Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Идентификация микроорганизмов и определение чувствительности их к антибиотикам с применением автоматизированной системы для биохимического анализа

Методические указания МУК 4.2.2886-11

Издание официальное

Москва

2011

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Идентификация микроорганизмов и определение чувствительности их к антибиотикам с применением автоматизированной системы для биохимического анализа

Методические указания МУК 4.2.2886-11

МУК 4,2.2886—11

•    Стандарты мутности, подобные McFarland или ФГБУ «НЦЭСМГТ» или с аналогичными характеристиками,

*    Пластиковые расходные материалы (наконечники для пипетки, контейнер для стерилизации и хранения наконечников, 2- и 4-камерные кюветы).

Допускается применение других материалов, реактивов, питательных сред с аналогичными по назначению и свойствам характеристиками, адаптированных к системе, и разрешенных к применению в установленном порядке,

7. Проведение испытаний

7. L Идентификация микроорганизмов с применением планшетов

7. L L Экспресс-идентификация микроорганизмов

Для экспресс-идентификации в течение 5—6 ч 113 наиболее клинически значимых аэробных грамотрицательных оксидазоот-рицательных бактерий и грампозитивных бактерий применяют планшеты соответствующего назначения (4 теста/планшет; 23 биохимические реакции; 1 контроль).

Ход исследования. Войдите в программу MCN. В колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Ввод и правка образцов», в котором введите номер образца. Внизу укажите тип теста «I» и введите код таксона.

Приготовьте бактериальную суспензию из 24-часовой культуры микроорганизмов, выращенной строго на кровяном агаре без добавок. Если проводить культивирование на иной среде, то это приведет к изменению биохимических характеристик исследуемых микроорганизмов и, как следствие, к ложным результатам. Суспензию со значением мутности 2,0 по МакФарланду необходимо приготовить в 5 мл физиологического раствора. Перенесите полученную суспензию в 4-камерную кювету.

Внесите по 100 мкл бактериальной суспензии в следующие лунки планшета:

А1: В12 определение 1 Cl : D12 определение 2 El : F12 определение 3 Gl : Н12 определение4

Добавьте по 2 капли парафинового масла в следующие лунки (здесь и далее порядок расположения лунок указан согласно приведенной ниже схеме планшета):

А 4+5+6, В 4+5, С 4+5+6, D 4+5, Е 4+5+6, F 4+5, G 4+5+6, Н 4+5

МУК 4.2.2886—11

Схема планшета

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 А + + + В + -г С + + + D + + Е + + + F + + G + + + Н + + + — парафиновое масло

Накройте планшет специальной перфорированной пленкой, которая прилагается к набору. Использование перфорированной пленки гарантирует проникновение кислорода, необходимого для реакций. В то же время газовый обмен между ячейками планшета, нарушающий протекание реакций, становится невозможным.

Инкубируйте 5—6 ч при 37 °С.

По окончании инкубации снимите покрывающую планшет пленку и добавьте по 2 капли реактивов в следующие лунки:

*    пептидазный реагент — в лунки А 1+2+3, В 2, С 1+2+3, D 2, Е 1+2+3, F 2, G 1+2+3, Н 2;

*    индольный реагент — в лунки BL,D1,FI,H1.

Подождите не менее 5 мин (но не более 30 мин) для развития

окраски, после чего тщательно протрите дно лунок планшета фил ь-тровальной бумагой и проведите считывание на ридере. Для этого войдите в программу MCN. В колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Считывание». Нажмите «Старт» для начала считывания. Планшеты должны быть считаны в тот же день, на следующий день считывание невозможно.

После считывания проведите вычисление результатов. Для этого в программе MCN в колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Вычисление». Нажмите «Старт» для начала вычисления. Система выдаст полученные в ходе исследования результаты.

71.2. Идентификации энтеробактерий и других грамотрицательных оксидазоотрицательных бактерий

Для идентификации энтеробактерий и других грамотрицательных оксидазоотрицательных бактерий за 18—24 ч применяют планшеты соответствующего назначения (4теста/планшет; 21 биохимическая реакция; 4 контроля).

11

МУК 4.2.2886-11

Ход исследования. Войдите в программу MCN. В колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Ввод и правка образцов», в котором введите номер образца. Внизу укажите тип теста «Е» и введите код таксона.

Приготовьте бактериальную суспензию из 24-часовой культуры микроорганизмов, выращенной на кровяном агаре (с эритроцитами барана) или на простом питательном агаре. Если проводить культивирование на иной среде, то это приведет к изменению биохимических характеристик исследуемых микроорганизмов и, как следствие, к ложным результатам. Суспензию со значением мутности 0,5 (строго не более!) по МакФарланду необходимо приготовить в 5 мл физраствора. Перенесите полученную суспензию в 4-камерную кювету.

