хронической стадии инвазии. Авидность характеризует степень прочности связи специфических антител с соответствующими антигенами. При формировании иммунного ответа вначале образуются IgG с низкой авидностью, по мере хрониза-ции инвазии прочность связи, и, соответственно, индекс авидности, увеличивается.

3.5.2.    Принцип метода. Метод определения основан на применении трехстадийного твердофазного иммуноферментного анализа с использованием антигена паразита, белок-диссоциирующего агента и моноклональных антител против иммуноглобулина класса IgG человека. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы сыворотки инкубируют в лунках параллельных рядов, на которых иммобилизованы антигены паразитов. Содержащиеся в сыворотке крови специфические к паразитам антитела связываются с антигеном и формируют комплекс «антиген-антитело». На второй стадии, после внесения белок-диссоциирующего агента в один из параллельных рядов, происходит диссоциация комплекса «антиген-антитело», включающий IgG с более низкими константами связывания (низкой авидностью). На третьей стадии связавшиеся антитела взаимодействуют с конъюгатом моноклональных антител против IgG человека с пероксидазой хрена. Комплекс «антиген-антитело-конъюгат» выявляют внесением тетраметил-бензидина. Затем в реакцию вносят раствор стоп-реагента и измеряют оптическую плотность растворов в лунках: на основной длине волны -450 нм, при референсной длине волны - 620—655 нм. Интенсивность окрашивания пропорциональна количеству связанных в комплекс IgG антигенов паразитов. Рассчитывается ИА как отношение оптической плотности, полученной в лунках в присутствии диссоциирующего агента, к оптической плотности, полученной при анализе без диссоциирующего агента, и выражается в процентах. При обнаружении низко-авидных IgG предполагают острую стадию первичного заражения.

3.5.3.    В настоящее время на рынке представлена ИФА-тест-система для определения ИА к IgG, специфичным к антигенам токсок-плазм.

3.6. Иммуноферментный анализ циркулирующих иммунных комплексов, включающих антиген паразита

3.6.1.    Принцип метода. Метод определения циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) к антигенам паразитов представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ, в ходе которого при взаимодействии исследуемых образцов сывороток крови в лунках стрипов с иммобилизованными антителами к антигенам паразитов происходит связывание специфических иммунокомплексов и образование комплекса «антитело-ЦИК» на поверхности лунок. После удаления несвязав-шихся компонентов сыворотки в лунки планшета добавляют конъюгат пероксидазы хрена с иммуноглобулинами против IgG человека, происходит включение ферментной метки в иммунный комплекс. Иммунный комплекс выявляют цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы - перекиси водорода и хромогена - тетраметилбензиди на. В реакцию вносят стоп-реагент и измеряют оптическую плотность растворов в лунках: при длине волны - 450 нм, референсной длине волны -620—655 нм. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации циркулирующих иммунокомплексов, содержащих антигены паразитов, в анализируемом образце сыворотки. Метод применяется для повышения эффективности иммунологической диагностики.

3.6.2.    В настоящее время на рынке представлена ИФА-тест-система для определения ЦИК, включающих антигены описторхисов.

3.7. Иммуноферментный анализ антигенов паразитов

3.7.1.    Принцип метода заключается во взаимодействии иммобилизованных в лунках полистироловых планшетов моноклональных антител со специфическими паразитарными антигенами. Фиксированные на поверхности лунок антитела инкубируют с анализируемой пробой. Специфические паразитарные антигены, содержащиеся в пробе, образуют на поверхности лунок комплекс «антитело-антиген». Полученный комплекс «антитело-антиген» выявляется с помощью иммунофермент-ного конъюгата. При добавлении субстратного раствора и хромогена развивается цветная реакция. Если в качестве хромогена используется тетраметилбензидин (ТМБ), то измерение оптической плотности растворов в лунках проводят на основной длине волны - 450 нм, при референсной длине волны - 620—655 нм. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации искомого антигена в анализируемой пробе.

3.7.2.    В настоящее время на рынке представлены зарегистрированные ИФА-тест-системы для определения антигенов лямблий, криптоспоридий, энтамебы в фекальных образцах.

3.8. Метод иммунного блоттинга

3.8.1.    Метод является модификацией ИФА, в котором антигены нанесены на нитроцеллюлозную мембрану (стрип). Это высокоспецифичный и высокочувствительный референсный метод, подтверждающий диагноз для пациентов с положительными или неопределенными результатами анализов, полученными в других методах.

