Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств тиенкарбазон-метила в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.3561—19

Издание официальное

Москва • 2019

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств тиенкарбазон-метила в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.3561—19

V. Требования безопасности

5.1.    При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ

12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019. а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

5.2.    Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов¹.

VI. Требования к квалификации операторов

6.1.    Измерения в соответствии с настоящими МУК может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

VII. Условия измерений

7.1.    При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

-    процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ±5) °С, относительной влажности не более 80 %;

-    выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

VIII. Подготовка к определению

8.1 Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с окисью алюминия для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с окисью алюминия, установление градуировочной характеристики.

Подготовка органических растворителей.

8.1.1.    Очистка ацетонитрила.

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм . Выдерживают его над осушителем в течение 5—6 часов.

Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °С, отбрасывают.

8.1.2.    Очистка хлористого метилена.

Хлористый метилен промывают равным объемом 5%-го раствора натрия углекислого кислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 12—24 часов. Затем хлористый метилен сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей. Хлористый метилен перегоняют при температу ре 40,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 40,0 °С, отбрасывают.

8.1.3.    Очистка гексана.

Гексан, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5—6 часов. Затем гексан сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Гексан перегоняют при температуре 68,7 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 68.7 °С, отбрасывают.

8.1.4.    Приготовление бидистиллированнои воды.

Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со

шлифом объемом 4 000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм³ и кипятят в течение 6 часов.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °С, отбрасывают.

8.2. Приготовление растворов для проведения анализа.

8.2.1.    Приготов1ение подвижной фазы для ВЭЖХ.

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил, бидистиллированную воду и ортофосфорную или муравьиную кислоту.

8.2.1.1.    Подвижная фаза № 1.

В плоскодонную колбу объемом 1000 см³ помещают 400 см³ ацетонитрила и 600 см³ 0,005 М водного раствора ортофосфорной кислоты. Смесь тщательно перемешивают.

8.2.1.2.    Подвижная фаза № 2.

В плоскодонную колбу объемом 1000 см³ помещают 400 см³ ацетонитрила и 600 см³ 0,1 % водного раствора муравьиной кислоты. Смесь тщательно перемешивают.

В случае отсутствия в составе хроматографической системы автоматического дегазатора через раствор подвижной фазы пропускают газообразный гелий со скоростью 20 см ³/мин в течение 5 минут, после чего его помешают на 1 минуту в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов.

8.2.2. Приготовление рабочих растворов.

8.2.2.1.    Приготовление 0.1 % раствора муравьиной кислоты.

В мерную колбу объемом 1 ООО см³ помещают 500 см³ бидистилли-рованной воды. 1 см’ муравьиной кислоты, перемешивают, после чего доводят объем до метки бидистиллированной водой.

8.2.2.2.    Приготовление 2 М раствора ортофосфорной кислоты.

В мерную колбу объемом 100 см³ помешают 50 см³ бидистиллированной воды, вносят 13.7 см³ 85.0%-й ортофосфорной кислоты, доводят объем бидистиллированной водой до метки и перемешивают.

8.2.2.3.    Приготовление 0.005 М раствора ортофосфорной кислоты.

В мерную колбу объемом 1 000 см³ помещают 500 см³ бидистиллированной воды. 2.5 см³ 2 М раствора ортофосфорной кислоты, доводят объем профильтрованной через мембранный фильтр бидистиллированной водой до метки и перемешивают. Раствор используют в качестве компонента подвижной фазы для хроматографического анализа.

8.2.2.4.    Приготовление смеси ацетонитрила с уксусной кислотой в соотношении 99 : 1.

В мерную колбу объемом 100 см³ помещают 50 см³ ацетонитрила. 1 см³ уксусной кислоты, перемешивают, после чего доводят объем до метки ацетонитрилом.

8.2.2.5.    Приготовление 1 М раствора гидроокиси натрия.

В термостойкий химический стакан объемом 500 см' переносят 20 г гидроокиси натрия, добавляют 200—300 см³ дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают (осторожно, при растворении щелочи раствор сильно нагревается) и после охлаждения раствор переносят в мерную колбу, доводят объем до метки дистиллированной водой и перемешивают (при приготовлении раствора следует соблюдать осторожность и работать под тягой).