Внесите по 100 мкл бактериальной суспензии в следующие лунки планшета:

А1: В12 определение 1 Cl : D12 определение 2 El : F12 определение 3 Gl : Н12 определение 4

Добавьте по 2 капли парафинового масла в следующие лунки: В 1+2 определение 1 D 1+2 определение 2 F 1+2 определение 3 Н 1+2 определение 4

Накройте планшет Е специальной перфорированной пленкой, которая прилагается к набору. Использование перфорированной пленки гарантирует проникновение кислорода, необходимого для реакций. В то же время газовый обмен между ячейками планшета, нарушающий протекание реакций, становится невозможным. Инкубируйте 18—24 ч при 37 °С.

По окончании инкубации снимите покрывающую планшет пленку и добавьте по 2 капли реактивов в следующие лунки:

	ТДА-реагент	Индольный реагент
Определение 1	А1	АЗ
Определение 2	С1	СЗ
Определение 3	Е1	ЕЗ
Определение 4	G1	G3

Подождите 3—30 мин (не более!) для развития окраски, после чего тщательно протрите дно лунок планшета фильтровальной бумагой и проведите считывание на ридере. Для этого войдите в программу MCN. В колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Считывание». Нажмите «Старт» для начала считывания. Планше-

МУК 4.2.2886—11

ты должны быть считаны в тот же день, на следующий день считывание невозможно.

После считывания проведите вычисление результатов. Для этого в программе MCN в колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Вычисление». Нажмите «Старт» для начала вычисления. Система выдаст полученные в ходе исследования результаты.

7.1.3. Идентификация неферментирующих грамотрицательных оксидазоположительных бактерий

Для идентификации неферментирующих грамотрицательных оксидазоположительных бактерий за 18—24 ч применяют планшеты соответствующего назначения (3 теста/планшет; 27 биохимических реакций; 5 контролем).

Ход исследования. Войдите в программу MCN. В колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Ввод и правка образцов», в котором введите номер образца. Внизу укажите тип теста «М» и введите код таксона.

Приготовьте бактериальную суспензию из 24-часовой культуры микроорганизмов, выращенной строго на кровяном агаре (с эритроцитами барана) без добавок. Если проводить культивирование на иной среде, то это приведет к изменению биохимических характеристик исследуемых микроорганизмов и, как следствие, к ложным результатам.

Суспензию со значением мутности 0,5 по МакФарланду необходимо приготовить в 5 мл физраствора. Перенесите 1,0 мл приготовленной суспензии в 6 мл предварительно приготовленной среды NF-Susmed и перемешайте. Перенесите полученную суспензию в стерильную (стерилизация паром под давлением при 121 °С) 2-камерную кювету.

Внесите по 100 мкл бактериальной суспензии в следующие лунки планшета:

А1 : Н4 определение 1 А5 : Н8 определение 2 А9 : Н12 определение 3

Добавьте по 2 капли парафинового масла в следующие лунки: Bl-Hl; А2, В2 определение 1 В5-Н5; А6, В6 определение 2 В9-Н9; А10, В10 определение 3

Накройте планшет специальной перфорированной пленкой, которая прилагается к набору. Использование перфорированной пленки гарантирует проникновение кислорода, необходимого для реакций. В то же время газовый обмен между ячейками планшета, нарушающий протекание реакций, становится невозможным.

13

МУК 4.2.2886—11

Инкубируйте 18—24 ч строго при 28—30 ^вС. Если бактериальный рост недостаточен, то инкубируйте еще 24 ч.

По окончании инкубации снимите покрывающую планшет пленку и добавьте по 2 капли индола в следующие лунки:

Индольный реагент Определение 1 А1 Определение 2 А5 Определение 3 А9

Подождите не менее 3 мин для развития окраски (но не более 20 мин перед считыванием), после чего тщательно протрите дно лунок планшета фильтровальной бумагой и проведите считывание на ридере. Для этого войдите в программу MCN. В колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Считывание». Нажмите «Старт» для начала считывания. Планшеты должны быть считаны в тот же день, на следующий день считывание невозможно.

После считывания проведите вычисление результатов. Для этого в программе MCN в колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Вычисление». Нажмите «Старт» для начала вычисления. Система выдаст полученные в ходе исследования результаты.

7.1.4. Идентификация грамположительных кокков и палочек

Для идентификации грамположительных кокков и палочек (бактерии родов Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Coryne-bacteria, Listeria и др.) за 18—24 ч применяют планшеты соответствующего назначения (2 теста/планшет; 44 биохимических реакции; 4 контроля).