3.8.2.    Принцип метода. В основе теста лежит метод непрямого иммуноферментного анализа на нитроцеллюлозной мембране, на которую методом электропереноса нанесены основные индивидуальные белки искомого возбудителя, полученные при электрофоретическом разделении антигенов. Специфические антитела (при наличии их в исследуемой сыворотке крови) связываются с индивидуальными белками паразита, сорбированными на мембране (стрипе). Полученные иммунные комплексы затем связываются с конъюгатом, ферментативная активность которого приводит к появлению окрашенных полос на стрипе в зонах локализации соответствующих индивидуальных белков паразита. Расположение окрашенных полос на стрипе соответствует молекулярным массам индивидуальных белков.

3.8.3.    В настоящее время на рынке представлена тест-система для диагностики эхинококкоза методом иммуноблота.

IV. Оценка результатов реакции иммуноферментного анализа

4.1.    Оценку результатов ИФА проводят в том случае, если окраска субстратной смеси в лунках с контрольными образцами соответствует параметрам, указанным в инструкции по применению набора реагентов.

4.2.    Исследуемую пробу считают положительной, если значение ее ОГ1 в диагностическом разведении равно или превышает значение ОП диагностического уровня, указанного в инструкции по применению набора реагентов.

4.3.    Учет результатов ИФА осуществляют в соответствии с инструкцией по применению тест-системы, в которой даны расчетные формулы для определения положительных и отрицательных результатов исследования.

4.4.    При количественном учете результатов исследования к набору прилагается диагностический образец (образцы) с известным количеством антител (или антигенов) и по прилагаемой формуле или по калибровочной кривой вычисляется количество антител (или антигена) в испытуемом образце.

Ниже приведены варианты учета результатов.

4.5. Определение титра антител в анализируемой сыворотке крови.

4.5.1. За титр антител принимают наибольшее разведение испытуемой сыворотки, при котором ее значение ОП равно или превышает значение ОП диагностического уровня. Вычисление диагностического уровня (критическое значение ОП) проводят с помощью формулы и коэффициентов, рассчитанных для каждой серии диагностических наборов и указанных в инструкции к тест-системе, например:

Образцы	1/100	1/200	1/400	1/800	1/1 600	1/3 200	1/6 400	1/12 800
К+	1,25
К-	0,09
Исп.	0,97	0,53	0,25	0,14	0,10	0,08	0,05	0,05

ОП диагностического уровня определяем по формуле: On_v*OIlK-+ 0,14, где

ОПду - диагностическое значение оптической плотности;

ОПК— оптическая плотность отрицательного контрольного образца сыворотки;

0,14 - коэффициент единиц оптической плотности, установленный производителем тест-системы.

В приведенном примере ОП =» 0,09 + 0,14 = 0,23.

В этом случае титр антител в испытуемой сыворотке равен 1 : 400.

4.6.    Определение относительной концентрации АТ в антительных единицах (АЕ). Вычисления проводят по следующей формуле:

АЕ » (ОП_нсп. - ОПду) * (ОПК+ - ОПду) • 100, где

ОПнсп. - оптическая плотность испытуемого образца сыворотки;

ОПК+ - оптическая плотность контрольного образца сыворотки.

4.6.1. В качестве стандартного образца в данной методике определения концентрации антител в АЕ используют контрольный положительный образец сыворотки, входящий в набор реагентов для исследования.

4.7.    Определение концентрации АТ по образцу (образцам) с известным количеством АТ. Для количественного определения концентрации антител в набор реагентов в зависимости от комплектации включены 1 или 4—6 контрольных образцов с известным количеством антител. По расчетной формуле или калибровочному графику определяют количество антител в испытуемом образце.

4.8. Определение концентрации АТ по коэффициенту позитивности КП (или индексу пробы ИП). Коэффициент позитивности высчитывают по формуле:

КПобр. = ОПобр. + ОПду, где

КП_обр. - коэффициент позитивности исследуемого образца;

ОПобр. - средняя оптическая плотность исследуемого образца;

ОПду - диагностический уровень оптической плотности (ОП), значение которого определяется в соответствии с инструкцией по применению набора.

Результат анализа считается положительным, если КЛ^р. больше или равен единице. Значения КПобр., соответствующие отрицательному или сомнительному (неопределенному) результату, указываются в инструкции производителя.

