Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

45 страниц

319.00 ₽

Купить МУК 4.2.2317-08 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Методические указания устанавливают требования к штаммам коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий, используемым в производстве корпускулярного или бесклеточного коклюшного компонента комплексных вакцин, а также диагностическим коклюшным и паракоклюшным препаратам и методам их контроля, условиям приготовления лиофилизированных культур, их хранению.

Методические указания предназначены для организаций, осуществляющих производственный выпуск препаратов для профилактики и диагностики коклюша и паракоклюша; органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор; учреждений, осуществляющих свою деятельность в целях обеспечения государственного санитарно-эпидемиологического надзора; других органов и организаций, осуществляющих контроль за качеством и безопасностью препаратов для профилактики и диагностики коклюша и паракоклюша.

 Скачать PDF

Оглавление

1. Область применения

2. Требования к производственным штаммам коклюшных бактерий Bordetella pertussis

     2.1. Морфология

     2.2. Культуральные свойства

     2.3. Ферментативные свойства

     2.4. Серологические свойства

     2.5. Антигенная структура (серотипы)

     2.6. Гемагглютинирующая и гемолитическая активность

     2.7. Дермонекротические свойства

     2.8. Вирулентность

     2.9. Токсичность

     2.10. Защитные свойства

3. Требования к производственным штаммам паракоклюшных бактерий Bordetella pertussis

     3.1. Морфология

     3.2. Культуральные свойства

     3.3 .Ферментативные свойства

     3.4. Серологические свойства

     3.5. Антигенная структура (серотипы)

     3.6. Гемагглютинирующая и гемолитическая активность

     3.7. Дермонекротические свойства

     3.8. Вирулентность

4. Требования к производственным штаммам бронхисептикозных бактерий Bordetella pertussis

     4.1. Морфология

     4.2. Культуральные свойства

     4.3. Ферментативные свойства

     4.4. Серологические свойства

     4.5. Антигенная структура (серотипы)

     4.6. Гемолизирующая активность

     4.7. Дермонекротические свойства

     4.8. Вирулентность

5. Хранение штаммов

6. Методы контроля производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий

     6.1 Морфологические и культуральные свойства

     6.2. Серологические свойства

     6.2.1. Развёрнутая реакция агглютинации

     6.2.2. Реакция агглютинации на стекле

     6.2.3. Развёрнутая реакция агглютинации с сыворотками к агглютиногенам 1, 2, 3 коклюшного микроба и 14 паракоклюшного микроба в пробирках

     6.2.4. Развёрнутая реакция агглютинации с сыворотками к агглютиногенам 1, 2, 3 коклюшного микроба и 14 паракоклюшного микроба (макро- или микрометодом) в планшетах

     6.3. Определение гемагглютинирующей и гемолизирующей активности

     6.3.1. Агглютинация эритроцитов

     6.3.2. Определение гемолизирующей активности

     6.4. Определение дермонекротических свойств

     6.5. Методика определения вирулентности при интраназальном заражении

     6.6. Оценка остаточной токсичности коклюшной вакцины

     6.6.1. Оценка токсичности коклюшной вакцины в тесте изменения массы тела мышей

     6.6.2. Оценка остаточного содержания термолабильного (дермонекротического) токсина

     6.6.3. Оценка лейкоцитозстимулирующей активности

     6.6.4. Оценка гистаминсенсибилизирующей активности

     6.7. Методика определения защитных свойств штаммов коклюшных бактерий

     6.7.1. Определение защитных свойств по выживаемости

     6.7.2. Определение количества международных защитных единиц (МЗЕ)

7. Возможность обновления производственных штаммов

Приложение 1. Среда Борде-Жангу

Приложение 2. Подсчет ЛД50 по методу Кербера

Приложение 3. Паспорт на производственный штамм

Приложение 4. Таблица, используемая для подсчета ЕД50 при оценке активности коклюшной вакцины

Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18
Стр. 19
стр. 19
Стр. 20
стр. 20
Стр. 21
стр. 21
Стр. 22
стр. 22
Стр. 23
стр. 23
Стр. 24
стр. 24
Стр. 25
стр. 25
Стр. 26
стр. 26
Стр. 27
стр. 27
Стр. 28
стр. 28
Стр. 29
стр. 29
Стр. 30
стр. 30

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федераннн_

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисентикозных бактерий

Методические указании МУК 4.2.2317—08

Издание официальное

Москва • 2009

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептпкозных бактерий

Методические указании МУК 4.2.2317—08

окруженные зоной гемолиза. На среде КУА колонии выпуклые с ровными краями серовато-кремового цвета, диаметром до 1,5 мм.

Паракоклюшные бактерии менее прихотливы к питательным средам: могут расти на пептонном агаре. Оптимальная температура для роста- (35,5 ± 1)°С.

3.3. Ферментативные свойства

Паракоклюшные бактерии продуцируют тирозиназу, вызывая побурение питательной среды, содержащей кровь, уреазу, вызывая расщепление мочевины; утилизируют цитраты; каталазоположительны; подщелачивают лакмусовое молоко за 1—4 дня. Паракоклюшные бактерии не разлагают углеводы, не разжижают желатин (табл. 1).

3.4. Серологические свойства

Сывороткой диагностической паракоклюшной поливалентной (титр нс ниже 1:16 ООО) культуры должны а1тлютинироваться нс ниже 3/4 титра, сывороткой диагностической коклюшной поливалентной (титр нс ниже 1:16 ООО) - нс выше 1/10 титра.

3.5. Антигенная структура (серотипы)

Агглютиноген 7 является родовым признаком. Видовой признак В. parapertussis характеризуется присутствием агглютиногена 14. Разные штаммы паракоклюшных бактерий могут отличаться между собой по содержанию типовых агглютиногенов 8, 9, 10 (табл. 2).

3.6. Гемагглютинирующая и гемолитическая активность

Паракоклюшные бактерии при росте на среде Борде-Жангу вызывают гемолиз эригроцитов. При равных условиях культивирования па-ракоклюшная палочка, в сравнении с коклюшной, вызывает более сильный гемолиз.

Паракоклюшная суспензия мутностью 10 ME должна агглютинировать эритроциты человека 0 группы крови, куриные или гусиные эритроциты на 2 креста.

3.7. Дермонекротические свойства

При внутрикожном введении кроликам 0,2 мл взвеси, содержащей живую культуру мутностью 1 ME, должен выявляться геморрагический некроз размером от 0,5 до 1,5 см.

МУК 4.2.2317—08

3.8. Вирулентность Проверяют в случае разработки паракоклюшной вакцины. При ин-траназальном заражении мышей, массой тела 12—14 г, LD50 должна быть не выше 200 млн микробных клеток.

4. Требования к производственным штаммам бронхисептикозных бактерий Bordeteila bronchiseptica

Штаммы бронхисептикозных бактерий используют при производстве сывороток диагностических коклюшных к агглютиногенам 1, 2, 3 и паракоклюшных к агглютиногену 14, адсорбированных, для реакции агглютинации (РА), сухих.

4.1. Морфология Строгие аэробы, требующие, как и коклюшные бактерии, для роста аминокислоты. Бронхиссптикозные бактерии - подвижные (обладают жгутиками), грамотрицатсльныс, мелкие палочки, по размерам неотличимы от коклюшного микроба, располагающиеся в мазках отдельно или в виде короткой цепочки. Спор не образуют.

4.2. Культуральные свойства На среде Борде-Жангу через 24—48 ч образуют колонии мелкие, диаметром до 1 мм, круглые, с ровными краями, при первичном посеве не отличимы от колоний коклюшного микроба окружены зоной гемолиза. На среде КУА через 24 ч образуют колонии до 1,2 мм, серые, круглые, с ровными краями, микроб растет в виде очень мелких выпуклых колоний серого цвета. Культура может расти на пептонном агаре, на 5 % желчи. Оптимальная температура для роста - (35,5 ± 1) °С.

