Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации клеток дрожжевого гриба Yarroma lipolytica ВКПМ Y-3323 — продуцента липазы в атмосферном воздухе населенных мест и воздухе рабочей зоны

Методические указания МУК 4.2.2715—10 МУК 4.2.2725—10

Издание официальное

Москва • 2011

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации клеток дрожжевого гриба Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 - продуцента липазы в атмосферном воздухе населенных мест и воздухе рабочей зоны

Методические указания МУК 4.2.2715—10 МУК 4.2.2725—10

Результаты микробиологического анализа

Шифр или № пробы Определяемый микроорганизм Концентрация, кл./м3

Ответственный исполнитель:

Руководитель:

Список литературы

1.    Руководство по контролю загрязнения атмосферы РД 52.04.186 —96. М., 1991.693 с.

2.    ГОСТ 8.563-96 ГСИ «Методики выполнения измерений».

3.    Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

4.    Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.

5.    ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ».

10

ББК 51.21 М54

М54 Метод микробиологического измерения концентрации клеток дрожжевого гриба Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 -продуцента липазы в атмосферном воздухе населенных мест и воздухе рабочей зоны: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011.—16 с.

ISBN 978—5—7508—0955—4

1.    Разработаны ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет (д.б.н. Н. И. Шеина).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 № 1).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 4 августа 2010 г.

4.    Введены в действие с 4 октября 2010 г.

5.    Введены впервые.

ББК 51.21

Редактор Е. В. Николаева Технический редактор Е. В. Ломанова

Подписано в печать 21.01.11 Формат 60x88/16    Печ.    л. 1,0

Тираж 200 экз.    Заказ    13

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., д. 18, стр. 5, 7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделом издательского обеспечения

Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Отделение реализации, тел./факс 952-50-89

© Роспотребнадзор, 2011 © Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011

Содержание

Метод микробиологического измерения концентрации клеток

дрожжевого гриба Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 - продуцента

липазы в атмосферном воздухе населенных мест: МУК 4.2.2715—10..................4

Метод микробиологического измерения концентрации клеток

дрожжевого гриба Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 - продуцента

липазы в воздухе рабочей зоны: МУК 4.2.2725—10.............................................11

3

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

4 августа 2010 г.

Дата введения: 4 октября 2010 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации клеток дрожжевого гриба Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 - продуцента липазы в атмосферном воздухе населенных мест

Методические указания МУК 4.2.2715—10

МУК 4.2.2715—10

2. Биологическая характеристика Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 и его гигиенический норматив

Штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 является продуцентом липазы.

Штамм создан с помощью генетических методов в ГосНИИ генетика и депонирован в ВКПМ.

Для дрожжей данного вида липолитическая активность является таксономическим признаком. Оптимум температуры для продукции липазы дрожжами составляет 29 °С, pH среды 5,5. При температуре 42 °С не растет.

Способен расти в присутствии циклогексимида, обладает уреазной активностью, нитрат не использует, сахара не сбраживает. В роде один вид, известный своей способностью к интенсивному образованию липолитических и протеолитических ферментов. Телеоморфа - Candida paralipolytica. Встречается у человека и других млекопитающих, в зерне, маслинах и нефтепродуктах.

Систематическое положение микроорганизма

Класс    Fungi imperfecti

Порядок    Blastomycetales

Род    Yarrowia

Вид    lipolytica

Штамм    ВКПМ Y-3323

На LB-arape на 2-е и 3-и сутки вырастают колонии белого цвета, сухие, круглые, поднимающиеся над агаром. Края колонии ровные, у старой культуры возможно образование складок и концентрических кругов различной плотности. Максимальный диаметр - 10—12 мм.