V. Реакция непрямой иммунофлюорссценции

5.1.    Принцип метода. Иммунохимический метод основан на образовании иммунного комплекса «антиген-антитело», для выявления которого используется в качестве метки флуоресцентный краситель. В результате каждый образовавшийся комплекс «антиген-антитело» несет на себе молекулу красителя, свечение которого регистрируется с помощью люминесцентного микроскопа.

5.2.    Реакцию непрямой иммунофлюоресценции проводят непосредственно на предметном стекле с фиксированными корпускулярными антигенами (взвесь простейших, срезы тканей паразита).

Выполняться РНИФ может в виде качественного и полуколичест-венного анализов, поскольку на одно стекло могут быть нанесены разные разведения исследуемой сыворотки.

Учет результатов РНИФ проводят при микроскопии препаратов в люминесцентном микроскопе.

5.3.    Для проведения РНИФ необходимы: известный антигенный препарат (специально размеченные предметные стекла с фиксированным корпускулярным антигеном); контрольные положительная и отрицательная сыворотки к известному антигену; люминесцирующая анти-видовая сыворотка (конъюгат) и другие реагенты.

5.4.    Ход исследования:

-    подготовка рабочих растворов;

-    титрование испытуемых сывороток и контрольных образцов сыворотки;

-    нанесение оттитрованных испытуемых и контрольных образцов сывороток на специально размеченные предметные стекла с антигеном;

-инкубация антигенных препаратов с образцами сывороток во влажной камере в соответствии с параметрами условий инкубации инструкции по применению набора реагентов;

-    удаление непрореагировавших компонентов сыворотки путем трехкратного отмывания препаратов в растворе фосфатно-солевого буфера (ФСБ);

-    высушивание препаратов при комнатной температуре;

-    нанесение разведенного раствора люминесцирующей антисыворотки (конъюгата) на стекла с антигеном;

-    инкубация препаратов во влажной камере при комнатной температуре;

-удаление непрореагировавших компонентов сыворотки путем трехкратного отмывания препаратов в растворе фосфатно-солевого буфера;

-    высушивание препаратов при комнатной температуре;

-    нанесение забуференного глицерина на антигенные препараты;

-    микроскопирование препаратов под покровным стеклом в синефиолетовой части спектра (435 нм) люминесцентного микроскопа.

Результаты реакции оцениваются в соответствии с прилагаемой инструкцией.

5.5. В настоящее время на рынке присутствуют наборы для диагностики лейшманиоза, эхинококкоза и других паразитозов методом РНИФ.

VI. Реакция непрямой (пассивной) гсмагглюшнации

6.1.    Принцип метода основан на способности обработанных специальными реагентами эритроцитов адсорбировать на своей поверхности антиген и при контакте со специфическими антителами склеиваться и образовывать осадок, видимый невооруженным глазом. РИГА является полу количественным методом, учет результатов проводится визуально.

Диагностический набор содержит: эритроциты, сенсибилизированные специфическим антигеном (Д+), обработанные эритроциты без антигена (Д-), положительный контрольный образец (К+), отрицательный контрольный образец (К), реагент для приготовления раствора для разведения сывороток.

6.2.    Ход исследования:

1) реакция непрямой гемагглютинации выполняется строго в соответствии с инструкцией, прилагаемой к набору реагентов, и включает следующие этапы:

-подготовка рабочих растворов, необходимых для проведения анализа;

-    подготовка испытуемых сывороток и контрольных образцов сывороток;

-внесение в лунки планшета испытуемых и контрольных образцов;

-    внесение диагностикума (Д+) и эритроцитов без антигена (Д-);

2) инкубация препаратов в соответствии с условиями в инструкции

по применению.

6.3. Оценка результатов реакции. Результаты исследования учитывают в титрах и по интенсивности реакции, выраженной в крестах. При оценке результатов анализа по 4-крестовой системе учитывается характер осадка на дне лунок:

«++-+-+» - резко интенсивная реакция. Полная агглютинация эритроцитов, которые осели на дно и стенки лунки в виде «зонтика»;

«+++» - интенсивная реакция. Практически полная агглютинация эритроцитов, которые осели на дно и стенки лунки в виде «зонтика», в центре «зонтика» имеется слабо выраженное оседание эритроцитов в виде «точки» или «пуговки»;

«++» - реакция средней интенсивности. Осели в виде «зонтика» 50 % эритроцитов, остальные эритроциты образовали в центре лунки осадок в виде «точки» или «пуговки»;

«+» - реакция слабой интенсивности. Осели в виде «точки» или «пуговки» 75 % эритроцитов - слабо выраженная агглютинация эритроцитов.