4.3. Ферментативные свойства Бронхисептикозные бактерии не разлагают углеводы, не разжижают желатин, подщелачивают лакмусовое молоко за 1—4 дня; продуцируют каталазу, уреазу, оксидазу; восстанавливают нитраты в нитриты, утилизируют цитраты.

4.4. Серологические свойства Бронхисептикозной сывороткой (титр нс ниже 1 : 16 000) должны агглютинироваться не ниже 3/4 титра, коклюшной или паракоклюшной сыворогокой (титр не ниже 1:16 000) - не выше */ю гитра.

11

4.5. Антигенная структура (серотипы)

Родовой признак - наличие агглютиногена 7, видовой признак -агглютиногена 12. Разные штаммы бронхисептикозных бактерий могут отличаться между собой по содержанию типовых агглютиногенов 8, 9, 10,11,13 (табл. 2).

4.6. Г'емолтирующая активность

Единичные колонии культур 2—3 пассажа на 1—2 сутки роста в тонком слое (1,5—2,0 мм) среды Борде-Жангу должны быть окружены зоной гемолиза.

4.7. Дермонекротические свойства При внутрикожном введении кроликам 0,2 мл взвеси, содержащей живую культуру мутностью 1 ME, должен образоваться геморрагический некроз размером от 0,5 до 2,0 см в диаметре, у морских свинок - от 0,3 до 1,0 см.

4.8. Вирулентность Для изготовления диагностических препаратов нс определяют. Характеристика штаммов Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchisepiica приведена в табу/. 1 и 21.

Таблица 1

Дифференциальные признаки различных видов бордетелл

Свойства

В. pertussis

В. parapertussis

В. bronchisepiica

Подвижность

-

-

+

Рост на среде Борде-Жангу:

1—2 дня

4-

+

3—6 дней

+

4-

4*

Рост на пептоном агаре:

Фаза 1

4-

4-

фаза IV

4-

4-

4-

Побурение

-

4-

-

Рост на агаре Mac-Conkey

-

4-

4-

Утилизация цитратов

-

4-

4-

Восстановление ни гратов

-

-

4-в

Уреаза

-

4-

+6

Оксидаза

+

-

4-

Символы: + - свойственно виду; — не свойственно виду.

МУК 4.2.23 J 7—08

а - положительно в нитратной среде с добавлением никотинамид аденин динуклеотида (NAD).

б - положительна в течение 4 ч.

Таблица 2

Антигенная структура бактерий рода Bordetella фазы 1

Антигены

В. pertussis

В. parapertussis

В. bronchiseptica

К-антигены Общий для рода: агглютиноген 7

+

+

+

Специфичные для видов: агглютиноген 1

+

агглютиноген 14

+

агглютиноген 12

-

-

+

Другие факторы, встречающиеся в одном или более штаммах: агглютиногены 2, 3,4, 5,6, 13

+

агглютиногены 8, 9, 10

-

+

-

агглютиногены 8, 9, 10, 11, 13

-

-

+

О-антиген, общий

+

+

+

Филаментозный гемагглютинин

+

+

+

Токсины:

ТЛТ

+

+

+

Коклюшный токсин

+

-

ЛПС

+

+

+

5. Хранение штаммов

Производственные штаммы, аттестованные во ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича, хранят в лиофилизированном состоянии при температуре (5 ± 3) °С. На этикетке каждой ампулы должно быть указано: наименование (род, вид), номер штамма или особое название штамма, дата и порядковый номер лиофилизации (высушивания). Продолжительность хранения высушенных штаммов не должна превышать 10 лет. Ежегодно, перед использованием в производстве, штаммы должны быть проверены по всем требуемым показателям. Протоколы их контроля должны быть представлены в ГИСК им. Л. А. Тарасевича в установленный срок и храниться в специализированной лаборатории.

