Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств флудиоксонила в капусте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.3283—15

Издание официальное

Москва * 2016

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств флудиоксонила в капусте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.3283—15

фильтруют через мембранный фильтр. Хранят в темноте (в емкости из темного стекла) не более месяца.

7.3. Кондиционирование хроматографической колонки

Колонку промывают подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 0,8 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.4. Приготовление градуировочных растворов

7.4.1.    Исходный раствор флудиоксонила для градуировки (концентрация 100мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,010 г флудиоксонила, растворяют в 50—70 см³ ацетонитрила, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике при температуре 4—6 °С в течение 3 месяцев.

Градуировочные растворы №2—5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.4.2.    Раствор № 1 флудиоксонила для градуировки и внесения (концентрация 5 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 5,0 см³ исходного раствора флудиоксонила с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.4.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике при 4—6 °С в течение 3 месяцев.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом «внесено-найдено» и контроле точности методом добавок.

7.4.3.    Рабочие растворы №2—5 флудиоксонила для градуировки (концентрация 0,05—0,5 мкг/см³). В 4 мерные колбы вместимостью 50 см³ помещают по 0,5; 1,0, 2,5 и 5 см³ раствора № 1 флудиоксонила с конценграцией 5 мкг/см³ (п. 7.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы №2—5 с концентрацией флудиоксонила 0,05, 0,1, 0,25 и 0,5 мкг/см³ соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике при 4—6 °С в течение месяца.

7.5. Усыновление градуировочной характеристики

Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площадей пиков (мЕА • с или ЕЛ • с) от концентрации флудиоксонила в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки № 2—5.

МУК 4.1.3283—15

В инжектор хроматографа вводят 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

7.6. Приготовление смеси гексан-этилацетат (объемное соотношение 8 :2) для очистки экстрактов на колонке с силикагелем В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 80 см³ гексана и 20 см³ этилацетата, перемешивают. Хранят в темноте (в емкости из темного стекла) не более месяца.

7.7. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстрактов Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 10—12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля в 30 см³ гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, на который помещают слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают смесью гексан-этилацетат в объемном соотношении 8 :2, порцией 20 см³, скорость прохождения растворителя 1—2 капли в секунду. Колонка готова к работе.

7.8. Проверка хроматографического поведения флудиоксонила на колонке с силикагелем В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора №1 флудиоксонила с концентрацией Юмкг/см³, упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °С. Сухой остаток растворяют в 3 см³ смеси гексан-этилацетат (8 : 2, по объему), помещая на ультразвуковую баню на 40—60 с, и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают дважды этой же смесью растворителей, порциями по 3 см³, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку -1—2 капли в секунду. Промывают колонку 40 см³ смеси гексан-этил-ацетат в объемном соотношении 8 : 2, элюат о тбрасывают.

Затем колонку промывают 60 см³ смеси гексан-этилацетаг (8 : 2, по объему) со скоростью 1—2 капли в секунду. Фракционно (по 10 см³) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ, анализируют содержание флудиоксонила по п. 9.4.

Фракции, содержащие флудиоксонил, объединяют и вновь анализируют.

Примечание. Проверку хроматографического поведения флудиоксонила следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изме-

11

няться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

7.9. Приготовление смеси ацетонитрил-вода (объемное соотношение 8:2) для экстракции

В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 400 см³ ацетонитрила и 100 см³ воды, перемешивают. Хранят в темноте (в емкости из темного стекла) не более месяца.

7.10. Приготовление смеси гексан-трет-бутилметиловый эфир (объемное соотношение 4:1) для очистки экстракта в системе несмешивающихся растворителей

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 80 см³ гексана и 20 см³ трет-бутилметилового эфира, перемешивают. Хранят в темноте (в емкости из темного стекла) не более месяца.

8. Отбор и храпение проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ 1724-85 «Капуста белокочанная свежая, заготовляемая и поставляемая. Технические условия», ГОСТ Р 51809-2001 «Капуста белокочанная свежая, реализуемая в розничной торговой сети. Технические условия», «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№2051-79 от 21.08.1979).

Отобранные пробы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 5 дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре ниже -18 °С.

Перед анализом образцы измельчают.

9. Выполнение определения 9.1. Экстракция

Измельченный образец массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250—300 см³, вносят 100 см³ смеси ацетонитрил-вода (8 : 2, по объему) и помещают на встряхивателъ на 1 час.

Пробе дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной бумажный фильтр средней плотности. Осадок на фильтре промывают 30 см³ смеси ацетонитрил-вода (8 :2, по объему). Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в мерный цилиндр, перемешивают, измеряют объем раствора, /г его часть (экви-

МУК 4.1.3283—15

валентную Юг образца) переносят в делительную воронку на 100— 250 см³ и очищают в системе несмепшвающихся растворителей по п. 9.2, затем на колонке с силикагелем но п. 9.3.