Реакция отрицательная: отсутствие агглютинации эритроцитов, осадок сформирован в виде «точки» или «пуговки» с ровными, четкими краями.

Учет проводится при соответствующих показателях контролей: «Д+» - не образуют спонтанной агглютинации в отсутствии сыворотки;

«сК-» - Д+ не агглютинируют в разведении выше диагностического титра;

«сК+» - Д+ агглютинируют в соответствующем титре (согласно инструкции по прилагаемой к набору реагентов для РИГА);

«Д-» - нс образуют спонтанной агглютинации в отсутствии сыворотки, а также сК+и испытуемыми сыворотками.

Конечным титром реакции испытуемого образца сыворотки считают максимальное разведение, при котором наблюдается четкая агглютинация не менее чем на 2 или 3 креста в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов. Диагностические титры реакции с эритроцитарными диагностикумами указаны в инструкции по применению.

VII. Иммунохроматографический анализ

7.1.    Иммунохимичсский метод, основанный на принципе тонкослойной хроматографии (далее - ИХА) относится к экспресс-методам и позволяет проводить предварительные исследования в «полевых» условиях.

Принцип метода. На нитроцеллюлозной полоске теста в определенных местах иммобилизованы специфические антитела, антивидовые антитела и меченый конъюгат. Биологическая проба наносится на мембрану (нитроцеллюлозную полоску) и, смешиваясь с сигнальным реактивом (меченый конъюгат), мигрирует по ее длине. Положительная реакция развивается в течение нескольких минут и проявляется в виде линии в том месте, где на мембране были нанесены антитела. Наличие видимых линий в тестовых и контрольных местах означает положительную реакцию, появление только контрольной линии свидетельствует об отрицательном результате. Большинство методик ИХА не требуют дополнительных приспособлений и могут храниться и транспортироваться без холодильного оборудования.

При постановке метода обязательно должна быть видна контрольная полоса. Если контрольная полоса не появляется при повторном исследовании, то тест-система непригодна к использованию.

7.2.    В настоящее время на рынке представлены диагностические наборы на основе метода ИХА для определения антигенов лямблий, лейшманий, криптоспоридий, малярии, а также антител к эхинококку, малярии.

VIII. Регистрация и учет результатов иммунологических исследований

8.1.    Результаты иммунологических исследований регистрируют в журналах учета и регистрации в бумажной и электронной версии.

Результаты ИФА дополнительно учитываются в протоколах исследований, которые включают распечатанные данные спектрофотометров по каждому исследованию.

Образцы журнала учета и протоколов исследований рекомендованы в приложениях 1 и 2.

IX. Требования к проведению иммунологических исследований

9.1.    При проведении иммунологических исследований применяют наборы реагентов, прошедших государственную регистрацию на территории Российской Федерации в установленном порядке.

9.2.    Перед проведением иммунологических исследований необходимо ознакомиться с инструкцией по применению, в которой определен порядок проведения аналитической процедуры. Диагностические наборы реагентов одного типа, выпущенные разными предприятиями, могут иметь свои особенности постановки исследований.

9.3.    Не допускается смешивание реактивов из разных серий наборов!

Необходимо строго соблюдать условия хранения и сроки годности наборов реагентов, указанных в паспорте.

Не допускается использование наборов с истекшими сроками годности!

9.4.    Перед исследованием наборы реагентов необходимо выложить из холодильника и довести их температуру от 20 до 25 °С (температуры окружающей среды).

9.5.    Строго соблюдать временной и температурный режим постановки ИФА: реакция связывания антител с антигенами начинается сразу по ходу постановки анализа, в связи с чем необходимо рассчитать время между внесением первого и последующих образцов сывороток на планшет таким образом, чтобы предусмотреть возможные изменения оптической плотности испытуемых образцов и соответственно результатов исследования.

9.6.    Испытуемые образцы сыворотки, дающие оптическую плотность в ближайшем к «серой» зоне диапазоне оптических плотностей, подлежат повторному исследованию. К «серой» зоне относят значения оптической плотности образцов, расцененных как «сомнительные» (или «неопределенные). Формулы для всех расчетов приводятся в инструкциях производителей.