8.2.2.6.    Приготовление 0.05 М раствора двузамешенного фосфорнокислого калия с NaCI.

Взвешивают 11.4 г К_:НР0₄ х ЗН;0 и 100 г NaCI и переносят в мерную колбу на I 000 см³. добавляют 500—600 см³ дистиллированной воды. перемешивают до полного растворения солей, проверяют pH полученного раствора. Если pH раствора менее 9, доводят его до указанного значения с помощью 1 М раствора гидроокиси натрия, контролируя pH. После достижения нужного значения pH объем доводят водой до метки.

8.2.2.7.    Приготовление 0,05 М раствора двузамещенного фосфорнокислого калия без NaCI.

Взвешивают 11,4 г К:НР0₄ х ЗН₂0 и переносят в мерную колбу объемом 1000 см³. добавляют 500—600 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения солей, проверяют pH полученного раствора. Если pH раствора менее 9, доводят его до указанного значения с помощью 1 М раствора гидроокиси натрия, контролируя pH. После достижения нужного значения pH объем доводят водой до метки.

8.2.2.8.    Приготовление 0,5 % водного раствора уксусной кислоты.

В мерную колбу объемом 100 см³ помещают 50 см³ бидистиллиро-ванной воды, прибавляют 0,5 см³ ледяной уксусной кислоты, перемешивают и доводят водой объем в колбе до метки. Раствор используется для приготовления 0,005 % водного раствора уксусной кислоты.

8.2.2.9.    Приготовление 0,005 % водного раствора уксусной кислоты.

В мерную колбу объемом 100 см³ помешают 50 см³ бидистиллиро-

ванной воды, прибавляют 1 см³ 0,5 % водного раствора уксусной кислоты. перемешивают и доводят водой объем в колбе до метки.

8.2.2.10.    Приготовление 0.1 % раствора уксусной кислоты в ацетонитриле.

В мерную колбу объемом 100 см³ помещают 50 см³ ацетонитрила, прибавляют 0,1 см³ ледяной уксусной кислоты, перемешивают и доводят ацетонитрилом объем в колбе до метки.

8.2.2.11.    Приготовление 5 % раствора натрия углекислого кислого.

В мерную колбу объемом 1 000 см^ переносят 50 г натрия углекислого кислого, добавляют 200—300 см³ дистиллированной воды, перемешивают содержимое до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки. Раствор используют для очистки хлористого метилена.

8.2.3. Приготовление градуировочных растворов.

8.2.3.1.    Стандартный раствор Х° 1 с концентрацией тиенкарбазон-метила 1,0 мг/см³.

Взвешивают 50 мг тиенкарбазон-метила в мерной колбе объемом 50 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор X» 1 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.

8.2.3.2.    Стандартный раствор X? 2 с концентрацией тиенкарбазон-метила 10,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора Х° 1 отбирают пипеткой 1 см³, помешают в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки ацетонитри-

лом. Стандартный раствор № 2 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор X? 2 хранится в холодильнике не более 30 суток.

8.2.3.3.    Стандартный раствор № 3 с концентрацией тиенкарбазон-метила 1,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см³, помешают в мерную колбу объемом 10 см¹ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 3 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.

8.2.3.4.    Стандартный раствор №4 с концентрацией тиенкарбазон-метила 0,5 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор №4 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике нс более 30 суток.

8.2.3.5.    Стандартный раствор № 5 с концентрацией тиенкарбазон-метила 0,2 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 2 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 5 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.

8.2.3.6.    Стандартный раствор №6 с концентрацией тиенкарбазон-метила0.1 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 см\ помещают в мерную колбу объемом 10 см* и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор Х?6 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.

8.2.3.7.    Стандартный раствор № 7 с концентрацией тиенкарбазон-метила 0,07 мкг/см'.

Из стандартного раствора № 6 отбирают пипеткой 7 см', помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 7 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.

