Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучии человека
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции
Методические указания МУК 4.2.3065—13
ББК51.9 Л12
Л12 Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции: Ме
тодические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2013.—63 с.
1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е. Б. Ежлова, А. А. Мельникова, Н. А. Кошкина): ФБУЗ «Федеральный центр пилены и эпидемиоло-П1И» Роспотребнадзора (М. В. Зарочснпсв, И. В. Новокшонова); ФБУН «Московский научно-исслсловатсльский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Роспотребнадзора (И. К. Мазурова,
О. IO. Борисова, С. Ю. Комбарова, В. Г. Мельников. Н. М. Максимова,
Т. Н. Якимова); ФБУЗ «Центр гитены и эпидемиологии в г. Москве» Роспотребнадзора (И. Я. Салова, И. П. Трсбунскнх).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы но надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 года № I).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 14 июля 2013 г.
4. Разработаны взамен МУ 4.2.698—98 «Лабораторная диашостика дифтерийной инфекции».
ББК51.9
© Роспотребнадзор, 2013 © Федеральный центр гигиены и
энндемноло! ни Роспотребнадзора, 2013
МУК 4.2.3065—13
На тсллуритовой среде без крови (коринебакагар) колонии С. diphtheriae через 24 ч роста мелкие (иногда 0,2—0,6 мм), через 48 ч роста размер колоний увеличивается до 1,0—1,2 мм, иногда наблюдаются «гигантские» колонии. Однако морфология колоний изменяется -исчезает исчерченность края, к 48 ч колонии меняют характерную для С. diphtheriae архитектонику - плоские, «расползающиеся» по поверхности агара, иногда меняется цвет колоний.
Помимо относительно условной оценки морфологии колоний на питательной среде первичного посева существует несколько других признаков, позволяющих различать биовары gravis, mitis, intermedins. Например, характерный рост на бульоне в пробирке: для биовара gravis - поверхностная пленка, бульон прозрачен, на дне пробирки через 24 ч организуегся осадок; для биовара mitis - диффузное помугнение среды с образованием осадка, для биовара intermedins - тонкое гранулярное по-мугнснис с последующим оседанием гранул на дно пробирки.
На кровяном агаре можно наблюдать гемолиз эритроцитов (кроличьих и крупного рогатого скота) при росте биовара mitis, гемолиз только кроличьих эритроцитов при росте биовара gravis и отсутствие гемолиза при росте биовара intermedins. Однако только бновар intermedins обладает липофильностью - способностью усиливать рост на среде с 0,3 % твина - 80.
Морфология клетки
Для С. diphtheriae характерен значительный полиморфизм - разнообразие размеров и формы клеток. Клетки имеют форму булавы, ракетки, палочки, овоида и т. п. Клетки С. uleerans и С. pseudotuberculosis чаще всего имеют овоидную форму. На средах КТА овоидную форму часто приобретают токсигенные С. diphtheriae. Взаиморасположение клеток напоминает римские цифры X, V, иногда - «китайские иероглифы». Подобную форму клетки приобретают при делении. Возможно параллельное расположение клеток, что особенно характерно для С. pseudodiphtlieriticum и С’, pseudotuberculosis.
При окраске часто обнаруживается выраженная внутриклеточная исчерченность, что объясняется наличием зерен волютина (метахрома-тические гранулы, тельца Бабсша-Эрнста). Описано сродство волютина к метиленовому синему (окраска по Лёффлеру), поэтому при обработке этим красителем гранулы или полоски (скопления гранул) прокрашиваются в синий цвет, а протоплазма в отдельных случаях может приобрести розовый оттенок. В бактериологической практике окраску по Граму не используют, поскольку клетки С. diphtheriae легко обесцвечиваются спиртом и могут выглядеть в мазке как грамотрицательные микроорга-
11
низмы. При окраске по Нсйсссру, которую также редко используют, клетки С. diphtheriae окрашиваются в желтый цвет с зернами вол юти на (на концах клетки) темно-коричневого цвета, иногда с синим оттенком.