9.7.    При разведении образцов сывороток и других ингредиентов необходимо тщательно перемешивать рабочие растворы.

9.8.    При использовании замороженных образцов сывороток необходимо их полностью разморозить и затем перемешать пипетировани-ем. Все лунки планшета должны равномерно заполняться вносимыми реагентами.

9.9.    При промывании планшетов необходимо заполнять лунки промывочным раствором полностью. Необходимо избегать подсыхания лунок планшетов между внесением растворов. При ошибке процедуры внесения испытуемых образцов в лунки планшета анализ данного образца проводят в чистой лунке.

9.10.    Учет результатов иммунологических исследований проводят согласно формулам для определения диагностического значения реакции, описанным в инструкции.

ББК 53.4 И53

И53 Иммунологические методы лабораторной диагностики паразитарных болезней: Методические указания.—М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2018.—47 с.

ISBN 978-5-7508-1639-2

1.    Разработаны ИМПиТМ им. Марииновского Первого государственного Московского университета им. И. М. Сеченова (В. П. Сергиев,

Е. Н. Морозов, М. Н. Лебедева, О. Г. Полетаева, Н. И. Тумольская,

Е. Н. ПонировскиЙ, Т. В. Продсус, О. И. Зеля, В. Д. Завойкин,

К. Ю. Кузнецова, Е. В. Степанова, Е. Н. Жирснкина, Ж. В. Жнакина),

ФБУН «Ростовский НИИ микробиологии и паразитологии» Роспотребнадзора (Т. И. Твсрдохлебова, Л. А. Ермакова, О. С. Думбадзе,

Л. В. Шишханова), Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Т. М. Гузеева), ФБУЗ «Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии» Роспогребнадзора (Т. Г. Сыскова, М. М. Асланова), ФБУН «Тюменский НИИ краевой и инфекционной патологии» Роспотребнадзора (Т. Ф. Степанова,

Т. В. Постникова, К. Б. Степанова), ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России (Т. Н. Константинова), ФБУЗ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России (А. Л. Гинзбург, Д. Б. Гончаров),

ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора (О. Ю. Старостина).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. № 1).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 15 февраля 2018 г.

4.    Введены взамен МУ 3.2.1173—02 «Серологические методы лабораторной диагностики паразитарных болезней».

ББК 53.4

ISBN 978-5-7508-1639-2

О Роспот ребнадзор, 2018

9.11. Остатки биологического материала подлежат обеззараживанию в соответствии с действующими нормативными документами. Измерительные приборы (спектрофотометры) и дозаторы подлежат метрологической поверке 1 раз в год.

X. Контроль качества. Общие требования

10.1. Внутренний контроль качества

10.1.1.    Основная цель внутреннего контроля качества (ВнКК) -проверка достоверности полученных результатов, которая в общих рамках обеспечения системы-качества должна охватывать три существующих этапа лабораторных исследований: преаналитический, аналитический и постаналитический.

10.1.2.    На достоверность полученных результатов исследования могут влиять следующие факторы:

1)    на пре аналитическом этапе исследований:

-    несоблюдение правил подготовки пациента к исследованию;

-    несоблюдение правил отбора проб;

-    ошибка при маркировке пробы;

-    несоблюдение условий транспортирования и хранения образцов;

-    нарушения процедуры пробоподготовки.

2)    на аналитическом этапе исследований:

-    ненадлежащая подготовка оборудования для анализа;

-ненадлежащее качество используемых реактивов и референс-

материалов;

-    нарушение технологических процедур в работе;

-    нарушение процедуры ВнКК;

-недостаточная компетентность сотрудников, выполняющих исследования.

3)    на постаналитическом этапе исследования:

-    некорректный способ учета результатов анализов;

-    недостаточная квалификация сотрудников, которые проводят учет результатов анализа.