8.2.3.8. Стандартные растворы тиенкарбазон-метила с концентрацией 2.5; 2.0; 1,25; 1,0; 0,5; 0.4; 0.25 и 0,2 мкг/см³ для внесения в контрольные образцы.

Методом последовательного разведения ацетонитрилом стандартного раствора №2 готовят растворы, содержащие по 2,5; 2.0; 1,25; 1,0; 0,5; 0.4; 0.25 и 0.2 мкг/см³. и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы. Стандартные растворы для внесения хранятся в холодильнике не более 30 суток.

8.3.    Установление градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации тиенкарбазон-метила в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной казибровки по 5 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0.2 и 0.1 и 0,07 мкг/см³.

В инжектор хроматографа вводят по 10 или 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

8.4.    Подготовка концентрирующих патронов ЛЬ 1 для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения тиенкарбазон-метила на них.

8.4.1.    Подготовка концентрирующих патронов ЛЬ I для очистки экстракта.

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через концентрирующий патрон № 1 не должна превышать 5 см³/мин.

Концентрирующий патрон № 1 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в концентрирующий патрон № 1 вставляют шприц с разъемом типа Яюер объемом не менее 10 см³ (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование; концентрирующий патрон № 1 промывают 10 см³ ацетонитрила, затем 15 см³ бидистиллированной воды. Элюаты отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности концентрирующего патрона X? 1.

8.4.2.    Проверка хроматографического поведения тиенкарбазон-метила на концентрирующих патронах ЛЬ I.

В концентратор объемом 100 см³ вносят 1 см³ стандартного раствора тиенкарбазон-метила в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см³ и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 5 см' 0,05 М раствора дву замешенного фосфорнокислого калия (п. 8.2.2.7), помещают концентратор на 5—10 секунд в ультразвуковую ванну, обмывают стенки концентратора и вносят раствор на подготовленный концентрирующий патрон № 1. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Исходный концентратор обмывают 10 см³ 0,005 % водного раствора уксусной кислоты и вносят раствор на концентрирующий патрон № 1. Элюат собирают в концентратор объемом по 100 см , упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Концентрирующий патрон высушивают под вакуумом примерно 2 минуты.

Исходную колбу обмывают двумя порциями 0,1%-го раствора уксусной кислоты в ацетонитриле объемом 10 см³ каждая и последовательно вносят их на концентрирующий патрон № 1. Элюаты собирают в концентратор объемом по 100 см³. упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Отдувают холодным воздухом до исчезновения запаха уксусной кислоты.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1 : 1 и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие тиенкарбазон-метил, полноту смывания с концентрирующего патрона № 1 и необходимый объем элю-ента.

Изучение поведения тиенкарбазон-метила на концентрирующих патронах № 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов № 1.

8.5. Подготовка колонки с окисью азюминия для очистки экстракта и проверка хроматографического поведения тиенкарбазон-метила.

8.5.1.    Подготовка колонки с окисью азюминия для очистки экстракта.

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 3 г окиси алюминия с зернением 40/250 меш и. аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 см³ ацетонитрила.

8.5.2.    Проверка хроматографического поведения тиенкарбазон-метила на колонке с окисью алюминия.

В концентратор объемом 100 см³ вносят 1 см³ стандартного раствора тиенкарбазон-метила в ацетонитриле с концентрацией 1.0мкг/см³ и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 10 см³ смеси аце-

тонитрила с уксусной кислотой в соотношении 99 : 1, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С. Исходную колбу обмывают тремя порциями смеси ацетонитрила с уксусной кислотой в соотношении 99: 1 объемом 10 см³ каждая и последовательно вносят их на колону. Каждую порцию собирают отдельно в концентратор объемом 100 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1 : 1 и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие тиенкарбазон-метил. полноту смывания с колонки и необходимый объем элюата.

Изучение поведения тиенкарбазон-метила на колонке проводят каждый раз при отработке методики или посту плении новой партии окиси алюминия.

8.6. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии.

Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °С 3—4 часа.

IX. Отбор проб и хранение

9.1.    Отбор проб производится в соответствии с утвержденными документами'.