Ход исследования. Войдите в программу MCN. В колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Ввод и правка образцов», в котором введите номер образца. Внизу укажите тип теста «Р»и введите код таксона (STA, STR, COR или ВАС).

Приготовьте бактериальную суспензию из 24-часовой культуры микроорганизмов, выращенной строго на кровяном агаре (с эритроцитами барана) без добавок. Если проводить культивирование на иной среде, то это приведет к изменению биохимических характеристик исследуемых микроорганизмов и, как следствие, к ложным результатам. Медленнорастущие бактерии, такие как бактерии родов Streptococcus, Gardnerella и некоторые виды рода Corinebacteria необходимо выращивать в течение 48 ч в атмосфере 5 % СО_г

Суспензию со значением мутности 2,0 по МакФарланду необходимо приготовить в 6 мл физраствора.

14

МУК 4.2,2886—11

Внесите по 100 мкл бактериальной суспензии в следующие лунки планшета:

А1 : D12 определение 1 El: Н12 определение 2

Добавьте по 2 капли парафинового масла в следующие лунки: А12—D12 определение 1 Е12—Н12 определение 2

Накройте планшет специальной перфорированной пленкой, которая прилагается к набору. Использование перфорированной пленки гарантирует проникновение кислорода, необходимого для реакций. В то же время газовый обмен между ячейками планшета, нарушающий протекание реакций, становится невозможным.

Инкубируйте 18—24 ч при 37 °С. Если бактериааьный рост недостаточен, то инкубируйте еще 24 ч.

По окончании инкубации снимите покрывающую планшет пленку и добавьте по 2 капли пептидазного реагента в следующие лунки:

	Пептидазный реагент
Определение 1	A1-D4
Определение 2	Е1-Н4

Подождите 3—30 мин (не более!) для развития окраски, после чего тщательно протрите дно лунок планшета фильтровальной бумагой и проведите считывание на ридере. Для этого войдите в программу MCN. В колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Считывание». Нажмите «Старт» для начала считывания. Планшеты должны быть считаны в тот же день, на следующий день считывание невозможно.

После считывания проведите вычисление результатов. Для этого в программе MCN в колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Вычисление». Нажмите «Старт» для начала вычисления. Система выдаст полученные в ходе исследования результаты.

7.1.5. Идентификация грибов и дрожжей

Для идентификации клинически значимых грибов/дрожжей за 24 ч применяют планшеты соответствующего назначения (4 тес-та/планшет; 21 биохимическая реакция; 3 контроля).

Ход исследования. Войдите в программу MCN. В колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Ввод и правка образцов», в котором введите номер образца. Внизу укажите тип теста «Y» и введите код таксона.

Приготовьте суспензию из 24—48-часовой культуры микроорганизмов, выращенной строго на агаре Сабуро с 2 %-й глюкозой.

15

МУК 4.2.2886—11

Если проводить культивирование на иной среде, то это приведет к изменению биохимических характеристик исследуемых микроорганизмов и, как следствие, к ложным результатам. Суспензию со значением мутности 0,5 по МакФарланду необходимо приготовить в 6 мл реактива Candida-Susmed. Перенесите полученную суспензию в 4-камерную кювету.

Внесите по 100 мкл суспензии в следующие лунки планшета:

А1 : В12 определение 1

Cl : D12 определение 2

El : F12 определение 3

Gl: Н12 определение 4

Накройте планшет специальной перфорированной пленкой, которая прилагается к набору. Использование перфорированной пленки гарантирует проникновение кислорода, необходимого для реакций. В то же время газовый обмен между ячейками планшета, нарушающий протекание реакций, становится невозможным.

Инкубируйте 24 ч при 25—30 °С.

По окончании инкубирования снимите с планшета покровную пленку, тщательно протрите дно лунок планшета фильтровальной бумагой и проведите считывание на ридере. Для этого войдите в программу MCN. В колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Считывание». Нажмите «Старт» для начала считывания. Планшеты должны быть считаны в тот же день, на следующий день считывание невозможно.

После считывания проведите вычисление результатов. Для этого в программе MCN в колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Вычисление». Нажмите «Старт» для начала вычисления. Система выдаст полученные в ходе исследования результаты.

7 1.6. Идентификация стафилококков

Для идентификации клинически значимых стафилококков за 6 и 18—24 ч применяют планшеты соответствующего назначения (4 теста/планшет; 21 биохимическая реакция; 2 контроля).