Свежевыделенные и производственные штаммы рекомендуется высушивать на стерильном обезжиренном молоке или растворе, содержащем 10 % сахарозы и 1 % желатина в воде (сахарозо-желатиновая среда - СЖ). Свежевыделенные штаммы должны быть высушены в пределах

13

3-х месяцев от момента выделения (5—6 пересевов) после проверки всех

основных свойств, указанных в разделе 1.

Производственные штаммы рекомендуется высушивать из 3—4 пересева после восстановления их из лиофильно высушенного состояния. В асептических условиях ампулу с сухой культурой обрабатывают 96 %-м спиртом этиловым, протирают сухой стерильной безворсовой тканью, вскрывают под защитой пламени спиртовки и стерильной пипеткой вносят в нее 0,2—0,3 мл 0,9 %-го стерильного раствора натрия хлорида pH 7,1 ± 0,2. Полученную взвесь в объеме по 0,1 мл переносят в чашки Пег-ри со средой Борде-Жангу с 30 % крови. Пастеровской пипеткой с запаянным концом культуру в чашках Петри штрихом рассевают по поверхности среды для получения отдельных колоний. Для синхронизации роста культуры, засеянные чашки Петри выдерживают от 18 до 20 ч при температуре (5 ± 3) °С. Затем чашки помещают в термостат при (35,5 ± 0,5) °С. Для создания влажной атмосферы в термостат помещают открытую емкость со стерильной дистиллированной водой. Через 48— 72 ч под микроскопом-лупой (окуляр 8) проверяют морфологию выросшей культуры. Если более 80 % выросших колоний соответствуют требованиям типичных колоний (мелкие, круглые, гладкие, выпуклые, почти прозрачные, дающие под микроскопом при боковом освещении острый лучик), то отбирают 10—15 таких колоний. Отобранные колонии засевают на пробирки со средой Борде-Жангу с 30 % крови. Пробирки с культурой помещают в термостат при температуре (35,5 ± 0,5) °С. Через 40—48 ч из выросшей культуры готовят мазки, которые окрашивают по Граму. Отконтролированную по морфологии и бактсриоскопичсской чистоте коклюшную культуру пересевают на 15—20 пробирок со средой Борде-Жангу с 30 % крови и инкубируют 24—36 ч при температуре (35,5 ± 0,5) °С и повышенном содержании влаги. После очередной проверки культуры на чистоту и морфологическую однородность чистую типичную культуру с поверхности питательной среды снимают запаянной пастеровской пипеткой и переносят на стенку пробирки со средой СЖ. Культуру, при помощи той же запаянной пастеровской пипетки, растирают на стенке пробирки, постепенно смывая средой СЖ, суспендируют пастеровской пипеткой. Пробирку со смытой культурой помещают в емкость с водой, в которой находятся куски льда. Полученную микробную взвесь из пробирок объединяют в стерильную колбу, вместимостью 0,1 л, перемешивают пастеровской пипеткой, и колбу помещают в емкость с водой и льдом. Определяют мутность приготовленной суспензии и не позднее, чем через 1 ч после начала смыва, суспензию (не менее 30 МЕ/мл) из колбы стерильной пастеровской пипеткой раз-

МУК 4.2.2317—08

ливают по 0,2—0,25 мл в подготовленные стерильные вакуумные ампулы. Стерильность микробной суспензии проверяют до и после розлива путём высева 0,5—1,0 мл на тиогликолевую среду.

Если требованиям типичных колоний соответствуют менее 80 % выросших колоний, то необходимо дополнительно провести селекцию штамма. С этой целью необходимо под микроскопом-лупой отобрать 10—15 типичных колоний. Каждую колонию засеять штрихом на чашки Петри со средой Борде-Жангу с 30 % крови (5—6 колоний на 1 чашку). Чашки с культурой поместить в термостат при температуре (35,5 ± 0,5) °С на 18—24 ч. Через 18—24 ч определить активность выросшей культуры в реакции агглютинации на стекле с адсорбированными типоспецифическими сыворотками к агглютиногенам 1, 2, 3. Для дальнейшего исследования отбирают культуру, которая дает агглютинацию на стекле на 3 креста. Отобранную культуру пересевают на среду БЖ с 30 % крови или КУА с 5 % крови, затем ее проверяют в развернутой реакции агглютинации с агглютинирующей сывороткой к агглютиногенам 1, 2, 3. Культура, агглютинирующаяся типоспецифическими сыворотками к агглютиногенам 1, 2, 3 в разведении 1 :1 280 и выше, используется для лиофильной сушки как указано выше. Если культура агглютинируется сывороткой в более низких разведениях, то процедуру селекции необходимо повторить.