Пробы ботвы и корнеплодов сахарной свеклы хранят в холодильнике при температуре (4 ± 2) °С не более I суток, для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температу ре не выше -18 °С. Перед проведением анализа ботву и корнеплоды измельчают.

X. Выполнение определения

10.1. Ботва сахарной свеклы

10.1.1.    Экстракция.

Образец измельченной ботвы массой 5 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, прибавляют 50 см³ ацетонитрила и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 см³ через бумажный фильтр

² Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, нишевых проду ктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов: ГОС! 33884

низкой плотности. Экстракцию повторяют еше одной порцией ацетонитрила объемом 50 см³ 5 минут в ультразвуковой ванне. Экстракты фильтруют, объединяют в концентраторе объемом 250 см³ и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

10.1.2.    Очистка экстракта перераспределением в системе несме-шивающихся растворителей.

К сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 10.1.1, прибавляют 2 см ацетонитрила, обмывают стенки концентратора, прибавляют 50 см³ 0,05 М двузамешенного фосфорнокислого калия (п. 8.2.2.6), тщательно обмывая стенки концентратора, и переносят смыв в делительную воронку объемом 250 см³. Водную фракцию промывают двумя порциями гексана по 50 см³ каждая, встряхивая каждый раз делительную воронку в течение 2 минут. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а нижний водный слой возвращают в делительную воронку и доводят pH раствора до значения 3,5 с помощью 2 М водного раствора ортофосфорной кислоты, контролируя pH.

Тиенкарбазон-метил экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 30 см³, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) собирают в концентратор объемом 250 см³, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

10.1.3.    Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия.

Сухой остаток, полученный по п. 10.1.2, растворяют в 10 см³ смеси

ацетонитрила с уксусной кислотой в соотношении 99 : 1. тщательно обмывая стенки концентратора, наносят на подготовленную колонку, элю-ат собирают в концентратор объемом 100 см³. Исходную колбу обмывают еше двумя порциями смеси ацетонитрила с уксусной кислотой в соотношении 99: 1 объемом 10 см³ каждая и последовательно вносят их на колонку. Элюаты объединяют в концентраторе объемом 100 см' и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Отдувают током холодного воздуха до исчезновения запаха уксусной кислоты.

Сухой остаток растворяют в 2,5 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1 : 1 и хроматографируют.

10.2. Корнеплоды сахарной свеклы

10.2.1. Экстракция.

Образец измельченных корнеплодов массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, прибавляют

50 см³ ацетонитрила и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 см' через бумажный фильтр низкой плотности. Экстракцию повторяют еще двумя порциями ацетонитрила объемом 50 см³ 5 минут в ультразвуковой ванне. Экстракты фильтруют, объединяют в концентраторе объемом 250 см³ и выпаривают до водного остатка при температуре не выше 30 °С.

10.2.2.    Очистка экстракта перераспределением в системе несме-шибающихся растворителей.

К водному остатку в концентраторе, полученному по п. 10.2.1, прибавляют 2 см³ ацетонитрила, обмывают стенки концентратора, прибавляют 50 см³ 0,05 М двузамещенного фосфорнокислого калия (п. 8.2.2.6), тщательно обмывая стенки концентратора, и переносят смыв в делительную воронку объемом 250 см³. Водную фракцию промывают двумя порциями гексана по 50 см³ каждая, встряхивая каждый раз делительную воронку в течение 2 минут. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а нижний водный слой возвращают в делительную воронку и доводят pH раствора до значения 3,5 с помощью 2 М водного раствора ортофосфорной кислоты, контролируя pH.

Тиенкарбазон-метил экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 20 см³, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) собирают в концентратор объемом 250 см³, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1 : 1 и 10 мм³ пробы вводят в хроматограф.

При недостаточной очистке проводят дополнительную очистку экстракта, как указано в п. 10.1.3, или на концентрирующих патронах № 1 по следу ющей схеме.

10.2.3.    Очистка экстракта на концентрирующих патронах Ms I.

