Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение количества микроорганизмов в пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом наиболее вероятного числа с применением автоматического экспресс-анализатора

Методические указания МУК 4.2.3261—15

Издание официальное

Москва • 2015

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение количества микроорганизмов в пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом наиболее вероятного числа с применением автоматического экспресс-анализатора

Методические указания МУК 4.2.3261—15

ББК 51.23 062

062 Определение количества микроорганизмов в пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом наиболее вероятного числа с применением автоматического экспресс-анализатора: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2015.—27 с.

ISBN 978—5—7508—1402—2

1.    Разработаны ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (А. И. Верещагин, М. В. Зароченцев,

М. А. Ярославцева), ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Санкт-Петербурге» (Т. А. Гречанинова, Н. С. Григорьева), ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве» (Н. Я. Салова, Л. А. Лунина), ФГБНУ «НИИ питания» (С. А. Шевелева, Н. Р. Ефимочкина, И. Б. Быкова) при участии ООО «биоМерье Рус» (Т. Н. Душкина).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. № 1).

3.    Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 21 мая 2015 г.

4.    Введены впервые.

ББК 51.23

ISBN 978—5—7508—1402—2

© Роспотребнадзор, 2015 © Федеральный центр гигиены и

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2015

МУК 4.2.3261—15

Содержание

1.    Назначение и область применения.......................................................................4

2.    Метод измерений...................................................................................................5

3.    Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и

питательные среды................................................................................................5

3.1.    Средства измерений........................................................................................5

3.2.    Вспомогательные устройства........................................................................5

3.3.    Реактивы и питательные среды.....................................................................6

4.    Требования безопасности и квалификации операторов..........................................6

5.    Отбор и подготовка проб.......................................................................................7

6.    Подготовка к исследованию..................................................................................7

7.    Проведение испытаний..........................................................................................8

7.1.    Определение количества аэробных мезофильных микроорганизмов

в пищевых продуктах.....................................................................................8

7.2.    Определение общего числа БГКЛ (колиформ) в пищевых продуктах.....10

7.3.    Подсчет БГКП (колиформ) в пищевых продуктах.....................................12

7.4.    Подсчет Eshcerichia colt в пищевых продуктах..........................................14

7.5.    Подсчет энтеробактерий в пищевых продуктах.........................................16

7.6.    Подсчет Staphylococcus aureus в пищевых продуктах...............................18

7.7.    Подсчет лактобактерий в пищевых продуктах...........................................20

7.8.    Подсчет дрожжевых и плесневых грибов в пищевых продуктах.............22

7.9.    Определение микробного загрязнения объектов окружающей среды

методом смывов............................................................................................24

8.    Обработка результатов........................................................................................26

9.    Ограничение метода.............................................................................................27

3

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

21 мая 2015 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение количества микроорганизмов в пищевых продуктах и объектах окружающей среды

методом наиболее вероятного числа с применением автоматического экспресс-анализатора

Методические указании _МУК    4.2.3261—15_

1. Назначение и область применения

1.1.    Настоящие методические указания устанавливают порядок количественного учета микроорганизмов в пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом наиболее вероятного числа с применением автоматического экспресс-анализатора.

1.2.    Методические указания предназначены для специалистов лабораторий Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также иных организаций и учреждений, занимающихся вопросами оценки качества и безопасности пищевых продуктов, объектов окружающей среды, аккредитованных (лицензированных) на проведение соответствующих исследований в установленном порядке.

1.3.    Методические указания носят рекомендательный характер.

МУК 4.2.3261—15

2. Метод измерений

2.1.    Количественный учет микроорганизмов основан на методе наиболее вероятного числа, принцип которого заложен в технологию карт.

2.2.    Определение количества микроорганизмов в пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом наиболее вероятного числа основано на высеве продукта и (или) разведений навески продукта или смывной жидкости в жидкую питательную среду, инкубировании посевов, учете видимых признаков роста микроорганизмов, пересеве при необходимости культуральной жидкости на агаризованные среды для подтверждения роста микроорганизмов, подсчете их количества с помощью таблицы НВЧ (ГОСТ ISO 7218-2011 пп. 10.5.6.2.2, 10.5.7).