Разлитую партию ампул замораживают и высушивают одновременно. В журнале лиофилизации штаммов Bordetella pertussis регистрируют: название культуры, номер штамма или его особое название, количество разлитых ампул, дату розлива, дату замораживания, дату лиофилизации, дату отпайки, количество разлитых ампул, количество лиофи-лизированных ампул, количество забракованных ампул с высушенной культурой, фамилии и подписи исполнителей и ответственного лица. Качество запайки и наличие вакуума в ампулах проверяют на аппарате д'Арсонваля или Тесла. Остаточная влажность лиофилизата не должна превышать 3 %.

Каждую серию лиофилизированной культуры проверяют на выживаемость, отсутствие контаминации посторонней микрофлорой, затем по всем иммунобиологическим свойствам, указанным в разделе 1. Для контроля используют коклюшную культуру 2—3 пассажа. Результаты контроля фиксируют в журнале проверки штаммов. Лиофилизированную культуру регистрируют в инвентарном журнале коллекционных штаммов Bordetella pertussis.

Примечание:

1-ый пассаж - культура, выращенная при посеве из ампулы.

15

ББК 52.64 080

080 Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009.—43 с.

ISBN 978—5—7508—0800—7

1.    Разработаны: Федеральным государственным учреждением науки «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л. А. Тарасевича Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (д. м. н. Р. ГГ. Чупринина, к. м. н. И. А. Алексеева).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол № 3 от 6 декабря 2007 г.).

3.    Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 18 января 2008 г.

4.    Введены взамен документа - «Инструкция по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий», М3 СССР, 1987 г.

ББК 52.64

ISBN 978—5—7508—0800—7

€> Роспотребнадзор, 2009 © Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009

МУК 4.2.2317—08

Содержание

1.    Область применения...............................................................................................5

2.    Требования к производственным штаммам коклюшных бактерий

Bordetella pertussis..................................................................................................б

2.1.    Морфология...........................................................................................6

2.2.    Культуральные свойства.........................................................................б

2.3.    Ферментативные свойства......................................................................б

2.4.    Серологические свойства........................................................................6

2.5.    Антигенная структура (серотипы)...........................................................7

2.6.    Гемагглютинирующая и гемолитическая активность..............................7

2.7.    Дермонекротические свойства................................................................7

2.8.    Вирулентность.......................................................................................7

2.9.    Токсичность...........................................................................................8

2.10.    Защитные свойства...............................................................................9

3.    Требования к производственным штаммам паракоклюшных бактерий

Bordetella parapertussis...........................................................................................9

3.1.    Морфология...........................................................................................9

3.2.    Культуральные свойства.........................................................................9

3.3 .Ферментативные свойства.....................................................................10

3.4.    Серологические свойства......................................................................10

3.5.    Антигенная структура (серотипы).........................................................10

3.6.    Гемагглютинирующая и гемолитическая активность............................10

3.7.    Дермонекротические свойства..............................................................10

3.8.    Вирулентность.....................................................................................11

4.    Требования к производственным штаммам бронхисептикозных

бактерий Bordetella bronchiseptica......................................................................11

4.1.    Морфология.........................................................................................11

4.2.    Культуральные свойства.......................................................................11

4.3.    Ферментативные свойства....................................................................11

4.4.    Серологические свойства......................................................................11

4.5.    Антигенная структура (серотипы).........................................................12

4.6.    Гсмолизируюшая активность................................................................12

