Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Обнаружение патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом фермент-связанного флуоресцентного анализа с применением автоматического анализатора

Методические указания МУК 4.23262—15

Издание официальное

Москва • 2015

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Обнаружение патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом фермснт-связанного флуоресцентного анализа с применением автоматического анализатора

Методические указания МУК 4.2.3262—15

ББК 51.23 020

020 Обнаружение патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом фермент-связанного флуоресцентного анализа с применением автоматического анализатора: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2015.—18 с.

ISBN 978—5—7508—1404—6

1.    Разработаны: ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (А. И. Верещагин, М. В. Зароченцев, М. А. Ярославцева), ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Санкт-Петербурге» (Т. А. Гречанинова, Н. С. Григорьева), ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве» (Н. Я. Салова, Л. А. Лунина) при участии ООО «биоМерье Рус» (Т. Н. Душкина).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. № 1).

3.    Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 21 мая 2015 г.

4.    Введены впервые.

ББК 51.23

С Роспотребнадзор, 2015 €> Федеральный центр гигиены и

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2015

МУК 4.2.3262—15

Содержание

1.    Назначение и область применения.......................................................................4

2.    Метод измерений...................................................................................................5

3.    Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и

питательные среды................................................................................................5

3.1.    Средства измерений........................................................................................5

3.2.    Вспомогательные устройства........................................................................5

3.3.    Реактивы и питательные среды.....................................................................6

4.    Требования безопасности и квалификации операторов..........................................6

5.    Огбор и подготовка проб.......................................................................................6

6.    Проведение исследований.....................................................................................7

6.1.    Выявление бактерий рода Salmonella............................................................7

6.1.1.    Выявление бактерий рода Salmonella за 24 часа...............................7

6.1.2.    Выявление бактерий рода Salmonella за 48 часов.............................9

6.2.    Выявление Listeria monocytogenes...............................................................10

6.2.1.    Выявление бактерий вида Listeria monocytogenes за 24 часа.........11

6.2.2.    Выявление бактерий вида Listeria monocytogenes за 48 часов.......12

6.2.3.    Выявление и дифференциация бактерий вида

Listeria monocytogenes и Listeria spp.................................................13

6.3.    Выявление антигенов Escherichia coli 0157:Н7.........................................15

6.3.1.    Выявление антигенов штаммов Escherichia coli 0157:Н7

в пищевых продуктах........................................................................15

6.3.2.    Выявление антигенов штаммов Escherichia coli 0157:Н7

в пищевых продуктах и объектах внешней среды..........................17

3

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

21 мая 2015 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Обнаружение патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом фермент-связанного флуоресцентного анализа с применением автоматического анализатора

Методические указания МУК 4.2.3262—15

1. Назначение и область применения

1.1.    Настоящие методические указания устанавливают порядок обнаружения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом фермент-связанного флуоресцентного анализа с применением автоматического анализатора.

1.2.    Методические указания предназначены для специалистов лабораторий Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также иных организаций и учреждений, занимающихся вопросами оценки качества и безопасности пищевых продуктов, объектов окружающей среды, аккредитованных (лицензированных) на проведение соответствующих исследований в установленном порядке.

1.3.    Методические указания носят рекомендательный характер.

МУК 4.2.3262—15

2. Метод измерений

Качественное автоматизированное определение микроорганизмов в пищевых продуктах и объектах внешней среды основано на технологии фермент-связанного флуоресцентного анализа.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и питательные среды

3.1. Средства измерений

Автоматический иммуноферментный анализатор Автоматический пипеточный дозатор с одноразовыми наконечниками объемом от 100 до 1 ООО мкл

Весы лабораторные общего назначения 2-го и 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Вспомогательные устройства

Аппарат универсальный для встряхивания жидкости в колбах и пробирках (или другая аппаратура для встряхивания)

Водяная баня с терморегулятором, позволяющая поддерживать температуру от 0 до 100 °С Система для нагрева образцов в стрипах Термостат электрический, позволяющий поддерживать температуру 15—65 °С с отклонением от заданной температуры ± 1 °С Стерилизатор паровой медицинский или аналогичный

Гомогенизатор бактериологический перистальтического типа со стерильными пластиковыми (или другими выдерживающими условия стерилизации) пакетами

5

Холодильник бытовой электрический Ламинарный бокс

Облучатель бактерицидный настенный (или других видов)

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.3. Реактивы и питательные среды Наборы для определения:

-    Salmonella,

-    Listeria monocytogenes Xpress,

-    Listeria monocytogenes II,

-    Listeria Duo,

-    Escherichia coli 0157, основанные на технологии ИФА.

Примечание. Допускается использование реактивов и питательных сред с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.    Требования безопасности и квалификации операторов

Исследования пищевых продуктов и объектов окружающей среды методом наиболее вероятного числа с применением автоматического экспресс-анализатора проводят в соответствии с СП 1.3.2322—08 «Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

5.    Отбор и подготовка проб

Отбор проб проводят с учетом требований нормативно-технической документации на конкретный вид продукта (образца из внешней среды) в асептических условиях с использованием стерильного оборудования. Подготовку проб осуществляют с применением аппаратуры и

МУК 4.2.3262—15

материалов, указанных в международных, межгосударственных и национальных стандартах.