Клетки круглые, эллипсоидные или удлиненные. Бесполое размножение - многосторонним почкованием на узком основании. Образуется псевдомицелий или истинный мицелий, который может иногда распадаться на артроспоры. Аски не конъюгативные, образуются из диплоидных клеток гиф. Оболочка аска быстро растворяется. В аске 1—4 аско-споры, шаровидные, полусферические или шляповидные.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 50 кл./м³, пометка А.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток дрожжевого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 5 до 50 ООО клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток дрожжевого гриба на поверхность агаризованной среды и подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам на 3-и сутки.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.7. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы Импактор микробиологический «Флора-100» ТУ 9443-001-05031637—2002 Прибор MAS-100 ECO фирмы «Мегк»

(Германия) для отбора проб воздуха

Прибор для бактериологического анализа

воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791—77

Термостаты электрические суховоздушные

или водяные

Автоклав электрический    ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные, аналитические типа

ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211

Лупа с увеличением х 10    ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 90 мм    ГОСТ 23932-90

Пробирки бактериологические П1 и П2

вместимостью 15 и 20 мл    ГОСТ 25336-82

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл    ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1,5, и 10 мл    ГОСТ 1770-74

Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74 Секундомер    ГОСТ 9586-75

Барометр    ГОСТ 246 96—79

Марля медицинская    ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая    ГОСТ 25556-81

МУК 4.2.2715—10

5.2. Реактивы, растворы LB-arap (дрожжевой экстракт 5 г/л, триптон 10 г/л, NaCl 5 г/л, агар 15 г/л, режим стерилизации 1,1—1,2 ати в течение 30 мин)

Желточный агар (пептон - 20 г, Na₂HP0₄ - 2.5 г,

NaCl - 1 г, MgS0₄ 0,5 % раствор -1 мл, глюкоза - 1 г, агар - 12,5 г, дистиллированная вода -500 мл, 1 куриный желток)

Вода дистиллированная    ГОСТ 6709-72

Спирт этиловый ректификат    ГОСТ 5962-67

Циклогексемид сын. актидион

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-проду-цента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1.    Санитарные правила СП 1.2.731—99 «Безопасность работы с микроорганизмами Ш—IV групп патогенности и гельминтами».

6.2.    Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.3.    Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.4.    «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.5.    Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5) °С, атмосферном давлении 740—760 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 70 %. ¹

9. Проведение измерения Я L Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток микроорганизма воздух ас-пирируют при помощи пробоотборника со скоростью 100 л/мин на поверхность плотной питательной картофельно-глюкозной среды. Время аспирации воздуха (5—15 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных колоний, выросших на 2—3-и сутки после посева проб воздуха по культурально-морфологическим признакам. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

LD-arap расплавляют, остужают до 50—60 °С, добавляют цикло-гекксемид, из расчета 0,5 г на 1 л среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры и микромицетов), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при температуре 29—30 °С. Через 2—3 суток производят подсчет выросших типичных по морфологическим признакам колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

Дополнительным функциональным методом является отбор пробы воздуха на чашки Петри с желточным агаром.

Для приготовления желточного агара смешивают указанные выше компоненты, смесь кипятят до растворения агара, стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм. и охлаждают до 60 °С. Скорлупу яйца дезин-

МУК 4.2.2715—10

фицируют спиртом. Яйцо разбивают, отделяют желток от белка и переносят с соблюдением правил асептики в расплавленный агар. Агар перемешивают до получения однородной суспензии, разливают по чашкам и оставляют по полного затвердевания.

После отбора проб воздуха чашки инкубируют в термостате при 29 °С в течение 48—72 ч и внимательно просматривают в косом освещении. Вокруг колоний штамма, продуцирующего липазу, образуются маслянистые, блестящие с переливами или перламутровые зоны.

Ростовые свойства всех используемых питательных сред должны быть проверены в соответствии с «Требованиями к ростовым свойствам питательных сред» (Государственная Фармакопея СССР, изд. XI, вып. 2, с. 208), что позволит более полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается на 2—3 чашки каждой используемой среды.

10.    Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м³ воздуха производят по формуле:

_v N1000    ,    з

X =- ,    КЛ./М    ,    где

X- концентрация клеток продуцента в воздухе;

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1 ООО - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

V- объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

11.    Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме:

Протокол №

количественного микробиологического анализа штамма-продуцента липазы Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 в атмосферном воздухе населенных мест

1.    Наименование и адрес испытательной лаборатории (центра), проводящей измерения, аттестат аккредитации лаборатории.

2.    Юридический и фактический адрес организации-заказчика.

3.    Идентификация используемого метода, методики, ссылки на методы, используемые испытательной лабораторией.

4.    Описание состояния объекта исследования.

5.    Дата получения объекта измерений и дата проведения анализа.

6.    Место отбора пробы. ²

1

2