Ход исследования. Войдите в программу MCN. В колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Ввод и правка образцов», в котором введите номер образца. Внизу укажите тип теста («СЗ» — для 6-часовой инкубации и «D1»—для 18—24-часовой инкубации). В поле «Код таксона» укажите р-гемолиз ±.

Приготовьте бактериальную суспензию из 24-часовой культуры микроорганизмов, выращенной строго на кровяном агаре (с эритроцитами барана) без добавок. Если проводить культивирование на иной среде, то это приведет к изменению биохимических ха-

МУК 4.2.2886—11

рактеристик исследуемых микроорганизмов и, как следствие, к ложным результатам.

Для 6-часовой инкубации необходимо приготовить суспензию со значением мутности 2,0 по МакФарланду в 5 мл физраствора. Для 18—24-часовой инкубации необходимо приготовить суспензию со значением мутности 0,5 по МакФарланду в 5 мл физраствора.

Полученную суспензию перенесите в 4-камерную кювету.

Внесите по 100 мкл суспензии в следующие лунки планшета:

А1: В12 определение 1

Cl : D12 определение 2

El: F12 определение 3

Gl : Н12 определение 4

Добавьте по 2 капли парафинового масла в следующие лунки:

А-Н 12.

Накройте планшет специальной перфорированной пленкой, которая прилагается к набору. Использование перфорированной пленки гарантирует проникновение кислорода, необходимого для реакций. В то же время газовый обмен между ячейками планшета, нарушающий протекание реакций, становится невозможным.

В зависимости от выбранного метода инкубируйте 6 или 18—24 ч при 37 °С.

По окончании инкубирования снимите с планшета покровную пленку, тщательно протрите дно лунок планшета фильтровальной бумагой и проведите считывание на ридере. Для этого войдите в программу MCN. В колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Считывание». Нажмите «Старт» для начала считывания. Планшеты должны быть считаны в тот же день, на следующий день считывание невозможно.

После считывания проведите вычисление результатов. Для этого в программе MCN в колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Вычисление». Нажмите «Старт» для начала вычисления. Система выдаст полученные в ходе исследования результаты.

7.1.7. Идентификация стрептококков

Для идентификации клинически значимых стрептококков и энтерококков за 20—24 ч применяют планшеты соответствующего назначения (4 теста/планшет; 24 биохимические реакции).

Ход исследования. Войдите в программу MCN. В колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Ввод и правка образцов», в котором введите номер образца. Внизу укажите тип теста «К». В поле «Код таксона» укажите Р-гемолиз ± и пигментацию ±.

Приготовьте бактериальную суспензию из 24-часовой культуры микроорганизмов, выращенной строго на кровяном агаре (с

17

МУК 4.2.2886-11

эритроцитами барана) без добавок. Если проводить культивирование на иной среде, то это приведет к изменению биохимических характеристик исследуемых микроорганизмов и, как следствие, к ложным результатам.

Бактериальную суспензию со значением мутности 1,0 по МакФарланду необходимо приготовить в 5 мл физраствора. Полученную суспензию перенесите в 4-камерную кювету.

Внесите по 100 мкл суспензии в следующие лунки планшета:

А1: В12 определение 1

Cl: D12 определение 2

El : F12 определение 3

G1 : Н12 определение 4

Добавьте по 2 капли парафинового масла в следующие лунки:

А-Н 12.

Накройте планшет специальной перфорированной пленкой, которая прилагается к набору. Использование перфорированной пленки гарантирует проникновение кислорода, необходимого для реакций. В то же время газовый обмен между ячейками планшета, нарушающий протекание реакций, становится невозможным.

Инкубируйте 20—24 ч при 37 °С.

По окончании инкубирования снимите с планшета покровную пленку, тщательно протрите дно лунок планшета фильтровальной бумагой и проведите считывание на ридере. Для этого войдите в программу MCN. В колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Считывание». Нажмите «Старт» для начала считывания. Планшеты должны быть считаны в тот же день, на следующий день считывание невозможно.

После считывания проведите вычисление результатов. Для этого в программе MCN в колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Вычисление». Нажмите «Старт» для начала вычисления. Система выдаст полученные в ходе исследования результаты.

7.2. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам на планшетах

7.2. L Определение минимальных подавляющих концентраций антимикробных препаратов (МПК) и детекция множественной устойчивости микроорганизмов к антибиотикам

Перечень антимикробных препаратов, чувствительность к которым можно определять с помощью планшетов, указан в инструкциях по применению соответствующих типов планшет и включает в себя следующие антибиотики: азитромицин, амоксициллин/кла-вулановая кислота, ампициллин, пенициллин, бацитрацин, цеф-триаксон, цефуроксим, ципрофлоксацин, кларитромицин, клин-

МУК 4.2.2886—11

дамицин, колистин, доксициклин, эритромицин, имипинем, ме-ропенем, моксифлоксацин, метронидазол, абактам, ванкомицин, пиперациллин, хлорамфеникол, гентамицин, стрептомицин, тетрациклин, триметоприм, налидиксовая кислота.