Ферментат ив и а я акт ив ноет ь
Ферментативная активность коринебактерий изучается путем определения ферментов цистиназы, уреазы, способности расщеплять до кислоты глюкозу, сахарозу и крахмал (табл. 1). С. diphtheriae продуцируют фермент цистиназу, отсутствует продукция фермента уреазы, разлагают глюкозу, крахмал (биовар gravis), нс разлагают сахарозу. Биовар mil is не разлагает крахмал. С. diphtheriae способны восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты).
Токсигенные свойства
С. diphtheriae, вызывающие заболевание дифтерией, обладают ток-сигенными свойствами. Основными генами патогенности С. diphtheriae, отвечающими за токсинообразованис, являются ген дифтерийного токсина - tox и регуляторный ген - dtxR. 55—65 % токсигенных С. diphtheriae, циркулирующих в период спорадической заболеваемости дифтерией, имеют изменения (мутации) в этих генах, некоторые из них приводят к повышению уровня токсинообразования. Подобные изменения характеризовали большинство штаммов С. diphtheriae, распространенных в 90-е годы во время эпидемии дифтерии в России и вызвавшие тяжелые формы клинического течения заболевания.
Уровень токсинообразования штаммов С. diphtheriae биовара gravis в два-четыре раза превышал уровень токсинообразования биовара mil is, вызывая более тяжелое клиническое течение дифтерии в период последней эпидемии. Также, начиная с 90-х годов прошлого столетия, биовар gravis имеет доминирующее распространение среди токсигенных С. diphtheriae, в то время как среди нетоксигенных С diphtheriae доминирующее распространение имеет биовар mitis. От 2,0 до 20,0 % этой группы в различные периоды эпидпроцесса составляли штаммы, несущие «молчащий» ген дифтерийного токсина (fov-гсн), нс способный к экспрессии дифтерийного токсина, так называемые нетоксигенные ток-снесущие штаммы С. diphtheriae биовара mitis, эпидемиологическое значение которых до конца не изучено. Для циркуляции С. diphtheriae характерна периодическая смена доминирующего биовара, которая, как правило, совпадает с началом интенсификации эпидпроцесса.
В период спорадической заболеваемости сокращена циркуляция токсигенных С. diphtheriae, вместе с тем циркуляция нетоксигенных остаётся на высоком уровне.
12
МУК 4.2.3065—13
Несвоевременное выявление носителей токсигенных С. diphthcriae бактериологическим методом приводит к «скрытому» распространению возбудителя дифтерии и возникновению новых очагов дифтерийной инфекции.
4. Требовании к взятию и транспортированию материала дли бактериологической диагностики дифтерии
Эффективность проведения бактериологического исследования в значительной степени зависит от своевременного правильного взятия материала и соблюдения сроков доставки его в бактериологическую лабораторию.
Для взятия материала используют коммерческие стерильные сухие ватные (или дакроновые) тампоны, также возможно их приготовление в лабораторных условиях с учетом требований нормативно-методической документации. Тампоны должны иметь форму «капли», а не «веретена».
Материал из ротоглотки и носа берут отдельными тампонами, натощак или не ранее, чем через 2 ч после еды, а также до применения полоскания или других видов лечения. Взятие материала осуществляют при хорошем освещении, с использованием шпателя, нс касаясь тампоном языка и внутренних поверхностей щек и зубов. Одним тампоном собирают материал с участков ротоглотки - миндалин, дужек мягкого неба, небного язычка, при необходимости - с задней стенки глотки. При наличии налетов патологический материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном. Для взятия материала из носа используют другой тампон, который вводят глубоко сначала в один, а потом в другой носовой ход, собирая материал со стенок и перегородки носа, при этом не касаясь крыльев носа снаружи.
При дифтерии других локализаций (глаза, уши, кожа, раны, гениталии и пр.) помимо материала из пораженных участков забирают материал из ротоглотки и носа. При показаниях к обследованию на дифтерию и одновременном наличии пораженных слизистых и кожи в углу рта («за-еды») обследование этих участков проводят отдельным тампоном и параллельно беруг материал из ротоглотки и носа.