10.2. Внешний контроль качества

10.2.1. Внешний контроль качества (ВКК) проводится в соответствии с тестовой программой, состоящей из многочисленных испытуемых образцов, которые с определенной периодичностью одновременно направляются в разные лаборатории для проведения исследования с целью получения среднестатистических погрешностей методов анализа и достоверности полученных результатов идентификации. По результатам ВКК составляют отчеты. Проведение ВКК позволяет измерить сте-

Содержание

I. Область применения.........................................................................................4

И. Отбор проб, хранение и транспортирование биологического

материала для иммунологических исследований.......................4

III.    Иммунологические методы лабораторной диагностики паразитарных

болезней...........................................................................................7

IV.    Оценка результатов реакции иммунофермептного анализа.......................13

V.    Реакция непрямой иммунофлюоресценции...................................................15

VI.    Реакция непрямой (пассивной) гемап'лютинации........................................16

VII.    Иммунохроматографичсский анализ.............................................................18

VIII.    Регистрация и учет результатов иммунологических исследований...........18

IX.    Требования к проведению иммунологических исследований....................18

X.    Контроль качества. Общие требования..........................................................20

XI.    Общая характеристика паразитозов и порядок проведения

иммунологических исследований при диагностике

паразитарных болезней................................................................21

Приложение 1. Журнал регистрации и учета иммунологических

исследований на паразитарные болезни.....................................45

Приложение 2. Протокол проведения иммунологических исследований .........47

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

15 февраля 2018 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Иммунологические методы лабораторной диагностики паразитарных болезней

Методические указания МУК 4.2.3533—18

I. Область применения

1.1.    Настоящие методические указания предназначены для специалистов паразитологических, микробиологических лабораторий Роспотребнадзора, медицинских организаций, а также научно-исследовательских институтов (структурных подразделений), осуществляющих лабораторную диагностику паразитарных болезней, а также могут быть использованы организациями, занимающимися лабораторной диагностикой паразитарных болезней, и носят рекомендательный характер.

1.2.    В методических указаниях изложен порядок применения методов иммунологической диагностики паразитарных болезней и отбора проб биологического материала.

П. Отбор проб, хранение и транспортирование биологического материала для иммунологических исследований

2.1. Отбор проб, хранение и транспортирование проб.

Общие положения

2.1.1.    При иммунологических исследованиях используют биологический материал от людей: кровь, спинномозговую жидкость, кал.

2.1.2.    Взятие крови для серологических исследований проводят в утренние часы после 12-часового ночного голодания. Накануне взятия проб крови пациент должен воздержаться от физических нагрузок,

приема алкоголя и лекарств. Оптимальным временем для взятия проб крови на лабораторные исследования является промежуток с 7 до 10 часов утра.

2.1.3.    Взятие спинномозговой жидкости (СМЖ) не требует определенных временных условий.

2.1.4.    Кал для исследований доставляется в лабораторию в день дефекации. Допускается хранение кала в течение ночи при температуре от 2 до 8 ?С. Следует избегать примесей мочи, выделений из половых органов.

2.2. Отбору храпение и транспортирование проб крови

2.2.1.    Взятие проб крови на исследование проводит медицинский персонал в процедурном кабинете медицинских организаций.

2.2.2.    Для проведения серологических исследований берется венозная кровь в объеме 3—5 мл или капиллярная кровь в объеме не менее 1 мл в стеклянные, пластиковые или вакуумные пробирки (вакутей-неры), предназначенные для биохимических и серологических исследований.

При проведении иммунологических исследований на паразитарные болезни используют пробирки без наполнителей и активаторов свертывания крови!

2.2.3.    Пробирки этикетируют в соответствии с данными направления на обследование (ФИО, возраст пациента, предварительный диагноз), проставляют дату взятия и номер анализа или используют штрих-кодирование пробирки.

2.2.4.    При транспортировании пробирки с кровью должны быть плотно закрыты, прочно установлены в штативы в вертикальном положении, чтобы предотвратить их встряхивание или опрокидывание, установлены вдали от нагревательных приборов и защищены от воздействия яркого солнечного света. Пробирки с кровью для серологических анализов транспортируют в термоконтейнерах с надписью: «пробы крови для лабораторных исследований». В термоконтейнере должна поддерживаться температура от 4 до 8 °С. Пробы крови от больного с установленным инфекционным диагнозом помещают в дополнительный вторичный контейнер, затем - в термоконтейнер с надписью: «пробы с инфицированным материалом» в соответствии с действующими нормативными документами. В журнале учета лабораторных исследований регистрируют время доставки проб в лабораторию.