Для определения минимальных подавляющих концентраций (МПК) антимикробных препаратов и детекции множественной устойчивости микроорганизмов к антибиотикам за 18—24 ч применяют планшеты соответствующего назначения:

—    подтверждающий тест (1 тест/планшет, 2 контроля) для фенотипической детекции ESBL ф-лактамазы) у соответствующих грамотрицательных бактерий за 18—24 ч;

-для детекции множественной устойчивости (1 тест/планшет, 1 контроль) стафилококков (MRSA), энтерококков (VRE) и пневмококков за 18—24 ч;

-    для определения минимальной подавляющей концентрации (1 тест/планшет, 1 контроль) антимикробных агентов с высокой активностью в отношении анаэробов за 18—24 ч.;

—    для определения минимальной подавляющей концентрации (1 тест/планшет, 1 контроль) антимикробных агентов в отношении пневмококков и гемофильных бактерий за 18—24 ч;

-    ддя определения минимальной подавляющей концентрации (1 тест/планшет, 1 контроль) антимикробных агентов в отношении кампилобактерий за 18—24 ч;

“ для исследования множественной лекарственной устойчивости (1 тест/планшет, 1 контроль) неферментирующих бактерий, вызывающих развитие цистита за 18—24 ч.

Для всех типов указанных выше планшет применяется одна схема работы.

Ход исследования. Войдите в программу MCN. В колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Ввод и правка образцов», в котором введите номер образца. Внизу укажите тип теста «Их» («Нх»- для медленнорастущих бактерий).

Приготовьте бактериальную суспензию из 24-часовой культуры микроорганизмов, выращенной строго на кровяном агаре (с эритроцитами барана) без добавок. Если проводить культивирование на иной среде, то это приведет к изменению биохимических характеристик исследуемых микроорганизмов и, как следствие, к ложным результатам.

Необходимо приготовить суспензию со значением мутности 0,5 по МакФарланду в 5 мл физраствора.

Для определения грамотрицательных бактерий необходимо перемешать 50 мкл приготовленной суспензии в 11 мл бульона Мюллера-Хинтона II.

19

ББК 52.64 И29

И29 Идентификация микроорганизмов и определение чувствительности их к антибиотикам с применением автоматизированной системы для биохимического анализа: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011 .—39 с.

ISBN 978—5—7508—1051—2

1.    Разработаны ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (А. И. Верещагин, М. В. Зароченцев, И. В. Новокшонова, М. А. Ярославцева); ФГУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора (М. В. Храмов, В. М, Храмов); ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве» <Н. Я. Салова, Ф. М. Абасова) при участии ООО «СИ-ЛАБ», Москва {А. М. Веселовский, М. Б. Беглов).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 № 1).

3.    Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека Г. Г. Онищенко 30.06.2011.

4.    Введены впервые.

ББК 52.64

© Роспотребнадзор, 20 И © Федеральный центр гигиены

и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011

МУК 4.2.2886—11

Для определения грамположительных бактерий необходимо перемешать 100 мкл приготовленной суспензии в 11 мл бульона Мюллера-Хинтона II.

Для определения медленнорастущих бактерий (стрептококков, коринебактерий, гемофильной палочки, нейссерий) необходимо перемешать 200 мкл приготовленной суспензии в II мл Н-бульона (H-broth).

Для определения медленнорастущих неферментирующих бактерий необходимо перемешать 50 мкл приготовленной суспензии в 11 мл Н-бульона (H-broth).

Перенесите полученную суспензию в 1, 2 или 4-камерную кювету.

Внесите по 100 мкл суспензии в следующие лунки планшета:

А1 : В12 определение 1

Cl : D12 определение 2

El : F12 определение 3

Gl : Н12 определение 4

Накройте планшет неперфорированной пленкой, которая прилагается к набору.

Инкубируйте 18—24 ч при 37 °С. Медленнорастущие бактерии (при необходимости) инкубируются в обогащенной С0₂ атмосфере 22—24 ч.

По окончании инкубирования снимите с планшета покровную пленку, тщательно протрите дно лунок планшета фильтровальной бумагой и проведите считывание на ридере. Для этого войдите в программу MCN. В колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Считывание». Нажмите «Старт» для начала считывания. Планшеты должны быть считаны в тот же день, на следующий день считывание невозможно.