При прямой ларингоскопии материал (слизь, пленка) собирают непосредственно из гортани. В случаях оперативного вмешательства для бактериологического исследования следует брать слизь из интубационной трахеотомической трубки.
При взятии материала с пораженного участка кожи необходимо протереть его поверхность промокательными движениями стерильной марлевой салфеткой или тампоном, смоченными стерильным физиоло-
13
гическим раствором, осторожно приподнять или отодвинуть струпы и корочки. После этого тампоном, предназначенным для взятия материала на дифтерию, взять секрет с пораженного участка. Одновременно забирают материал из ротоглотки и носа.
При постмортальном исследовании для выявления возбудителя дифтерии материал следует брать с миндалин, гортани и полости носа (слизь, пленки), при редких локализациях - со слизистой пищевода и желудка. Учитывая, что дифтерия является токсикоинфекцией, другие органы (сердце, печень и пр.) обследуют только для выявления токсических поражений.
Тампоны должны быть доставлены в лабораторию не позднее чем через 3 ч после взятия материала. В холодное время года для предотвращения замерзания исследуемый материал доставляют в бактериологическую лабораторию в сумках - термосах.
При невозможности доставки исследуемого материала в баклабора-торию в установленные сроки (не позднее 3 ч) или проведения обследования в Л ПО во второй половине дня материал из ротоглотки (зева) и носа засевают «площадкой» с последующим рассевом на одну чашку Петри с питательной средой, разделенной пополам («чашечный метод»). После этого посевы помещают в термостат при 37 °С до утра следующего дня, после чего доставляют в сумках-термосах в баклабораторию (с указанием времени посева материала). При редких локализациях посев материала из каждого пораженного участка осуществляют на отдельную чашку Петри с питательной средой.
Медицинский персонал ЛПО должен проходить инструктаж в ба-клаборатории о правилах взятия и посева материала на питательные среды.
При невозможности организовать посев материала «чашечным методом» допускается засевать материал в пробирки с транспортной средой для сохранения и подращивания возбудителя дифтерии, которая готовится в лабораторных условиях согласно нормативно-методической документации. Не допускается использование коммерческих транспортных сред, предназначенных для исследования на микрофлору ротоглотки и носа, в связи с тем, что состав этих сред не удовлетворяет условиям культивирования возбудителя дифтерийной инфекции, что приводит к потере патологического материала.
В случае использования транспортной среды, приготовленной в лабораторных условиях, согласно нормативной документации, материал собирают сухим тампоном, опускают в пробирку со средой и следят за тем, чтобы пробка тампона не намокала. Следует учитывать, что приме-
14
МУК 4.2.3065—13
нение транспортной среды увеличивает срок выдачи окончательного ответа на одни сутки, так как после подращивания в термостате при 37 °С на утро следующего дня материал доставляется в баклабораторню для последующего посева на чашки Петри с селективной питательной средой.
Незасеянные (чистые) чашки Петри с питательной средой и пробирки с транспортной средой доставляются в ЛПО из баклабораторий. Хранение питательных сред в ЛПО осуществляется в холодильнике при 4—6 °С; чашки со средой - нс более трех дней; пробирки с транспортной средой - нс более 10 дней. Перед взятием и посевом материала их необходимо достать из холодильника и согреть до комнатной температуры. При невозможности доставки материала в баклабораторню круглосуточно ЛПО оснащаются термостатами. В стационаре взятие патологического материала проводят круглосуточно, используя «чашечный метод».
Исследуемый материал из ротоглотки и носа, собранный сухими ватными тампонами и помещенный в пробирки (не менее двух пробирок от одного лица, при редких локализациях добавляются дополнительные пробирки), или материал, засеянный в пробирки с транспортной средой (также не менее двух пробирок от одного лица), или материал из ротоглотки и носа, а также из редких мест локализации, засеянный «чашечным методом», должен быть четко пронумерован и иметь сопроводительную документацию. Пробирки с материалом от одного лица скреплены вместе.