2.2.5.    Центрифугирование проб крови проводят после полного свертывания крови в пробирках. Время свертывания зависит от типа вакуумных пробирок и составляет 1—2 часа. Перед проведением цен-

трифугирования проверяют, все ли пробирки, стаканы для них, вкладыши одинаковы по весу, форме. Для уравновешивания ротора при центрифугировании подбирают одинаковые пары пробирок и каждую из них устанавливают в симметричные противоположные гнезда ротора центрифуги. При непарном количестве проб можно использовать дополнительную пробирку с водой нужного объема. Пробирки центрифугируют в течение 10-—15 минут при 1 ООО—1 500 об./мип. При использовании вакуумных пробирок рекомендованная скорость центрифугирования - 3 500 об./мин.

После центрифугирования образцы сыворотки переносят в микропробирки. Микропробирки с образцами сыворотки маркируют в соответствии с этикеткой пробирки.

2.2.6.    Сроки хранения пробы сыворотки при температуре холодильника (4 °С) - не более 4 дней. Хранение проб сывороток от 7 дней до 1 года осуществляют в замороженном виде при температуре не выше минус 18 °С. Длительное хранение проб (более года) осуществляется при температуре не выше минус 40 °С. Длительное хранение пробы сыворотки приводит к частичной потере активности антител (АТ), особенно иммуноглобулинов класса М (IgM), за счет агрегации неспецифических иммуноглобулинов, что приводит к получению ложноположительных результатов.

2.2.7.    Транспортирование замороженных проб сывороток должно происходить при температурных условиях, не допускающих размораживания, с использованием сумки-холодильника, термоконтейнера или термоса со льдом, допускается использовать сухой лед.

2.2.8.    Сыворотку перед исследованием необходимо полностью разморозить и тщательно перемешать во избежание нарушения концентрации антител.

2.3. Отбор пробу хранение и транспортирование проб спинномозговой жидкости

2.3.1.    Пробы СМЖ собирают в любое время. Исследование проводят в день доставки материала. При доставке образцов СМЖ в лабораторию в течение 1 ч - пробы не охлаждают, до трех часов - пробы СМЖ следует хранить на льду, но не замораживать. Транспортирование следует осуществлять в термоконтейнере при температуре 4 °С.

2.4. Отбор проб, хранение и транспортирование проб кала

2.4.1.    Пробы кала (нативный, без консерванта) для исследования должны быть собраны в чистую сухую стеклянную (пластиковую) посуду с широкой горловиной.

2.4.2. Исследования проводят в день доставки материала в лабораторию или пробы замораживают. Пробы хранят при минус 18 °С до двух недель. Перед проведением исследования образцы необходимо разморозить.

ГО. Иммунологические методы лабораторной диагностики паразитарных болезней

3.1. Иммунологические методы

3.1.1.    Иммунологические методы диагностики гельминтозов и протозоозов относятся к косвенным методам, когда выявляются не сами паразиты, а их растворимые антигены (АГ) или специфические антитела, которые вырабатываются в организме инвазированного человека в ответ на поступление антигенов паразитов.

3.1.2.    Иммунологические методы являются дополняющими к комплексу паразитологических, клинических и лабораторно-инструментальных методов диагностики паразитарных болезней. В диагностике гель-минтозов и протозоозов применяются как методы определения специфических антител, гак и методы определения антигенов возбудителей.

Эффективность иммунологических методов исследования зависит от стадии инвазии, количества паразитов в организме, состояния иммунной системы инвазированного человека, особенностей организма возбудителя и места его локализации, а также от иммунохимических характеристик диагностического набора, условий хранения и сроков годности реагентов.

Одним из проявлений иммунного ответа является выработка антител. В ответ на поступление антигенов гельминтов в организме человека вырабатываются антитела всех известных классов. Однако использование иммунологических методов выявления антител при паразитарных инвазиях имеет ряд естественных ограничений: генетическая неоднородность популяционного иммунитета, перекрестные реакции с антигенами человека и возбудителя, наличие у паразитов механизмов защиты от иммунного ответа хозяина (молекулярная мимикрия, антигенная мозаичность, иммуносупрессивное действие). Все это обусловливает возможность регистрации ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Получение ложноположительных результатов происходит при наличии в крови пациента так называемых «перекрестно-реагирующих» антител, сходных по своим иммунохимическим свойствам со специфическими антителами (при синдроме поликлональной активации).