Сухой остаток, полученный по п. 10.2.2, растворяют в 5 см³ 0,05 М

раствора двузамещенного фосфорнокислого калия (п. 8.2.2.7), помещают концентратор на 5—10 секунд в ультразвуковую ванну, обмывают стенки концентратора и вносят раствор на подготовленный концентрирующий патрон № 1. Элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 см³ 0,005%-го водного раствора уксусной кислоты и вносят раствор на концентрирующий нагрон № 1. Элюат отбрасывают. Концентрирующий патрон № 1 высушивают под вакуумом примерно 2 минуты.

ББК 51.23 0-62

0-62 Определение остаточных количеств тиенкарбазон-метила в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии: Методические указания.—М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 2019.— 27 с.

ISBN 978-5-7508-1715-3

1.    Разработаны ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева. Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология псстицилов и агрохимикатов» Минсельхоза России (А. В. Довгилевич. Е. В. Довгилевич. Е. Н. Тестова, Н. В. Устименко).

2.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 11 октября 2019 г

3 Введены впервые

ББК 51.23

ISBN 978- 5-7508 1715-3

© Роспотребнадзор. 2019

Тиенкарбазон-метил элюируют с патрона № 1 10 см³ 0,1%-го раствора уксусной кислоты в ацетонитриле, элюат собирают в концентратор объемом 100 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Отдувают током холодного воздуха до исчезновения запаха уксусной кислоты.

Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1 : 1 и хроматографируют.

10.3. Условия хроматографирования

10.3.1. Хроматографическая система, включающая:

-    хроматограф жидкостной с диодно-матричным детектором, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °С и с возможностью использования стандартного автосамплера с дозирующим объемом от 0.1 до 100 мм³ для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему;

-    компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.

Колонка хроматографическая стальная, длиной 250 мм. с внутренним диаметром 4.6 мм. зернением 5 мкм. заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С18.

Температура колонки: 30 °С.

Подвижная фаза X? 1: ацетонитрил с 0,005 М водным раствором ор-тофосфорной кислоты (%, по объему) в градиентном режиме. Градиент потока элюента: до 14 минуты - 40 : 60; с 14 по 17 минуту - 70 : 30; к 25 минуте - 40 : 60; с 25 по 30 минуту - 40 : 60.

Скорость потока элюента: 1.0 см³/мин.

Длина волны: 240 нм.

Чувствительность не менее 10mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 мм³.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2—20 нг.

Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор тиенкар-базон-метила с концентрацией 1,0 мкг/см³, соответственно разбавляют.

Примечание. При хроматографировании проб корнеплодов и ботвы сахарной свеклы длительность инъекции должна быть не менее 30 минут при работе в гратиентном режиме в указанных выше условиях хроматографирования, для того чтобы выходящие в этот интерват времени матричные пики нс искажаж результат следующего хроматографического анализа.

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

11 октября 2019 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств тиенкарбазон-метила в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом

высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания _МУК    4.13561—19_

I. Общие положения и область применения

1.1.    Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств тиенкарба-зон-метила в ботве сахарной свеклы в диапазоне 0,05—0,50 мг/кг и в корнеплодах сахарной свеклы в диапазоне 0,01—0,10 мг/кг.

1.2.    Физико-химические свойства тиенкарбазон-метила.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 3-тиофенкарбоновая    кислота, 4-[[[(4,5-дигидро-3-метокси-4-метил-5-оксо-1Н-1,2,4-триа-

зол-1 -ил)карбо-нил]амино]сульфонил]-5-метил. метиловый эфир.

Структурная формула:

СИ

U м

A_nA_n

N

Эмпирическая формула: C12HMN4O7S2.

Молекулярная масса: 390.4.

Цвет, запах: химически чистый тиенкарбазон-метил представляет собой белый порошок с легким характерным запахом.

Температура плавления: > 401 °С.

Температура кипения и замерзания: не определена, т. к. разрушается при 140 °С.

Температура вспышки и воспламенения: более 386 °С.

Плотность: 1,51 г/см³ при 20 °С.

Давление паров в мм рт. ст.:

-    8.8 х 10 ¹⁴ Па при 20 °С (экстраполированный);

-    3.7 х Ю~¹³ Па при 25 °С (экстраполированный);

-    2,3 х 10 ¹⁰ Па при 50 °С (экстраполированный).