В сопроводительном документе указывают: фамилию, имя, отчество, возраст, адрес обследуемого лица, название учреждения, направляющего материал, локализацию взятия материала (нос, зев, кожа и др.), дату и время взятия материала, цель обследования (диагностическая с указанием диагноза, по эпидпоказаниям, с профилактической целью).
5. Организационно-методическая работа
1. Медицинским работникам лечебно-профилактических организаций (ЛПО), ответственным за взятие и транспортирование материала при обследовании на дифтерию, необходимо согласовывать методику взятия материала, условия транспортирования и возможности применения транспортной среды с врачами-бактериологами. проводящими эти исследования.
2. Медицинским работникам ЛПО, допущенным к взятию и посеву материала, следует проходить инструктаж не реже 1 раза в год в бакла-боратории, проводящей исследования на дифтерию.
15
3. Врачам-бактериологам ЛПО и ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации следует повышать квалификацию на курсах тематического усовершенствования по лабораторной диагностике дифтерии нс реже 1 раза в три года.
4. Методическую помощь по вопросам взятия, транспортирования и лабораторной диагностики дифтерии осуществляют региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней II—IV групп патогенности (на базе ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации - далее Региональные центры но мониторингу) и Референс-центр по мониторингу за дифтерией (на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора - далее Референс-центр).
5. Бактериологические лаборатории ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации направляют все выделенные токсигенные и выборочно нстоксигснныс штаммы С. diphtheriae, С. ulcerans, С. pseudotuberculosis, а также штаммы с атипичными свойствами в Референс-центр для реидентификации (верификации) по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.
6. Бактериологические лаборатории Региональных центров по мониторингу и Референс-центр осуществляют внешний контроль качества лабораторных исследований на дифтерию, проводимых в бактериологических лабораториях субъектов Российской Федерации.
6. Бактериологическое исследование
6.1. Порядок проведения бактериологического исследования
Первый день. Посев материала
Материал для исследования из ротоглотки (зева), носа или других пораженных мест засевают раздельно на поверхность одной из рекомендуемых плотных питательных сред - КТА или Клауберг II, разлитых в чашки Петри («чашечный метод посева») (рис. 1).
Посев от одного лица производят на одну чашку, используя при этом половину поверхности (1Л) чашки среды для посева материала из ротоглотки (зева), а вторую - для посева материала из носа. При посеве материала с кожи или других пораженных мест добавляют еще одну чашку (все чашки маркируются). Не допускается посев материала от нескольких лиц на одну чашку.
При посеве материал тщательно втирают в среду со всех сторон тампона на участке площадью 2 х 1 см2 у края чашки, стараясь оставить весь патологический материал на поверхности формируемой «площад-
Содержание
1. Область применения..........................................................................................4
2. Общие положения. Сущность метода................................................................4
3. Характеристика возбудителя дифтерийной инфекции......................................9
4. Требования к взятию и транспортированию материала для
бактериологической диагностики дифтерии.....................................................13
5. Организационно-методическая работа............................................................15
6. Бактериологическое исследование..................................................................16
6.1. Порядок проведения бактериологического исследования........................16
6.2. Бактериологическое заключение...............................................................20
6.3. Схема бактериологического исследования...............................................22
7. Методики идентификации возбудителя дифтерийной инфекции...................23
7.1. Определение токсигснных свойств коринсбактсрий дифтерии
с помощью реакции преципитации в геле...............................................23
7.2. Методики определения биохимических признаков..................................30
8. Питательные среды..........................................................................................32
8.1. Методы приготовления питательных сред и реактивов............................34
8.2. Среды для определения биохимических свойств......................................39
9. Хранение контрольных штаммов в лабораторных условиях..........................42
10. Методы контроля питательных сред.................................................................
10.1. Метод бактериологического контроля питательных сред для
первичного посева и сред для определения токсигенных и биохимических свойств.............................................................................