После считывания проведите вычисление результатов. Для этого в программе MCN в колонке «Работа с данными» перейдите в раздел «Вычисление». Нажмите «Старт» для начала вычисления. Система выдаст полученные в ходе исследования результаты в виде наименования антимикробного препарата и его концентрации в лунке планшета в мкг/мл.

Примечание: Контрольная лунка должна быть мутной (т. е. должен быть бактериальны й рост). В противном случае тест должен быть повторен.

Интерпретация полученных результатов осуществляется на основании сопоставления величины МПК антимикробного препарата с пограничными значениями этих параметров, отделяющих чувствительные штаммы от промежуточных и промежуточные от устойчивых. Оценка МПК должна осуществляться в соответствии с критериями чувствительности микроорганизмов к антимикроб-

МУК 4,2.2886—11

Содержание

1.    Область применения...................................................................... 4

2.    Нормативные ссылки.................................................................... 5

3.    Общие положения......................................................................... 5

4.    Сущность метода............................................................................ 6

5.    Отбор, подготовка проб (культур) и внесение бактериальной

суспензии....................................................................................... 7

6.    Аппаратура, материалы и реактивы.............................................. 7

7.    Проведение испытаний................................................................... 10

7.1.    Идентификация микроорганизмов с применением планшетов ....................................................................................... 10

7 Л Л. Экспресс-идентификация микроорганизмов.............. 10

7Л.2. Идентификации энтеробактерий и других грамотри-

цательных оксидазоотрицательных бактерий.............. 11

7Л.З. Идентификация неферментирующих грамотрицатель-

ных оксидазоположительных бактерий....................... 13

7Л,4. Идентификация грамположигельных кокков и палочек............................................................................... 14

7Л. 5. Идентификация грибов и дрожжей.............................. 15

7.1.6. Идентификация стафилококков................................... 16

7Л.7. Идентификация стрептококков.................................... 17

7.2.    Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам на планшетах.......................................................... 18

7.2.1.    Определение минимальных подавляющих концентраций антимикробных препаратов (МПК) и детекция множественной устойчивости микроорганизмов

к антибиотикам................... 18

7.2.2.    Определение чувствительности грибов и дрожжей к

антимикотикам.............................................................. 21

7.2.3.    Экспресс-определение чувствительности бактерий к

антибиотикам................................................................. 22

7.2.4.    Определение чувствительности бактерий к антибиотикам ........................................................................ 24

7.2.5.    Определение чувствительности аэробных бактерий к

антибиотикам................................................................. 25

7.3.    Методики исследований с применением различных типов

стрипов.................................................................................... 27

Приложение 1, Перечень микроорганизмов, идентифицируемых

на планшетах............................................. 30

Приложение 2. Типы планшет (стрипов) и их назначение..........    37

3

МУК 4.2.2886—11

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

30 июня 2011 г.

Дата введения: с момента утверждения

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Идентификация микроорганизмов и определение чувствительности их к антибиотикам с применением автоматизированной системы для биохимического анализа

Методические указания МУК 4.2,2886—11

1. Область применения

1.1.    Настоящие методические указания устанавливают методы идентификации патогенных биологических агентов, обнаруженных в продовольственном сырье и пищевых продуктах, парфюмерно-косметической и другой продукции, объектах окружающей среды, клиническом (биологическом) материале, и устанавливают методы определения чувствительности выделенных микроорганизмов к антимикробным препаратам.

1.2.    Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, парфюмерно-косметической и другой продукции, объектов окружающей среды, а также могут быть использованы для проведения производственного контроля другими испытательными лабораториями, аккредитованными в установленном порядке.

МУК 4.2.2886—11

2. Нормативные ссылки

1.    Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 30 марта 1999 г. № 52-ФЗ.

2.    Федеральный закон «О качестве и безопасности пищевых продуктов» от 02 января 2000 г. № 29-ФЗ.

3.    Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю), утверждены решением Комиссии таможенного союза от 28 мая 2010 г. № 299.

4.    СП 1.3.1285—03 «Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности (опасности)».

5.    СП 1.3,2322—08 «Безопасность работы с микроорганизмами III—IVгрупп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

6.    СанПиН 2.3.2.1078—01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» (с изменениями и дополнениями).

7.    СанПиН 1.2.681—97 «Производство и контроль парфюмерно-косметической продукции для обеспечения ее безопасности и качества».

8.    СанПиН 2.1.3.2630—10 «Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность».

9.    МУК 4.2.1890—04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».

10.    ГОСТ Р ИСО 7218-2008 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям».

11.    Инструкция по мерам профилактики распространения инфекционных заболеваний при работе в клинико-диагностических лабораториях лечебных и профилактических учреждений, М., 1991.