6. Проведение исследований

6.1. Выявление бактерий рода Salmonella

Тесты Salmonella предназначены для качественного определения бактерий рода Salmonella в продуктах питания и образцах внешней среды путем автоматической иммуноконцентрации сальмонелл после предварительного неселективного обогащения с последующим автоматизированным определением сальмонелл.

Реактивы, необходимые для анализа, находятся в лунках стрипа. Все этапы анализа выполняются прибором автоматически. Реакционная смесь циркулирует в наконечнике и переносится из лунки в лунку. Часть бульона обогащения (инкубированного в бульоне обогащения образца) вносится в стрип. Антигены Salmonella связываются с антителами, нанесенными на внутреннюю поверхность наконечника. Несвязанные компоненты удаляются на этапе отмывки. Далее к реакционной смеси добавляются антитела, связанные со щелочной фосфатазой, и антигены Salmonella, связанные с антителами на внутренней поверхности наконечника, связываются с ними. Несвязанные компоненты удаляются на этапе отмывки.

На этапе определения осуществляется циркуляция реакционной смеси в лунке, содержащей субстрат (4-метил-умбелифсрилфосфат). Фермент в реакционной смеси катализирует гидролиз субстрата до флуоресцирующего продукта (4-метил-умбелиферона), флуоресценция которого измеряется при 450 нм. На конечном этапе прибор автоматически анализирует полученные значения, сравнивает их с внутренними контрольными значениями (порогами) и выдает результат (положительны й/отрицательный).

6.1.1. Выявление бактерий рода Salmonella за 24 часа

Метод качественного определения бактерий рода Salmonella в продуктах питания и образцах внешней среды с использованием анализатора за 24 ч.

7

б. 1.1.1. Алгоритм проведения исследования

Навеску продукта (образца из внешней среды), в массе (объеме) которой предусматривается отсутствие бактерий рода Salmonella в соответствии с нормативно-технической документацией на анализируемый продукт (образец из внешней среды), стерильно вносят в забуференную пептонную воду.

Соотношение массы (объема) продукта (образца из внешней среды) и забуференной пептонной воды - 1 : 9 по объему.

Стерильно и без промедления вносят добавку в соотношении 1 мл на 255 мл забуференной пептонной воды.

Посевы термостатируют при температуре (41,5 ± 1)°С в течение 18—24 4.

По окончании инкубации переносят 2—3 мл в пробирку. Нагревают (5±1)мин при 95—100°С, охлаждают, перемешивают и вносят 0,5 мл в лунку для образца на стрипе.

Начинают анализ, как это описано в руководстве пользователя. Полностью автоматизированный анализ завершают приблизительно через 45 мин. После окончания анализа результаты распечатываются автоматически.

6.1.1.2. Интерпретация результатов

Прибор автоматически анализирует полученные значения, сравнивает их с внутренними контрольными значениями (порогами). При пределах значения теста меньше 0,25 результат интерпретируется как отрицательный (Negative); при значении больше или равном 0,25 - как положительный (Positive). Результат теста со значением меньше порогового свидетельствует о том, что образец не содержит антигенов Salmonella либо их титр ниже порога определения. Результат со значением больше порогового или равным пороговому свидетельствует о том, что в образце содержатся антигены Salmonella.

Все положительные результаты теста требуют подтверждения.

Для подтверждения положительного результата возможно:

•    использование селективного/хромогенного агара для получения типичных колоний;

•    использование идентификации на стрипе API типичной колонии, выделенной на авизованной среде.

МУК 4.2.3262—15

6.1.2. Выявление бактерий рода Salmonella за 48 часов

Метод качественного определения бактерий рода Salmonella в продуктах питания и образцах внешней среды с использованием анализатора за 48 ч.

6.1.2.1.    Алгоритм проведения исследования

Предварительное обогащение.

Навеску продукта (образца из внешней среды), в массе (объеме) которой предусматривается отсутствие бактерий рода Salmonella в соответствии с нормативно-технической документацией на анализируемый продукт (образец из внешней среды), стерильно вносят в забуференную пептонную воду.

Соотношение массы (объема) продукта (образца из внешней среды) и забуференной пептонной воды - 1 : 9 по объему.

Посевы термостатируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 16—20 ч.

Обогащение.

После инкубации переносят 0,1 мл предварительно обогащенной суспензии в 10 мл бульона RVS. Инкубируют 6—8 ч при (41,5 ± 1) °С.

Вторичное обогащение.

По окончании инкубации переносят 1 мл бульона RVS в 10 мл бульона М. Инкубируют повторно бульон RVS при (41,5±1)°С 16—20 ч. Бульон М инкубируют при (41,5 ± 1) °С 16—20 ч. По окончании инкубации гомогенизируют бульон М. Нагрвают (15 ± 1)мин при (95—100)°С, охлаждают, перемешивают и вносят 0,5 мл в лунку для образца на стриле. Бульоны М и RVS хранят при 2—8 °С до окончания анализа (для подтверждающего теста).

Начинают анализ, как это описано в руководстве пользователя. Полностью автоматизированный анализ завершается приблизительно через 45 мин. После окончания анализа результаты распечатываются автоматически.

6.1.2.2.    Интерпретация результатов

Прибор автоматически анализирует полученные значения, сравнивает их с внутренними контрольными значениями (порогами). При пределах значения теста меньше 0,23 результат интерпретируется как отрицательный (Negative); при значении больше или равном 0,23 - как положительный (Positive). Результат теста со значением меньше порогово-

9