10.2. Метод количественного определения аминного азота.......................... ^
11. Методика постановки реакции пассивной гемагглютинации для
выявления противодифтерийных антитоксических антител (РПГА)............ 4^
12. Нормативные и методические ссылки........................................................... ^
Приложение I. Рецепты красок......................................................................... 54
Приложение 2. Материалы и оборудование...................................................... ^
Приложение 3. Таблица и рисунки...................................................................
3
УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
14 июля 2013 г.
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции
Методические указания МУК 4.2.3065—13
1. Область применения
Методические указания (далее - МУ) предназначены для специалистов бактериологических лабораторий санитарно-эпидемиологической службы, лечебно-профилактических организаций независимо от их организационно-правовой формы и формы собственности и научно-исследовательских институтов, осуществляющих лабораторную диагностику дифтерийной инфекции.
2. Общие положения. Сущность метода
Бактериологическое исследование проводят с целью лабораторной диагностики дифтерийной инфекции, выявления источников инфекции, подтверждения эпидемиологических связей и наблюдения за распространением токсигенных коринебакгерий дифтерии. Цель бактериологического исследования - выявление возбудителя дифтерии с помощью минимального количества диагностических тестов, необходимых, достаточных и специфичных для получения достоверного ответа в максимально сжатые сроки: не менее трёх суток - отрицательный ответ, трёхчетырёх суток - ответ о выделении токсигенных коринсбактсрий дифтерии (возбудителя дифтерии), четырёх-пяти суток - ответ о выделении нстоксигснных коринсбактсрий дифтерии или других представителей этого рода.
Возбудитель дифтерии - коринебактерии дифтерии (Corvnebacte-пит diphtheriae), продуцирующие дифтерийный токсин (экзотоксин).
4
МУК 4.2.3065—13
Источником инфекции является больной или бактерионоситель токси-генных С. diphtheriae.
Нетоксигенные С. diphtheriae не вызывают дифтерийную инфекцию. «Этиологическая» значимость этих микроорганизмов при фарингите, артрите, эндокардите и др. гнойно-септических заболеваниях требует специальных доказательств. При выделении нетоксигенных штаммов С.diphtheriae от больных с подозрением на дифтерийную инфекцию следует обратить внимание на правильность проведения бактериологического исследования и оценку токсигснных свойств.
Способность С. diphtheriae вырабатывать экзотоксин опосредован феноменом фаговой (или лизогенной) конверсии. Конверсию нстокси-генных штаммов С. diphtheriae в токсигенные и наоборот можно воспроизвести в особых экспериментальных (лабораторных) условиях. В тех случаях, когда при первичном посеве исследуемого материала от больных дифтерией или бактерионосителей выделяют токсигенные, а при повторных обследованиях после лечения антибиотиками - нетоксигенные коринебактерии дифтерии, можно предположить, что токсигенные и нетоксигенные С. diphtheriae колонизировали слизистые ротоглотки и носа одновременно. При лечении антибиотиками в первую очередь исчезают токсигенные штаммы, как более чувствительные к их действию, а нетоксигенные штаммы продолжают выделяться. Обнаружение только нетоксигенных штаммов у бактерионосителей при повторных обследованиях после лечения нельзя трактовать, как утрату способности токсигенных штаммов продуцировать экзотоксин.
Таксономически близкими к виду С. diphtheriae являются Corynebacterium ulcerans и Corynebacterium pseudotubercidosis - природные патогены крупного и мелкого рогатого скота, лошадей, домашних животных, способные вырабатывать дифтериеподобный экзотоксин, в редких случаях могут вызывать заболевания у человека.
Известны случаи выделения токсигенных С. ulcerans при клинической картине заболевания, сходной с дифтерией, а также токсигенных С pseudotubercidosis, вызывающих лимфадениты. Инфекции, вызванные этими микроорганизмами, у человека встречаются крайне редко, не имеют эпидемического распространения, а, следовательно, значение этих случаев в медицине невелико.
На слизистых оболочках ротоглотки и носа в норме часто встречается Corynebacterium pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийная палочка Гофмана). Умение выделять и идентифицировать данные микроорганизмы, а также нетоксигенные С. diphtheriae служит критерием оценки
качества работы бактериологов, особенно в период снижения и спорадической заболеваемости дифтерией.