4.7.    Дермонекротические свойства..............................................................12

4.8.    Вирулентность.....................................................................................12

5.    Хранение штаммов........................................ 13

6.    Методы контроля производственных штаммов коклюшных,

паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий............................................16

3

6.1.    Морфологические и культуральные свойства........................................16

6.2.    Серологические свойства......................................................................17

6.2.1.    Развернутая реакция агглютинации..................................................17

6.2.2.    Реакция агглютинации на стекле.......................................................19

6.2.3.    Развёрнутая реакция агглютинации с сыворотками к

агглютиногенам 1, 2, 3 коклюшного микроба и 14 паракоклюшного микроба в пробирках............................................20

6.2.4.    Развёрнутая реакция агглютинации с сыворотками к

агглютиногенам 1,2, 3 коклюшного микроба и 14 паракоклюшного микроба (макро- или микрометодом) в планшетах............................................................................................21

6.3.    Определение гсмагглютинирующей и гемолизирующей активности.....22

6.3.1.    Агглютинация эритроцитов...............................................................22

6.3.2.    Определение гемолизирующей активности.....................................23

6.4.    Определение дермонекротических свойств...........................................23

6.5.    Методика определения вирулентности при интраназапьном

заражении.................................................. 24

6.6.    Оценка остаточной токсичности коклюшной вакцины..........................25

6.6.1.    Оценка токсичности коклюшной вакцины в тесте изменения

массы тела мышей..............................................................................25

6.6.2.    Оценка ос гаточного содержания термолабильного

(дермонекротического) токсина................................. .......26

6.6.3.    Оценка лейкоцитозстимулирующей активности.............................27

6.6.4.    Оценка гистаминсенсибилизируюшсй активности.........................28

6.7.    Методика определения защитных свойств штаммов коклюшных

бактерий..............................................................................................29

6.7.1.    Определение защитных свойств по выживаемости.........................30

6.7.2.    Определение количества международных защитных

единиц (МЗЕ)....................................................................................32

7. Возможность обновления производственных штаммов....................................37

Приложение 1. Среда Борде-Жангу........................................................................38

Приложение 2. Подсчет ЛД50 по методу Кербера..................................................39

Приложение 3. Паспорт на производственный штамм........................................40

Приложение 4. Таблица, используемая для подсчета ЕД50 при оценке

активности коклюшной вакцины.................................................42

4

МУК 4.2.2317—08

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

18 января 2008 г.

Дата введения: с момента утверждения

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисеш икозных бактерий

Методические указания МУК 4.2.2317—08

1. Область применения

1.1.    Настоящие методические указания устанавливают требования к штаммам коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий, используемым в производстве корпускулярного или бесклеточного коклюшного компонента комплексных вакцин, а также диагностическим коклюшным и паракоклюшным препаратам и методам их контроля, условиям приготовления лиофилизированных культур, их хранению.

1.2.    Методические указания предназначены для организаций, осуществляющих производственный выпуск препаратов для профилактики и диагностики коклюша и паракоклюша; органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор; учреждений, осуществляющих свою деятельность в целях обеспечения государственного санитарно-эпидемиологического надзора; других органов и организаций, осуществляющих контроль за качеством и безопасностью препаратов для профилактики и диагностики коклюша и паракоклюша.

2. Требования к производственным штаммам

коклюшных бактерий Bordetellapertussis

Для производства корпускулярного или бесклеточного коклюшного компонента комплексных вакцин и диагностических препаратов используют штаммы В. pertussis, отвечающие требованиям, характерным для гладкой формы (фазы I) бактерий. Из каждого изучаемого штамма готовят коклюшную вакцину (КВ), которую характеризуют по всем требуемым параметрам. Коклюшные микробные клетки и КВ, приготовленные из них, должны отвечать следующим требованиям.

2.J. Морфология Коклюшные бактерии - неподвижные, грамотрицательные, овоид-ной формы мелкие палочки (коккобактерии), располагающиеся в мазках отдельно или парами, без признаков полиморфизма, размером 0,2—0,3х 0,5—1,0 мкм. Имеют нежную капсулу. Спор не образуют.