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и питательные среды

3.1. Средства измерений Автоматический экспресс-анализатор, состоящий из двух блоков: станции пробоподготовки и станции учета результатов.

Станция пробоподготовки служит для приготовления суспензии, создания связи между информацией об образце и среде и картой в специальной программе заполнения и запаивания карт. Карта содержит 48 ячеек (лунок) различного объема, 16 лунок объемом 0,00225 см³, 16 лунок объемом 0,0225 см³ и 16 лунок объемом 0,225 см³ Весы лабораторные общего назначения 2-го и 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Вспомогательные устройства Гомогенизатор бактериологический перистальтического типа со стерильными

5

пластиковыми (или другими выдерживающими

условия стерилизации) пакетами

Пипетки градуированные вместимостью

0,1 см³; 1,0 см³    ГОСТ 29227-91

Карты для инкубации микроорганизмов

Штатив для заполнения карт

Контейнер для культивирования

Диспенсер

Облучатель бактерицидный настенный (или других видов)

Ламинарный бокс

Термостат электрический, позволяющий поддерживать температуру 28—40 °С с отклонением от заданной температуры ± 1 °С.

Стерилизатор паровой медицинский или аналогичный

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

3.3. Реактивы и питательные среды Вещества, используемые для разведения образца и питательной среды:

-    0,1 %-я пептонная вода;

-    1 %-я забуференная пептонная вода;

-    вода для разведения с фосфатным буфером;

-    вода дистиллированная;

-    раствор натрия гидрофосфата двухзамещенного;

-    питательные среды (TVC, АС, ТС, СС, ЕС,

ЕВ, STA, LAB, YM)

Примечание. Допускается использование реактивов и питательных сред с аналогичными или лучшими характеристиками.

4. Требования безопасности и квалификации операторов

Исследования пищевых продуктов и объектов окружающей среды методом наиболее вероятного числа с применением автоматического экспресс-анализатора проводят в соответствии с СП 1.3.2322—08 «Безо-

МУК 4.2.3261—15

пасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

5. Отбор и подготовка проб

Отбор проб проводят с учетом требований нормативно-технической документации на конкретный вид продукта (образца из внешней среды) в асептических условиях с использованием стерильного оборудования. Подготовку проб осуществляют с применением аппаратуры и материалов, указанных в международных, межгосударственных и национальных стандартах.

6. Подготовка к исследованию

6.1.    Подготовленную для исследования навеску образца и необходимый объем растворителя, выдержанного до температуры 18—25 °С, асептично вносят в специальный пакет. Для приготовления раствора образец разводят 1:10 (первичное разведение). Для разведения образца используют любой из растворителей: 0,1 %-я пептонная вода, 1 %-я за-буференная пептонная вода, вода для разведения с фосфатным буфером. Содержимое пакета гомогенизируют при помощи гомогенизатора бактериологического перистальтического типа со стерильными пластиковыми пакетами.

6.2.    При исследовании объектов окружающей среды методом смывов забор образца осуществляют предварительно смоченным в растворителе стерильным тампоном. Сразу после смыва тампон переносят в пробирку, содержащую 10 см³ растворителя. Для разведения образца используют любой из растворителей: 0,1 %-я пептонная вода, 1 %-я за-буференная пептонная вода, вода для разведения с фосфатным буфером. Содержимое пробирки тщательно перемешивают. Полученное разведение соответствует разведению 1:10 (первичное разведение).