С. diphthereiae растут на питательных средах, сбалансированных по своему составу, и нс растут на простых питательных средах. Требуется кровь любого животного или человека (донора), как источник аминокислот, ростовых факторов, железа и пр. Нс всегда коммерческие среды удовлетворяют этим требованиям, поэтому контроль качества питательных сред и всех ингредиентов в лабораториях обязателен.
Кровяные теллуритовые среды (КТА, Клауберг II) остаются лучшими селективными дифференциально-диагностическими средами, обеспечивающими рост колоний через 24 ч, что на одни сутки сокращает сроки выдачи окончательного бактериологического ответа. КТА прост в приготовлении: основой этой среды являегся коммерческий сухой питательный агар (СПА), в качестве кровяных добавок используют кровь, однако не исключены любые гемолизированные кровяные добавки.
Трудоемкость бактериологического метода и стоимость анализа сокращается при использовании двух половин одной чашки с селективной дифференциально-диагностической питательной средой (далее плотная питательная среда) для посева материала из зева и носа от одного обследуемого. Использование Уа чашки для посева таких образцов на плотной питательной среде недопустимо, так как не позволяет, в большинстве случаев, получить рост изолированных колоний и провести исследование в установленные сроки.
Посев материала из зева и носа на кровяной агар производить нецелесообразно, так как очень сложно получить рост изолированных колоний C.diphtheriae на данной среде из-за обильного роста другой сопутствующей микрофлоры.
Колонии, морфология которых характерна для микроорганизмов рода Corynebacterium, в подавляющем большинстве нс подлежат микроскопии и должны быть изучены по всем необходимым идентификационным тестам. «Сомнительные» колонии с нехарактерными морфологическими свойствами подвергают микроскопии. Если в мазках обнаруживают коринеформные микроорганизмы, исследование следует продолжить по всем необходимым идентификационным тестам.
Окрашивание мазков осуществляют по Лёффлеру (щелочной метиленовый синий) или с использованием других синих красителей. Окраску по Граму не применяют, т. к. в процессе окраски клетки грамположи-тельных C.diphtheriae легко обесцвечиваются спиртом и могут выглядеть грамотрицательными (розовый оттенок). Чаще всего это явление наблюдают при окрашивании токсигенных С. diphtheriae (клеточная
МУК 4.2.3065—13
стенка токсигснных С diphtheriae ближе но организации и структуре к грамотрицательным микроорганизмам).
В бактериологической практике опираться только на морфологические свойства микробной клетки или колоний при идентификации С. diphtheriae недостаточно. Описаны случаи бактериологической гипо-и гипердиагностики (в 55,0 и 14,5 % случаев соответственно), когда использовали учет только морфологических признаков.
При идентификации С. diphtheriae необходим комплекс идентификационных тестов. Основной специфический тест для выявления возбудителя дифтерии, правильная постановка кагорого является залогом успешной диагностики дифтерийной инфекции, - определение у выделенной культуры способности к продукции дифтерийного токсина. Определять продукцию токсина следует начинать уже в первый день появления роста изолированных колоний на чашках с плотной питательной средой, исключая этап накопления чистой культуры. Не соблюдение этого правила увеличивает сроки исследования на одни сутки.
Во избежание ошибок при определении токсигенных свойств кори-небактерий необходимо изучать данный признак у максимального числа выросших колоний (двадцать и более) с чашек первичного посева. При множественном росте подозрительных колоний нельзя ограничиться формированием только одной-двух бляшек. Кроме того, необходимо изучать токенгенные свойства отдельных изолированных колоний, чтобы не потерять нетоксигенные штаммы С diphtheriae, присутствие которых также возможно при наличии токсигенных С. diphtheriae в патологическом материале.
Используют два способа постановки пробы на токсигснность:
1) модифицированная проба Элека с бумажными полосками, утверждённая для бактериологической практики в нашей стране в 1961 г.;
2) проба Фельдмана Ю. Г. и соавторов с бумажными дисками, разработанная в нашей стране и утвержденная в 1988 г., получившая одобрение Международной рабочей группы ВОЗ по лабораторной диагностике дифтерийной инфекции к применению в зарубежных лабораториях.