9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей К аликвоте экстракта пробы ('Л часть), находящейся в делительной воронке, добавляют 20 см³ гексана, интенсивно встряхивают 1 мин. Верхний гексановый слой отбрасывают. Нижнюю ацетонитрильную фазу переносят в колбу для упаривания на 250 см³ и упаривают до водного остатка (5—10 см³) при температуре 35—40 °С.

Водный остаток в колбе переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³, добавляют 70 см³ бидистиллированной воды, 20 см³ насыщенного хлористого натрия и 20 см³ смеси гсксан-трст-бутилмети-ловый эфир (4 : I, по объему), предварительно обмыв ими колбу, в которой находилась проба, интенсивно встряхивают в течение 1 мин, после полного разделения фаз верхний слой собирают, нижний водный слой возвращают в воронку и экстракцию повторяют новой порцией смеси гексан-метил-третбутиповый эфир объемом 20 см³. Нижний водный слой отбрасывают.

Объединенный экстракт фильтруют через слой (около 2 см) безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в химическую воронку, в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 150 см³, упаривают досуха. Остаток растворяют в 3 см³ смеси гексан-этилацетат (8 :2, по объему) и очищают на колонке с силикагелем по п. 9.3.

9.3. Очистка экстракта па колонке с силикагелем Растворенный в 3 см³ смеси гексан-этилацетат (8 :2, по объему) остаток, полученный по п. 9.2, наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают дважды смесью гексан-этилацетат (8 : 2, по объему) порциями по 3 см³, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1—2 капли в секунду. Промывают колонку 40 см³ смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 8 : 2, элюат отбрасывают.

Флудиоксонил элюируют с колонки 50 см³ этой же смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 8 :2 со скоростью 1—2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 150 см³, раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С, остаток рас-

13

творяют в 2 см³ подвижной фазы и анализируют содержание флудиок-сонила по п. 9.4.

9.4. Условия хроматографирования

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах. Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым и/или флуоресцентным детекторами, снабжепный дегазатором, автоматическим пробоотборником, термостатом колонки и системой градиентного элюирования

Хроматографическая колонка стальная, длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, зернением 5 мкм

Температура колонки: 25 °С

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (50 : 50, по объему)

Скорость потока элюента: 0,8 см³/мин

Объем вводимой пробы: 50 мм³

Линейный диапазон детектирования 2,5—25 нг

1.    Ультрафиолетовый детектор с переменной длиной волны Рабочая длина волн: 268 нм

2.    Флуоресцентный детектор с переменной длиной волны Длина волны: возбуждение 265 нм

эмиссия 312 нм

Пробу вводят в инжектор хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площади пиков вещества (в мЕА • с или ЕЛ • с), находят среднее значение, с помощью градуировочной характеристики определяют концентрацию флудиоксонила в хроматографируемом растворе.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 0,5 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, не более чем в 50 раз.

10. Обработка результатов анализа

Содержание флудиоксонила в пробе (.X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

СУК

-,    где

т

Идентификация с применением 2 альтернативных детекторов повышает надежность определения.

МУК 4.1.3283—15

С - концентрация флудиоксонила, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

V- объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

т - масса анализируемого образца, г;

К - коэффициент, учитывающий объем аликвоты экстракта, используемый для анализа (равен 2).

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми нс превышает предела повторяемости:

(1)

X,, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг; г - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом г = 2,8сг_г. При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

( X ± А) мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

X- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

А - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

SX

100

д - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание флудиоксонила в пробе менее 0,01 мг/кг»*

* -0,01 мг/кг - предел обнаружения.

15

ББК51.23

062

062 Определение остаточных количеств флудиоксоиила в капусте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2016.—18 с.

ISBN 978—5—7508—1458—9

1.    Разработаны ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора (В. Н. Ракитский, Т. В. Юдина,

Н. Е. Федорова, Ж. А. Чистова).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией но государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 мая 2015 г. № 1).

3.    Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Ионовой 8 июля 2015 г.

4.    Введены впервые.

ББК 51.23

ISBN 978—5—7508—1458—9

€> Роспотребнадзор, 2016 © Федеральный центр гигиены и

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2016

МУК 4.1.3283—15

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

8 июля 2015 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств флудиоксонила в капусте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.3283—15

Свидетельство об аттестации № РОСС RU.0001.310430/0220.11.14. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентраций флудиоксонила в капусте в диапазоне 0,01—0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер. Флудиоксоиил

4-(2,2-Дифтор-1,3-бснзодиоксол-4-ил)пиррол-3-карбонитрил (ЮР АС).

Эмпирическая формула: C12H6F2N2O2.

Молекулярная масса: 248,2.