7

7. Проведение испытаний

7.7. Определение количества аэробных мезофильных микроорганизмов в пищевых продуктах

Определение общего микробного числа основано на способности микроорганизмов продуцировать внеклеточные ферменты. В состав питательной среды входит специфический субстрат, меченый 4-метилум-белифероном. Во время роста микроорганизмы выделяют в культуральную жидкость ферменты, которые расщепляют субстрат, в результате чего освобождается свободный 4-метилумбелиферон, обладающий флуоресцентной способностью. Количество продуктов реакции прямо пропорционально численности популяции микроорганизмов. Наличие флуоресцентнго сигнала считывается и фиксируется в автоматическом режиме ридером. В зависимости от количества и объема положительных лунок, а также разведения производится подсчет общего числа микроорганизмов в исходном образце методом наиболее вероятного числа в автоматическом режиме.

Готовят необходимое количество флаконов со средой из расчета: один флакон на один образец. Флаконы выдерживают до достижения комнатной температуры.

Диспенсер со стерильной дистиллированной водой устанавливают на объем 3,9 см³ для получения рекомендуемого разведения 1 :400. Удаляют воздух из трубок подачи жидкости и носика, сливают две первых порции растворителя.

Включают станцию пробоподготовки.

Следуя инструкциям программного обеспечения, вносят данные об образце (вручную с клавиатуры или с помощью сканера).

При помощи диспенсера для растворения среды 3,9 см³ стерильной дистиллированной воды асептически вносят во флакон со специальной питательной средой TV С или АС (для определения количества аэробных мезофильных микроорганизмов).

Из секции пакета, содержащей профильтрованный образец, отбирают 0,1 см³ стерильной пипеткой и переносят во флакон со средой. Содержимое флакона гомогенизируют в течение трех секунд на гомогенизаторе типа вортекс. Объем полученной суспензии должен составлять 4,0 см³.

Готовят одну карту для определения количества аэробных мезофильных микроорганизмов для каждого флакона с суспензией. Во избе-

МУК 4.2.3261—15

жание контаминации запрещается дотрагиваться до кончика транспортной трубочки. Цветовая маркировка карты и флакона должны совпадать.

Связывают номер образца со штрих-кодами соответствующих карты и флакона при помощи сканера для штрих-кодов станции пробопод-готовки, следуя инструкциям программного обеспечения станции про-боподготовки.

Флакон с суспензией помещают в штатив для заполнения карт. Карту помещают в соответствующий слот и осторожно помещают транспортную трубочку во флакон со средой. Штатив рассчитан максимально на шесть флаконов и карт и позволяет одновременно заполнять 1—6 карт.

Штатив для заполнения карт помещают в вакуумную станцию для заполнения карт и начинают цикл заполнения. Суспензия из флакона полностью всасывается в карту. После заполнения транспортные трубочки срезаются, и карты запаиваются. Все операции в станции заполнения карт выполняются станцией автоматически и занимают несколько минут. Цикл заполнения одинаков для всех карт и всех разведений, что позволяет одновременно заполнять разные карты.

Штатив для заполнения карт удаляют из вакуумной станции и визуально проверяют полноту заполнения (флакон должен быть пуст). Карты вынимают из штатива для заполнения и выгружают в штатив для инкубации и считывания. Карты вставляют в слоты таким образом, чтобы штрих-код карты был обращен к ручке штатива. Каждый штатив рассчитан на 20 карт. Запрещается вставлять карты между слотами.

Карты инкубируют в термостате при температуре (30 ± 1) °С в течение 24—48 ч или 40—48 ч в зависимости от типа продукта в соответствии с инструкцией производителя.

По окончании инкубации включают станцию учета результатов.

Штатив для инкубации и считывания с картами помещают в ридср. Ридер сканирует штрих-код каждой карты, считывает флуоресценцию в лунках и интерпретирует результат. В процессе считывания карты считываются последовательно одна за другой. Связывание образца с типом теста, разведением и полученными результатами происходит автоматически.

На экране станции учета результатов отображается результат в КОЕ/г (КОЕ/см³, КОЕ/мл) исходного продукта.

По окончании теста карты удаляются из штатива для инкубации и сбрасываются в контейнер для утилизации.

9