Коэффициент распределения октанол-вода:

	Pow	Log Povv
pH 4	0.738	-0.13
pH 7	0.010	-1.98
pH 9	0.0073	-2.14

Растворимость в воде: 72 мг/дм³ (при 20 °С, pH 3,9).

Растворимость в органических растворителях (г/дм³, при 20 °С): дихлорметан 100—120. ацетон - 9,54, этил ацетат - 2,19. толуен - 0,91. этанол - 0.23. П-гексан - 0,15 х 10 \

1.3.Краткая токсикологическая характеристика: тиенкарбазон-метил относится к мало опасным по острой оральной (ЛД50 для крыс более 2 000 мг/кг) и дермальной токсичности (ЛД₅₀ для крыс более

2    000 мг/кг). но к умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК^, для крыс (4 часа) более 2 018 мг/м³ воздуха). Тиенкарбазон-метил нефро- и нейротоксичен.

В организме животных тиенкарбазон-метил метаболизируется слабо, в растениях разлагается быстро и полностью. Главными метаболитами в растениях являются BYH 18636-ММТ-глюкозид и BYH 18636-N-десметил. В полевых условиях ДТ«ю тиенкарбазон-метила составляет от

3    до 44,6 дня. ДТоо от 9,9 до 148 дней. Тиенкарбазон-метил фотолитиче-ски стабилен. ДТ50 в воде составляет от 130 до 148 дней.

Область применения: тиенкарбазон-метил - гербицид системного действия, быстро поглощается листьями и корневой системой сорняков, свободно перемещается по всему растению с нисходящими и восходящими токами питательных веществ. Благодаря системному действию препарат проникает во все части растения, включая «спящие» почки. На

биохимическом уровне гербицид воздействует на фермент ацетолактат-синтазу (ALS), участвующий в цепи биосинтеза аминокислот, и нарушает процессы синтеза белков, что вызывает прекращение деления клеток в меристемных тканях сорных растений.

1.4.    МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.5.    МУК носят рекомендательный характер.

II. Погрешность измерений

2.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0.95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (п = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 1

Метрологические параметры для тиенкарбазон-метила

Анализируемый объект Диапазон определяемых концентраций, мг/кг Показатель точности (граница относительной погрешности), ±6. %, Р = 0.95 Стандартное отклонение повторяемости, <г„ % Предел повто ряе мости. г.% Предел воспроизводимости, R, % Ботва сахар-ной свеклы 0,05—0,10 вкл. 50 7 20 28 0.20—0.50 вкл. 8 22 31 Корнеплоды сахарной свеклы 0.01—0.10 вкл. 50 8 22 31

Таблица 2 Полнот н (влечении вещества, стандартное отклонение, доверительный ишсрвал среднего результата для iиенкарПа тон-четнла

Анализируемый объект Метрологические параметры. Р = 0.95. п = 20 предел обнару жения. мг/кг диапазон определяемых концентраций. мг/кг полнота извлечения вещества % стандартное отклонение. S.% доверительный ингерваз среднего результата. ±. % Ботва сахарной свеклы 0.05 0.05—0.50 79.3 8.1 3.0 Корнеплоды сахарной свеклы 0.01 0.01—0.10 77.0 6.4 2.3

III. Метод измерения

3.1. Метод основан на определении тиенкарбазон-метила с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) с использованием диодно-матричного детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, на колонках с окисью алюминия и на концентрирующих патронах для твердофазной экстракции с привитыми гидрофобными гексадецильными группами.

Идентификация вещества проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором колонки и условий программирования.