2.2. Культуральные свойства Строгие аэробы, при росте использующие никотиновую кислоту, глутамин и цистеин как источники азота, углерода и энергии. Колонии микробов 1-го пассажа (посев лиофильно высушенной культуры из ампулы) появляются через 3—4 суток.

На среде Борде-Жангу (прилож. 1) колонии мелкие, диаметром от 0,5 до 1,0 мм, выпуклые, круглые, с ровными краями, серого цвета, блестящие (в виде «жемчужин»), полупрозрачные, окружённые нерезко ограниченной зоной гемолиза. На среде КУА (прилож. 1) колонии мелкие, диаметром около 1,0 мм, выгту1слые, круглые, с ровными краями, серовато-кремового цвета, блестящие. Культуры не должны расти на мясо-пептон ном агаре.

Оптимальная температура выращивания (36,0 ± 0,5) °С.

2.3. Ферментативные свойства В. pertussis ферментативно малоактивны, сахаров не расщепляют, не обладают протеолитической активностью, не восстанавливают нитратов, продуцируют оксидазу, каталазоположительны, лакмусовое молоко подщелачивают за 12—14 дней (табл. 1).

2.4. Серологические свойства Сывороткой диагностической коклюшной поливалентной (титр не ниже 1:16 000) культуры должны агглютинироваться не ниже 3/4 тит-

МУК 4.2.2317—08

ра, сывороткой диагностической паракоклюшной (титр не ниже 1:16 ООО) - не выше 1/10 титра.

2.5. Антигенная структура (серотипы)

Для рода Bordetella общим (родовым признаком) является наличие агглютиногена 7. Вид pertussis характеризуется обязательным присутствием агглютиногена 1 (видовой признак). Кроме того, в разной комбинации в состав штаммов могут входить агглютиногены: 2, 3, 4, 5, 6, 13 (табл. 2). При изготовлении вакцин необходимо использовать штаммы трёх серотипов (1, 2, 3; 1.2.0; 1.0.3), взятых в равных соотношениях. Культуры должны агглютинироваться соответствующими адсорбированными типоспецифическими сыворотками к агглютиногенам 1, 2, 3 не ниже 1 : 1 280.

2.6. Гемагглютинирующая и гемолитическая активность

Единичные колонии культур 2—3 пассажа на 1—2 сутки роста в тонком слое (1,5—2,0 мм) среды Борде-Жангу должны быть окружены зоной гемолиза.

Коклюшная суспензия (КС) мутностью 10 ME должна агглютинировать эритроциты человека 0 группы крови, куриные или гусиные эритроциты на 2 креста.

2.7. Дермонекротические свойства

При вну грикожном введении кроликам 0,2 мл взвеси, содержащей живую культуру мутностью 1 МБ, должен образоваться геморрагический некроз размером от 0,5 до 2,0 см в диаметре, у морских свинок - от 0,3 до 1,0 см.

2.8. Вирулентность

Культура должна быть вирулентной для мышей: при интраназаль-ном заражении ЛДо должна быть в пределах 10—200 млн микробных клеток, а при внутримозговом заражении - не выше 25 млн микробных клеток.

Примечание.

Мутносгь микробной взвеси определяют в сравнении с ОСО мутности ГИСК им. Л. А. Тарасевича (ОСО 42-28-85—05), который откалиброван по международному стандартному образцу. 1 ME (международная единица мутности) условно соответствует 1 млрд коклюшных бактерий.

7

2.9. Токсичность

КВ, приготовленная из обезвреженных формальдегидом культур одного штамма, содержащая мертиолят (100 ± 20) мкг/мл, должна обладать низкой токсичностью.

Определение остаточной токсичности

2.9.1.    В тесте изменения массы тела мышей по методу, рекомендованному ВОЗ. При внутрибрюшинном введении КВ в объеме 0,5 мл, содержащем Ю10 микробных клеток, все животные должны быть живы в течение срока наблюдения.