В пробе на токсигснность следует использовать только антитоксин - противодифтерийные антитоксические антитела, очищенные методом специфической сорбции, что позволяет избежать появления неспецифических линий преципитации микробного происхождения. В исключительных случаях при отсутствии антитоксина допускается использование лечебной противодифтерийной антитоксической лошадиной сыворотки. В таком случае возможно появление неспецифических линий
преципитации микробного происхождения, которые необходимо отличить от специфических линий токсического происхождения.
Обязательными являются биохимические тесты - на цистиназу, уреазу, расщепление глюкозы, сахарозы и крахмала. Тест на нитраты проводят только при положительной уреазной реакции. Использование других тестов, применяемых в некоторых зарубежных странах, необоснованно увеличивает продолжительность, трудоемкость, стоимость исследования и не всегда приводит к точной идентификации «недифтерийных» микроорганизмов (других представителей рода Corynebacte-rium). При лабораторной диагностике дифтерии не является обязательным определение видовой принадлежности «недифтерийных» корине-бактерий рода Corynebacterium, тем более что их идентификация требует отдельных хемотаксономических и молекулярно-генетических моголов исследования.
С. diphtheriae подразделяют на культурально-биохимические варианты (биовары) gravis, mitis, intermedins, belfanti. В бактериологической практике определению подлежат биовар gravis и объединенная группа «митисных форм» - mitis, intermedius, belfanti, т. е. группа микроорганизмов С. diphtheriae, которая не обладает амилазной активностью (не разлагает крахмал). Биовар belfanti нс подлежит отдельному определению, так как этот микроорганизм не способен продуцировать экзотоксин. В бактериологической диагностике отдельного выделения биовара intermedius также не требуется, так как относительно условными дифференцирующими признаками от биовара mitis являются только размер колоний и наличие липофильности. Таким образом, в бактериологической диагностике определяются токсигснныс и биохимические свойства С. diphtheriae биовара gravis и группы микроорганизмов, у которых отсутствует амилазная активность, объединённые в группу С diphtheriae биовар mitis.
Молекулярно-генетические методы для лабораторного выявления С. diphtheriae находятся в стадии разработки. Имеющиеся тест-системы для метода ПЦР не могут различить ген дифтерийного токсина токси-генных штаммов от «молчащего» гена дифтерийного токсина нетокси-генных токснссущих штаммов С. diphtheriae, не способных продуцировать токсин из-за мутаций в этом гене. Это может привести к гипердиагностике. Поэтому их использование в лабораторной диагностике диф-герии может иметь только вспомогательное значение - поиск нетокси-генных токснесущих штаммов С diphtheriae среди нетоксигенных штаммов.
8
МУК 4.2.3065—13
3. Характеристика возбудители дифтерийной инфекции
Род Corynebacterium гетерогенный, как и группа, условно объединившая его и другие роды грамположительных палочек, не образующих споры размером 0,3—0,8x1,5—8,0 мкм, неподвижных, обладающих различной степенью полиморфизма и плеоморфизма. C.diphtheriae имеют размер 0,2—0,6 х 1,0—7,0 мкм. Арабиногалактановый полимер клеточной стенки C.diphtheriae отличает этот вид от всех других видов рода Corynebacterium. Клеточная стенка С. diphtheriae имеет от 3—5 до 7—9 слоёв. Известно, что клеточная стенка токсигснных C.diphtheriae лучше дифференцирована и более тонкая по сравнению с клеточной стенкой нетоксигенных С. diphtheriae и других коринеформных микроорганизмов этого рода, что определяет их отношение к антибиотикам - токси-генные более чувствительны, чем нетоксигенные к пенициллину, эритромицину, тетрациклину и макролидам. Однако появляются штаммы С. diphtheriae устойчивые к некоторым антибиотикам, преимущественно выделенные от бактерионосителей.