Ложноотрицательный результат может быть получен при проведении исследования пробы крови, содержащей низкий уровень антител, например: очень ранняя стадия инвазии, когда уровень специфических антител еще ниже порогового уровня их выявления; при хронической стадии инвазии описторхидами, если не было повторных заражений; при низкой интенсивности инвазии; при легочной локализации эхинококковой кисты, при обызвествлении ее оболочек; на фоне иммуноде-фицитных состояний вследствие сопутствующих хронических заболеваний или индуцированных приемом медикаментов (антибиотиков, глюкокортикостероидов, химио препаратов); при наличии в крови специфических антител и циркулирующих антигенов в эквивалентных количествах, что приводит к их связыванию в иммунные комплексы, не выявляющиеся диагностическим набором; при отсутствии в диагностическом наборе эпитопов антигена на имеющиеся в крови специфические антитела.

3.1.3.    Иммунологические методы определения антител к антигенам гельминтов и простейших широко используются для массового обследования населения конкретной территории, для оценки уровня эндемии в отношении какого-то паразита, для выявления групп лиц, находящихся в условиях высокого риска заражения (профессиональных, возрастных и т. д.), для оценки эффективности проводимых оздоровительных мероприятий, а также как вспомогательные методы при постановке диагноза паразитарного заболевания.

3.1.4.    Иммунологические методы выявления антител и антигенов гельминтов и простейших: иммуноферментный анализ (ИФА) (иммунофермент ный анализ антител, иммуноферментный анализ антигенов, иммуноферментное определение индекса авидности (ИА) антител класса G, иммунный блоттинг), иммунохроматографический анализ (ИХА), реакция непрямой гемагглютинации (РИГА), реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ).

Иммунологические исследования проводят с использованием наборов реагентов, зарегистрированных к применению на территории Российской Федерации в установленном законодательством порядке согласно инструкциям по их применению.

3.2. Иммуноферментный анализ

3.2.1. Реакция ИФА основана на специфическом взаимодействии антигена и антител с предварительной иммобилизацией (фиксацией) одного из компонентов реакции (антигена или антител) на твердофазном носителе в лунках полистироловых планшетов, стрипов и выявле-

нии образовавшегося комплекса «антиген-антитело» посредством ферментной метки (конъюгата).

3.2.2.    Выявление образовавшегося комплекса осуществляется по измерению интенсивности окраски - оптической плотности (ОП) субстратной смеси, содержащей вещество, с которым реагирует фермент, индикатор, изменяющий цвет под действием продуктов реакции «фермент-субстрат». Определяется ОП с помощью сканирующего спектрофотометра, оснащенного светофильтрами, с определенной длиной волны света: основная - 450 нм, референсная - 620 или 680 нм. Измерение проводится в единицах оптической плотности (ЕОП).

3.2.3.    При динамическом наблюдении больного с целью подтверждения диагноза и контроля эффективности лечения следует проводить повторные исследования ИФА, используя метод постановки парных сывороток крови от одного и того же больного, при котором одновременно исследуют два образца сыворотки крови: первый образец, сохраненный после первичного обследования (хранится в замороженном виде), второй образец - взятый в день повторного исследования.

3.2.4.    Набор реагентов для ИФА включает: иммуносорбент - твердофазный носитель с адсорбированным на нем активным ингредиентом системы (антигеном, моноклональными или поликлональными антителами); контрольные тест-сыворотки: диагностические, отрицательные, положительные, для контроля хода реакции и оценки результатов анализа; растворы конъюгатов; растворы хромогена и стоп-реагента; разводящие и отмывающие растворы.

3.3. Иммуноферментнмй анализ антител к антигенам паразитов

3.3.1. Принцип метода. Метод определения антител (иммуноглобулинов) к антигенам гельминтов и простейших представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ и основан на связывании специфических антител с иммобилизованными в лунках стрипов антигенами паразитов и образовании комплекса «антиген-антитело» на поверхности лунок. Несвязавшиеся в ходе реакции компоненты сыворотки удаляют. В лунки планшета добавляют конъюгат моноклональных антител против иммуноглобулинов классов IgA, IgM, IgG человека с пероксидазой хрена: в результате происходит включение ферментной метки в иммунный комплекс. Комплекс «антиген-антитело~конъюгат» выявляют цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы -перекиси водорода и хромогена - тетраметилбензидина (ТМБ). Затем в реакцию вносят стоп-реагент и измеряют оптическую плотность растворов в лунках: на основной длине волны - 450 нм, при референсной длине волны - 620—655 нм. Интенсивность окрашивания пропорцио-