а)    Через 72 часа групповая масса тела мышей должна быть не ниже их массы тела перед введением препарата.

б)    Через 7 суток наблюдения относительный прирост массы тела мышей, получивших испытуемую вакцину, должен составлять не менее 60 % прироста массы тела контрольных мышей и не менее абсолютного и относительного прироста массы тела мышей, получивших отраслевой стандартный образец иммуногенной активности коклюшной вакцины ОСО 42-28-89-01П.

в)    Относительный прирост массы тела мышей, получивших ОСО 42-28-89-01П, должен соответствовать установленному показателю.

Если при проведении опыта одно из указанных условий нарушается, опыт повторяют на удвоенном количестве животных при гех же условиях учета опыта. Допускается гибель не более 5 % от общего числа животных.

2.9.2.    По лсйкоцитозстимулирующсй активности (ЛСА). КВ в объеме 0,5 мл, содержащем Ю10 микробных клеток, вводят мышам внутри-брюшинно. Вакцину следует считать слаботоксичной, если индекс ЛСА по отношению к ОСО 42-28-89-01П составляет 0,5 и меньше; средней токсичности, если индекс ЛСА находится в пределах от 0,5 до 1,0; с выраженной токсичностью, если индекс ЛСА более 1,0. Для производства коклюшного компонента вакцин штаммы с выраженной токсичностью использовать нельзя.

2.9.3.    По гистаминсенсибилизирующей активности (ГСА). Разные дозы КВ вводят внутрибрюшинно. КВ следует считать слаботоксичной, если индекс ГСА по отношению к отраслевому стандартному образцу гистаминсенсибилизирующей активности коклюшной вакцины ОСО 42-28-87-02П будет равен 0,5 или меньше; среднегоксичной, если индекс ГСА будет находиться в пределах от 0,5 до 1,0; и с выраженными гистаминсенсибилизирующими свойствами, если индекс ГСА будет 1,0

МУК 4.2.2317—08

и более. Для производства коклюшного ком помет а вакцин штаммы с выраженной токсичностью использовать нельзя.

2.9.4. По остаточному содержанию термолабильного (дермонекротического) токсина (ТЛТ). Определяют при подкожном введении испытуемых КВ в затылочную область мышей-сосунков или при внутрикож-ном введении белокожим кроликам породы шиншилла.

КВ не должна вызывать изменения кожных покровов у мышей-сосунков.

КВ не должна вызывать у кроликов некроз. Допускается гиперемия диаметром не более 10 мм. На месте введения живой культуры должен определяться некроз размером не менее 5 мм в диаметре (контроль чувствительности кроликов к коклюшному токсину).

2.10. Защитные свойства

КВ при однократном внутрибрюшинном введении мышам в дозе, содержащей микробные клетки в концентрации 0,75*109, должна обеспечивать выживаемость при последующем заражении вирулентным штаммом В. pertussis № 18323 не менее 70 % животных.

Суспензия мутностью 20 ME должна содержать не менее 10 международных защитных единиц (МЗЕ).

Примечание:

При использовании штаммов коклюшных бактерий только в производстве диагностических препаратов (сывороток, диагностикумов) защитные свойства не проверяют.

3. Требования к производственным штаммам паракоклюшных бактерий Bordetellaparapertussis

3.1. Морфология

Паракоюношные бактерии морфологически подобны коклюшным бактериям. Это неподвижные, грамотрицатсльные, мелкие палочки, располагающиеся в мазках отдельно или парами, иногда в виде коротких цепочек, без признаков диссоциации, размером от 0,6 до 2,0 мкм. Спор не образуют.

3.2. Культуральные свойства

Строгие аэробы, использующие, как и коклюшные бактерии, для своего роста аминокислоты. На среде Борде-Жашу на 1—2 сутки образуют колонии выпуклые с ровными краями, серого цвета, блестящие, напоминающие капельки ртути, полупрозрачные, диаметром до 1,2 мм,

1

Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, v.l.