Патогенные для животных Corymebacterium ulcerans и Corynebacterium pseudotuberculosis, некоторые комменсалы кожи со слизистых оболочек человека, например, Co/ynebacterium pseudodiphtheriticum (лож-нодифгерийная палочка Гофмана), Coiynebacterium xerosis, Corynebacterium striatum таксономически близки к виду С. diphtheriae.
Большинство видов лучше растет в аэробных условиях, в том числе и микроорганизмы вида С. diphtheriae. Вместе с тем, С. diphtheriae являются факультативными анаэробами (генерируют энергию, используя как молекулярный Оз, так и органические соединения), что крайне важно учитывать при изучении их ферментативной активности.
Вес коринсбактсрии, в т. ч. и С. diphtheriae, являются мезофнлами и растут при 36—37 °С.
Устойчивость к факторам внешней среды
С. diphtheriae устойчивы к низкой и чувствительны к высокой температуре (низкие температуры нс убивают дифтерийные палочки длительное время, под действием прямого солнечного света палочки дифтерии гибнут в течение нескольких дней); значительно устойчивы во внешней среде и длительно сохраняют жизнеспособность в дифтерийной пленке, в капельках слюны, на ручках дверей, детских игрушках до 15 дней; в пыли, на полу, на предметах в окружении больного до 18—40 дней; в сухой дифтерийной плёнке до 7 недель; в воде выживают в течение 6—20 дней. Корннебактерии дифтерии не устойчивы к действию физических и химических обеззараживающих средств и разрушаются под действием обычных дезинфектантов в обычных концентрациях (3—
5 %) при экспозиции 30 мин; погибают при нагревании до 60 °С в течение 10 мин, кипячение убивает их моментально.
Культурально-морфологические свойства
Обычно колонии микроорганизмов из рода Corynebacterium на плотных питательных средах (например, на кровяном агаре) имеют серовато-белую или желтую окраску, непрозрачные или полупрозрачные, приподнятые, округлой формы, диаметром 1—3 мм. Чаще всего они бывают мягкой, маслянистой консистенции, хотя некоторые виды рода Coiynebacterium могут образовывать шероховатые R- кол он и и и крошиться при прикосновении. На питательных средах, сбалансированных по своему составу и удовлетворяющих требованиям культивирования С. diphtheriae через 24—48 ч роста вариант mitis образует колонии S-типа - приподнятые, гладкие, диаметром 1—2 мм; S-R-колонии варианта gravis обычно выпуклые, с приподнятым центром, диаметром 2— 3 мм; колонии варианта intermedius - S-типа, мелкие, плоские, гладкие, с ровным краем, диаметром 0,5—1 мм.
На селективных дифференциально-диагностических средах - кровяной теллуритовый агар (КТА) и Клауберг 11 через 24—48 ч роста колонии С. diphtheriae варианта gravis имеют серо-черную или черную окраску с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, округлой формы, диаметром 1—3 мм, имеют радиальную исчерченность (форма «маргаритки») или выраженную краевую изрезанность, часто крошатся при прикосновении; колонии С. diphtheriae варианта mitis имеют серочерную или черную окраску («цвет мокрого асфальта»), непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, иногда плоские, округлой формы, диаметром 1—2 мм, чаще всего бывают мягкой, маслянистой консистенции или могут крошиться при прикосновении; колонии С. diphtheriae варианта intermedius имеют серо-черную окраску, мелкие, плоские, гладкие, с ровным краем, диаметром 0,5—1,0 мм, мягкой, маслянистой консистенции.
Морфология колоний С. ulcerans и С. pseudotuberculosis на КТА через 24—48 ч роста идентична морфологии колоний С. diphtheriae варианта gravis, серо-черной или черной окраски («цвет мокрого асфальта»), иног да с коричневым оттенком, колонии непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, округлой формы с радиальной ис-черченностью (или без неё), диаметром 1—2 мм. Колонии С. pseudo-diphtheriticum - серого цвета с характерным светлым ободком, непрозрачные, приподнятые, матовые, округлой формы, диаметром 1—2 мм.