3. Общие положения

3.1. Автоматизированная система для биохимического анализа (далее — система) может быть использована при биохимической идентификации видовой принадлежности штаммов микроорганизмов, выделенных из различного материала в соответствии с действующими методическими документами и определении чувствительности микроорганизмов к противомикробным препаратам. Биохимическая идентификация микроорганизмов с применением

МУК 4.2.2886-11

системы может осуществляться альтернативно биохимической идентификации, проводимой общепринятыми методами in vitro.

3.2. Работы по идентификации микроорганизмов и определению чувствительности их к лротивомикробным препаратам с применением системы следует осуществлять в соответствии с требованиями действующих нормативно-методических документов, регламентирующих безопасность работы с патогенными биологическими агентами.

4. Сущность метода

4.1.    Идентификация микроорганизмов с применением системы основана на регистрации и анализе результатов изменения биохимических субстратов под действием микроорганизмов (биохимическая идентификация) в сопоставлении с базой данных, включающей информацию о биохимических профилях микроорганизмов.

4.2.    Принцип определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам с применением системы основан на определении ингибиции роста микроорганизмов антимикробными препаратами различных концентраций с установлением их минимальных ингибирующих концентраций (МИК), либо на выявлении множественной лекарственной устойчивости микроорганизмов.

4.3.    Система позволяет осуществлять идентификацию аэробных и факультативно-анаэробных бактерий различных групп и семейств, дрожжевых, дрожжеподобных и других микроскопических грибов (прилож. 1).

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и антимикотическим препаратам осуществляется с применением системы и различных типов планшет (прилож. 2).

4.4.    Система включает фотометр, который позволяет считывать результаты, полученные при проведении идентификации микроорганизмов и определении их чувствительности к антибиотикам на адаптированных к ней тест-планшетах. Результаты обрабатываются и интерпретируются автоматически. Информация о результатах идентификации микроорганизмов (с указанием рода, вида, биотипа, альтернативного близкородственного вида, статистических данных) отражается на экране компьютера в течение нескольких секунд. Возможно сохранение данных на диске и вывод их на печать.

4.5.    Наименования микроорганизмов, идентифицируемых системой, приводятся в соответствии с 9-м изданием международного «Определителя бактерий Берджи».

МУК 4.2.2886—i 1

5* Отбор, подготовка проб (культур) и внесение бактериальной суспензии

5.1.    При работе с применением системы используются суточные бактериальные культуры, выращенные на питательной среде в соответствии с инструкцией по применению тест-планшетов и стрипов. Если исследуемый материал находился в лиофилизиро-ванном состоянии в ампулах, то необходимо восстановить культуру на питательной среде, рекомендуемой в инструкциях по применению тест-планшетов или стрипов, после чего еще раз пересеять культуру на аналогичную питательную среду.

5.2.    Для внесения исследуемого материала в тест-планшеты необходимо приготовить бактериальную суспензию определенной мутности (в зависимости от типа теста) по стандартам мутности подобных Mc-Farland или ФГБУ «НЦЭСМП» или с аналогичными характеристиками.

5.3.    Внесение бактериальной суспензии в лунки планшета осуществляется 8-канальным дозатором с помощью стерильных наконечников объемом 1 200 мкл,

5.4.    Все работы, вт. ч. пересевы, приготовление бактериальной суспензии и внесение ее в лунки планшета, осуществляют асептич-но с соблюдением требований биологической безопасности и техники лабораторных работ.

6. Аппаратура, материалы и реактивы

• Система, подобная МикроТакс, SY-LAB Gerate, GmbH (или Система с аналогичными характеристиками), включюшая:

1)    ридер МТ-1 — 8-канальный фотометр для считывания планшет со встроенным шейкером и жидкокристаллическим дисплеем; спектральный диапазон: 400—750 нм, 7 фильтров - 405,414, 450, 492, 540,620 и 690 нм; способ измерения: монохроматический, бихроматический, мультихроматический, точность 2 % или 0,007 А, диапазон измерений 0—3,5 ед. оптической плотности;

2)    инкубатор МТ-5 (внутренняя камера которого выполнена из нержавеющей стали) с жидкокристаллическим дисплеем. Диапазон температур: от 20 до 70 °С Отклонение от температуры при 37 °С:±0,5 °С, время нагрева до 37 °С — 37 мин, время охлаждения с 37 до 30 °С - 79 мин;

3)    автоматическая 8-канальная электронная пипетка с зарядным устройством;

4)    управляющий блок на базе персонального компьютера с программным обеспечением и принтером.