IV. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

4.1. Средства и мереный Весы аналитические класса точности - специальный (I). с наибольшим пределом взвешивания до 110 г и дискретностью 0.0001 г    ГОСТ    Р 53228

Весы лабораторные общего назначения класса точности - средний (III) с наибольшим пределом взвешивания до 400 г и пределом допустимой погрешности ± 0,5 г    ГОСТ    Р 53228

Колбы мерные объемом 10. 50. 100. 500 и 1000 см’    ГОСТ    1770

Пипетки мерные объемом 1.0: 2.0. 5.0 и 10.0 см'

рН-метр/милливольтметр с диапазоном измерения от 0 до 14 pH; ± 1999 мВ Хроматографическая система, включающая:

-    хроматограф жидкостной с диодноматричным детектором, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °С и с возможностью использования стандартного автосамплера с дозирующим объемом от 0,1 до 100 мм³ для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему

-    компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ

Цилиндры мерные объемом 10,25 и 50 см³ ГОСТ 1770

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.2. Реактивы Тиенкарбазон-метил, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 99,0 %

Ацетонитрил, осч, УФ-200 нм Алюминий окись для хроматографии, ч Вода дистиллированная и (или) бидистиллированная (вода дистиллированная, перегнанная повторно в стеклянной емкости)

Гелий, очищенный n-Гексан, хч

Калий марганцовокислый, чда Калий фосфорнокислый двузамещбнный,

3-водный. чда Кальций хлористый, ч Кислота муравьиная, чда Кислота ортофосфорная, 85 %, чда Кислота уксусная, ледяная, хч

Концентрирующие патроны для твердофазной экстракции с привитыми гидрофобными гексадецильными группами с постоянной активностью с размером частиц 63—200 мкм (С 16) (объем - 1 см³, масса сорбента - 0,6 г)

(далее - концентрирующий патрон № 1);

Метилен хлористый, хч

Натрий сернокислый, безводный, хч    ГОСТ    4166

Натрий хлористый, хч    ГОСТ    4233

Натрий углекислый, кислый, хч    ГОСТ    4201

Натрия гидроокись, хч    ГОСТ    4328

Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.3. Вспомогательные устройства, материалы

Алонж прямой с отводом для вакуума для работы с концентрирующими патронами Банки полипропиленовые с крышками для экстракции вместимостью 250 см³ Ванна ультразвуковая с потребляемой мощностью 140 Вт, рабочей частотой 50 Гц, рабочим объемом 4,5 дм³ Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная

Виалы объемом 2 см³, закрываемые завинчивающейся или запрессовывающейся крышкой с тефлонированной резиновой прокладкой, прокалываемой микрошприцем для автоматического дозатора проб Воронки делительные объемом 250 см³ Воронки лабораторные, стеклянные Испаритель ротационный вакуумный с ручным подъемником, с диагональным конденсором и объемом испарительной колбы от 50 до 3 000 см³, с изменяемой скоростью вращения штока испарителя от 5 до 240 об./мин. с водяной баней с антикоррозионным покрытием объемом 5 дм³ и с диапазоном температу р от 20 до 100 °С

Колбы конические плоскодонные объемом 100,

250 и 1 ООО см’    ГОСТ    25336

Колбы круглодонные со шлифом (концентраторы) объемом 100. 250 см³ и 4000 см³ТС Колонка хроматографическая стальная, длиной 150 мм. с внутренним диаметром 3,9 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С18 Колонка хроматографическая стальная, длиной 250 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С18 Колонки хроматографические, стеклянные или пластиковые, длиной 150—250 мм и диаметром 15 мм

Насос диафрагменный, химически стойкий на 100 %, с мощностью электропривода 245 Вт. предельным вакуумом 100 мбар/абс, с избыточным давлением I бар и скоростью откачки 34 дм³/мин

Предколонка хроматографическая стальная, длиной 12,5 мм, внутренним диаметром 2,1 мм. зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С18 Стаканы стеклянные, термостойкие объемом 100—500 см’    ГОСТ    25336

Установка для перегонки растворителей с круглодонной

колбой объемом 4 000 см³ и приемной конической колбой объемом 1000 см⁵ Фильтры обеззоленные нейтральные, быстро фильтрующие, диаметром 11 см, зольность одного фильтра 0,00072 г Фильтры для очистки растворителей, диаметром 20 мм с отверстиями пор 20 мкм Шприц инъекционный многократного применения объемом 10 см³    ГОСТ    22967

Примечание. .Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

1

ГН 2 2 5.3532—18 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». ГН 2 2 5 2308—07 «Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОВУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны»