Государственное
санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации
4.2.
МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения
концентрации клеток дрожжевого гриба
Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 -
продуцента липазы в атмосферном
воздухе населенных мест и
воздухе рабочей зоны
Методические
указания
МУК 4.2.2715-10
МУК 4.2.2725-10
Москва • 2011
1. Разработаны ГОУ ВПО Российский государственный
медицинский университет (д.б.н. Н.И. Шеина).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по
государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной
службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
(протокол от 10.06.2010 № 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по
надзору в сфере защиты потребителей и благополучия человека, Главным
государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 4 августа
2010 г.
4. Введены в действие с 4 октября 2010 г.
5. Введены впервые.
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации
Г.Г. Онищенко
4 августа 2010 г.
Дата введения: 4 октября 2010 г.
|
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения
концентрации клеток В. amyloliquefaciens
ВКПМ В-10291 - продуцента a-амилазы
в атмосферном воздухе населенных мест
Методические
указания
1.
Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику
проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток
штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 - продуцента липазы в воздухе рабочей зоны в
диапазоне концентраций от 5 до 50 000 клеток в 1 м3 воздуха.
Методические указания разработаны в
соответствии с требованиями ГОСТ
12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические
требования» и ГОСТ
Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».
Методические указания предназначены для
применения учреждениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека, а также лабораториями организаций,
аккредитованными в установленном порядке на право проведения микробиологических
исследований.
Методические указания одобрены и
рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного
загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены
окружающей среды».
2.
Биологическая характеристика дрожжевого гриба Yarrowia
lipolytica ВКПМ Y-3323 и его гигиенический
норматив
Штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323
является продуцентом липазы. Штамм создан с помощью генетических методов в
ГосНИИ генетика и депонирован в ВКПМ.
Для дрожжей данного вида липолитическая
активность является таксономическим признаком. Оптимум температуры для
продукции липазы дрожжами составляет 29 °C, pH среды 5,5.
При температуре 42 °C не растет.
Способен расти в присутствии
циклогексимида, обладает уреазной активностью, нитрат не использует, сахара не
сбраживает. В роде один вид, известный своей способностью к интенсивному
образованию липолитических и протеолитических ферментов. Телеоморфа - Candida paralipolytica. Встречается
у человека и других млекопитающих, в зерне, маслинах и нефтепродуктах.
Систематическое положение микроорганизма
Класс
|
Fungi imperfecti
|
Порядок
|
Blastomycetales
|
Род
|
Yarrowia
|
Вид
|
lipolytica
|
Штамм
|
ВКПМ Y-3323
|
На LB-агаре на 2-е и 3-и сутки вырастают колонии белого
цвета, сухие, круглые, поднимающиеся над агаром. Края колонии ровные, у старой
культуры возможно образование складок и концентрических кругов различной
плотности. Максимальный диаметр - 10 - 12 мм.
Клетки круглые, эллипсоидные или удлиненные. Бесполое
размножение - многосторонним почкованием на узком основании. Образуется
псевдомицелий или истинный мицелий, который
может иногда распадаться на артроспоры. Аски не конъюгативные, образуются из
диплоидных клеток гиф. Оболочка аска быстро растворяется. В аске 1 - 4
аскоспоры, шаровидные, полусферические или шляповидные.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе
рабочей зоны - 500 кл./м3, пометка А.
3.
Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнения измерений количества
клеток плесневого гриба в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 5 до
50000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4.
Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток
дрожжевого гриба на поверхность агаризованной среды и подсчете выросших колоний
по типичным культурально-морфологическим
и физиолого-биохимическим признакам на 3-и сутки.
5.
Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства
измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1.
Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
Импактор микробиологический
«Флора-100»
|
ТУ
9443-001-05031637-2002
|
Прибор для бактериологического анализа воздуха,
модель 818 (щелевой прибор Кротова)
|
ТУ
64-12791-77
|
Прибор MAS-100 ECO
фирмы «Merk» (Германия) для отбора проб воздуха
|
|
Термостаты электрические суховоздушные или водяные
|
|
Автоклав электрический
|
ГОСТ 9586-75
|
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
|
|
Холодильник бытовой
|
|
Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200
|
|
Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа
«Биолам» Л-211
|
|
Лупа с увеличением ´ 10
|
ГОСТ 25706-83
|
Чашки Петри бактериологические плоскодонные,
стеклянные, диаметром 90 мм
|
ГОСТ 23932-90
|
Пробирки бактериологические П1 и П2 вместимостью 15
и 20 мл
|
ГОСТ 25336-82
|
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл
|
ГОСТ 10515-75
|
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл
|
ГОСТ 1770-74
|
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл
|
ГОСТ 1770-74
|
Секундомер
|
ГОСТ 9586-75
|
Барометр
|
ГОСТ 24696-79
|
Марля медицинская
|
ГОСТ 9412-77
|
Вата медицинская гигроскопическая
|
ГОСТ 25556-81
|
5.2.