Кристаллическое вещество желтоватого цвета без запаха. Температура плавления: 199,8 °С. Давление паров при 25 °С: 3,9 х 10 ^ мПа. Растворимость в органических растворителях (в г/дм³ при 25 °С): ацетон -190; этанол - 44, толуол - 2,7; н-октанол - 20; гексан - 0,0078. Раство-

римость в воде:    1,8мг/дм³    (25    °С).    Коэффициент    распределения

н-октанол/вода: K_owlogP = 4,12 (25 °С). Гидролитически стабилен до 70 °С в диапазоне pH 5—9.

Область применения препарата

Флудиоксонил - контактный фунгицид широкого спектра действия с продолжительной активностью.

1. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и её составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р - 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Анали зируе мый объект	Диапазон опреде ляемых концен траций, мг/кг	Показа тель точности (границы относи тельной погреш ности, Р = 0,95), ± б, %	Показатель повторяемости (среднеквадратичное отклонение повторяемости), <Тп %	Показатель воспроизводимости (среднеквадратичное отклонение воспроизводимости), Or, %	Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), г,%	Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученных в разных лабораториях), R, % (Р = 0,95)
Капуста	0,01—0,1	50	4,1	5,7	11	16

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (п - 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата

Анализируемый объект	Метрологические параметры, Р = 0,95, п = 20
	предел обнару жения, мг/кг	диапазон определяемых концентраций, мг/кг	полнота извлечения вещества, %	стандартное отклонение, S, %	доверительный интервал среднего результата, ±, %
Капуста	0,01	0,01-0,1	87,4	5,63	1,84

МУК 4.1.3283—15

2. Метод измерений

Метод основан на определении флудиоксонила с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым и/или флуоресцентным детекторами после извлечения вещества из анализируемых образцов смесью ацетонитрил-вода (8 : 2, по объему), очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений Жидкостный хроматограф с быстроскани-рующим ультрафиолетовым и/или флуоресцентным детекторами, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки

Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности ± 0,2 мг Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности ± 0,038 г, класс точности высокий (И)

Колбы мерные вместимостью 2-50-2, 2-100-2,

2-500-2, 2-1000-2 Меры массы

Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см³ Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой вместимостью 10 см³ Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 100,250, 500 и 1 000 см³

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5

3.2. Реактивы

Флудиоксонил, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества 99,8 % Ацетон, осч

Ацетонитрил для хроматографии, хч Вода для лабораторного анализа (деионизованная, бидистилированная) н-Гексан (гексан), для хроматографии Калий марганцовокислый (перманганат калия), хч

Калий углекислый (карбонат калия, поташ), хч, прокаленный

Кальций хлористый (хлорид кальция), хч, насыщенный водный раствор Кислота серная концентрированная, хч Метилен хлористый (дихлорметан), хч Натрий сернокислый (сульфат натрия) безводный, хч

Натрий углекислый (карбонат натрия), хч Натрий хлористый, хч, насыщенный водный раствор

трет-Бутилметиловый эфир, хч Силикагель для колоночной хроматографии (размер частиц 63—200 мкм), нейтральный, активный

Фосфор (V) оксид (фосфорный ангидрид, пентоксид фосфора), хч Этиловый эфир уксусной кислоты (этилаце-тат), хч

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные средства измерений, устройства и материалы Аппарат для встряхивания, орбита до 10 мм    ТУ 64-1-2851—78

Баня ультразвуковая с рабочей частотой 35 кГц Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5—790 мм рт. ст.    ТУ 2504-1799—75

Воронка Бюхнера    ГОСТ 9147-80

Воронка делительная вместимостью 250 и 1000 см³

6

сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, зернением 5 мкм Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50—100 мм³

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1.    При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007—76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками но ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2.    Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009- 83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313 -03 и ГН 2.2.5.2308- -07. Организация обучения работников безопасности труда -но ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускают специалиста, прошедшего обучение, освоившего методику, владеющего техникой, имеющего опыт работы на жидкостном хроматографе, и подтвердившего соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

•    процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

•    выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, раствора внесения, подвижной фазы для

МУК 4.1.3283—15

ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик, приготовление смесей растворителей для очистки экстрактов на колонке, подготовка колонки с силикагелем, проверка хроматографического поведения флудиоксонила на ней.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1. Ацетон

Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия и прокаленным карбонатом калия или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30. Хранят в темноте (в емкости из темного стекла) не более месяца.

7.1.2. Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.1.3. н-Гексан

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия. Хранят в темноте (в емкости из темного стекла) не более месяца.

7.1.4. Хлористый метилен и этилацетат

7.1.4.1.    Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5 %>. Навеску (25 ± 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 см³, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают.

7.1.4.2.    Очистка растворителей. Растворитель промывают последовательно 5 %-м водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колоше с числом теоретических тарелок не менее 30. Хранят в темноте (в емкости из темного стекла) не более месяца.

7.2. Подготовка подвижной фат для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ ацетонитрила, вносят 500 см³ бидистиллированной воды, перемешивают,

9