7

МУК 4.2.2886-11

* Тест-планшеты, подобные МикроТакс или с аналогичными характеристиками — стандартные, 96-луночные, с внесенными компонентами:

-    МикроТакс-IDS (4 теста/планшет) — для быстрой (экспресс) в течение 5—6 ч идентификации 113 наиболее клинически значимых штаммов энтеробактерий, стафилококков, стрептококков, энтерококков;

-    МикроТакс-Е (4 теста/планшет) — для идентификации 79 видов энтеробактерий за 18—24 ч;

-    МикроТакс-NF (3 теста/планшет) - для идентификации 72 видов неферментирующих бактерий за 18—24 ч;

-    МикроТакс-RPO (2 теста/планшет) — для идентификации 167 видов бактерий родов: стафилококки, стрептококки, энтерококки, коринебактерии, листерии;

-    МикроТакс-Candida (4 теста/планшет) — для идентификации 32 видов клинически значимых грибов/дрожжей за 24 ч;

-    МикроТакс-STAPH (4 теста/планшет) — для идентификации клинически значимых стафилококков за 6 и 18—24 ч;

-    МикроТакс-STREP 2 (4 теста/планшет) — для идентификации клинически значимых стрептококков и энтерококков за 20—24 ч;

-    МикроТакс-S Lactamase detection (1 тест/планшет) — подтверждающий тест для фенотипической детекции ESBL (расширенного спектра Р-лактамазы) у грамотрицательных бактерий за 18—24 ч;

-    МикроТакс-S MRSA & VRE (1 тест/планшет) — для детекции множественной устойчивости стафилококков (MRSA), энтерококков (VRE) и пневмококков за 18—24 ч;

-    МикроТакс-S Anaerobs MIC (1 тест/планшет) — для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) антимикробных агентов с высокой активностью в отношении анаэробов за 18—24 ч;

-    МикроТакс-S Pneumococcus & Haemophilus (1 тест/планшет) — для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) антимикробных агентов в отношении пневмококков и гемофильных бактерий за 18—24 ч;

-    МикроТакс-S Campylobacter (1 тест/планшет) — для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) антимикробных агентов в отношении кампилобактерий за 18—24 ч;

-    МикроТакс-S Cystic Fibrosis (1 тест/планшет)—для исследования множественной лекарственной устойчивости неферментирующих бактерий, вызывающих развитие цистита за 18—24 ч;

-    МикроТакс-AM КН2 (1,2 или 4 теста/планшет) — для определения чувствительности дрожжей и криптококков к антимико-

8

МУК 4.2.2886—1 J

тическим агентам (6 антимикотических агентов в различных концентрациях) за 22—24 ч;

-    МикроТакс-AM MIC (1,2 или 4 теста/планшет) — для определения чувствительности дрожжей и криптококков к антимикотическим агентам (9 антимикотических агентов в различных концентрациях) за 22—24 ч;

-    МикроТакс-БВ/быстрый тест (1,2 или 4 теста/планшет) — для определения бактериальной чувствительности к антибиотикам за 6 ч;

-    МикроТакс-БВ/ночная инкубация (1,2 или 4 теста/планшет) — для определения бактериальной чувствительности к антибиотикам за 18—24 ч;

-    МикроТакс-UR (2 теста/планшет) — для идентификации и определения чувствительности быстрорастущих аэробных бактерий к антибиотикам за 18—24 ч.

•    Стрипы, подобные перечисленным, или с аналогичными характеристиками:

-    MIC-стрип ESBL II (1 контроль) — фенотипический подтверждающий тест для детекции ESBL ((3-лактамазы), которая продуцируется энтеробактериями;

-    MIC-стрип MRSA (1 контроль) — фенотипический подтверждающий тест для детекции метициллин-резистентных стафилококков;

-    MIC-стрип PEN (1 контроль) — фенотипический подтверждающий тест для детекции резистентности к пенициллину у пенициллиноустойчивых изолятов стрептококков и пневмококков;

-    MIC-стрип VAN (1 контроль) — фенотипический подтверждающий тест для детекции ванкомицин-резистентных грамполо-жительных бактерий.

•    Реактивы и питательные среды:

-    типа NF-Susmed, реактив для МикроТакс-NF или с аналогичными характеристиками;

-    типа Candida-Susmed, реактив для МикроТакс-RC или с аналогичными характеристиками;

-    изосенситест, реактив для МикроТакс-Б;

-    Н-бульон, реактив для МикроТакс-Б;

-    среда МикроТакс-БВ;

-    индольный реагент;

-    TDA реагент;

-    нитрат реагент А;

-    нитрат реагент В;

-    парафиновое масло;

-    пептидазный реагент.

9