Реактивы, растворы
LB-агар (дрожжевой экстракт 5 г/л, триптон 10 г/л, NaCl
5 г/л, агар 15 г/л, режим стерилизации 1,1 - 1,2 ати в течение 30 мин)
|
|
Желточный агар (пептон - 20 г, Na2HPO4 - 2,5
г, NaCl - 1 г, MgSO4 0,5 % раствор - 1 мл, глюкоза - 1 г, агар - 12,5 г,
дистиллированная вода - 500 мл, 1 куриный желток)
|
|
Вода дистиллированная
|
ГОСТ 6709-72
|
Спирт этиловый ректификат
|
ГОСТ 5962-67
|
Циклогексемид син. актидион
|
|
6.
Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток
штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.
6.1. Санитарные правила СП 1.2.731-99
«Безопасность работы с микроорганизмами III - IV
групп патогенности и гельминтами».
6.2. Правила техники безопасности при работе с
химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
6.3. Электробезопасность при работе с электроустановками
по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.4. Руководство «Положение об организации работы по
технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980), «Инструкции
по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в
микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности»
(1977).
6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в
вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом
осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7.
Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их
результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием,
прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области
микробиологических исследований.
8.
Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к
анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5) °C,
атмосферном давлении 740 - 760 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 70 %.
9.
Проведение измерения
9.1. Условия отбора
проб воздуха
Для определения концентрации клеток микроорганизма
воздух аспирируют при помощи пробоотборника со скоростью 100 л/мин на
поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 - 5 мин)
зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма.
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно
протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска
и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной
диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее
крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо.
После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают
чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри
стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2.
Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества типичных колоний,
выросших на 2 - 3-и сутки после посева проб воздуха по
культурально-морфологическим признакам. Прямой метод позволяет учитывать на
чашке до 200 колоний продуцента.
LD-агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °C, добавляют
циклогекксемид, из расчета 0,5 г на 1 л среды (для подавления посторонней
бактериальной микрофлоры и микромицетов), тщательно перемешивают и разливают по
10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.
Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки
при температуре 37 °C, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки
используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в
термостат при температуре 29 - 30 °C. Через 2 - 3 суток производят подсчет
выросших типичных по морфологическим признакам колоний продуцента. При
необходимости культуру подвергают микроскопированию.
Дополнительным функциональным методом является отбор
пробы воздуха на чашки Петри с желточным агаром.
Для приготовления желточного агара смешивают указанные
выше компоненты, смесь кипятят до растворения агара, стерилизуют
автоклавированием при 0,5 атм. и охлаждают до 60 °C. Скорлупу яйца
дезинфицируют спиртом. Яйцо разбивают, отделяют желток от белка и переносят с
соблюдением правил асептики в расплавленный агар. Агар перемешивают до
получения однородной суспензии, разливают по чашкам и
оставляют по полного затвердевания.
После отбора проб воздуха чашки инкубируют в
термостате при 29 °C в течение 48 - 72 ч и внимательно просматривают в косом
освещении. Вокруг колоний штамма, продуцирующего липазу, образуются
маслянистые, блестящие с переливами или перламутровые зоны.
Ростовые свойства всех используемых питательных сред
должны быть проверены в соответствии с «Требованиями к ростовым свойствам
питательных сред» (Государственная Фармакопея СССР, изд. XI,
вып. 2, с. 208), что позволит более полно оценить
пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается
на 2 - 3 чашки каждой используемой среды.
10.
Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1
м3 воздуха производят по формуле:
где
X -
концентрация клеток продуцента в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение
скорости на время аспирации).
11.
Оформление результатов измерений
Результаты измерений
оформляют протоколом по форме:
Протокол №
количественного
микробиологического анализа штамма-продуцента
Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 в воздухе рабочей
зоны
1. Наименование и адрес испытательной лаборатории
(центра), проводящей измерения, аттестат аккредитации лаборатории.
2. Юридический и фактический адрес
организации-заказчика.
3. Идентификация используемого метода, методики, ссылки
на методы, используемые испытательной лабораторией.
4. Описание состояния объекта исследования.
5. Дата получения объекта измерений и дата проведения
анализа.
6. Место
отбора пробы.
Результаты микробиологического анализа
Шифр или № пробы
|
Определяемый микроорганизм
|
Концентрация, кл./м3
|
|
|
|
Ответственный исполнитель:
Руководитель:
Список литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».
2. ГОСТ Р 8.563-96
ГСИ «Методики выполнения измерений».
3. Положение об организации работы по технике
безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.
4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и
личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий
микробиологической промышленности. М., 1977. 7
с.
СОДЕРЖАНИЕ
1. Общие положения и область
применения. 2
2. Биологическая характеристика
дрожжевого гриба Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 и его гигиенический норматив. 2
3. Пределы измерений. 2
4. Метод измерений. 3
5. Средства измерений,
вспомогательные устройства, реактивы и материалы.. 3
5.1.
Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы.. 3
5.2.
Реактивы, растворы.. 3
6. Требования безопасности. 3
7. Требования к квалификации
операторов. 4
8. Условия измерений. 4
9. Проведение измерения. 4
9.1.
Условия отбора проб воздуха. 4
9.2.
Выполнение анализа. 4
10. Вычисление результатов
измерения. 5
11. Оформление результатов
измерений. 5
Список литературы.. 5
|