Федеральная служба по напору в сфере защиты прав потребите, и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств карбокеина в терне кукурузы, сои и растительном масле методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.3054—13

ББК 51.23 060

060 Определение остаточных количеств карбоксина в зерне кукурузы, сои и растительном масле методом высокоэффективной жидкостной хроматографии: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. 2013.—15 с.

1.    Разработаны сотрудниками ГНУ 13ссроссийский НИИ защиты растений Росссльхозакадсмии (И. А. Цибульская. А. С. Комарова. Т. Д. Чер-менская. В. В. Человечкова).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. № I).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 5 июля 2013 г.

4.    Введены впервые.

ББК 51.23

< Роспотребнадзор, 2013 © Федеральный центр гигиены н

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2013

МУК 4.1.3054—13

ста и измельчают. Пробы растительного масла хранят в холодильнике при 0—I °С в закрытой стеклянной rape не более 2 месяцев.

9. Проведение определения

9.1. Экстракция карбоксина

9.1.1.    Экстракция карбоксина из зерна кукурузы и сои

Навеску измельченного зерна (Юг) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³ и добавляют 30 см³ ацетонитрила, насыщенного гексаном. Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 10 мин и центрифугируют при скорости 4 ООО об./мин в течение 10 мин. Верхний ацетонитрильный слой декантируют, фильтруют через бумажный фильтр в делительную воронку. К остатку в пробирке добавляют 20 см³ ацетонитрила. насыщенного гексаном, и проводят повторную экстракцию. Объединенные ацетонитрильные экстракты очищают по п. 9.2.

9.1.2.    Экстракция карбоксина из растительного масла

Навеску масла (5 г) растворяют в 50 см³ гексана, помещают в делительную воронку, добавляют 20 см³ ацетонитрила, насыщенного гексаном. и интенсивно встряхивают в течение 2—3 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой отбирают, к гексановом) слою добавляют 20 см³ насыщенного ацетонитрила и экстракцию повторяют. Объединенные ацетонитрильные экстракты очищают по п. 9.2.

9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе неси сшивающихся растворителей

К ацетонитрильном)' экстракту, полученному по п. 9.1 и помещенному в делительную воронку на 250 см³. добавляют 10 см³ гексана и интенсивно встряхивают в течение 2—3 мин. После полного разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и повторяют операцию очистки с новой порцией гексана объемом 10 см³.

Затем ацетонитрильный экстракт переносят в колбу для упаривания на ИХ) см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе.

Внимание! Температу ра бани не должна превышать 30 °С. экстракты следует упаривать осторожно, так как вещество достаточно высоколетучее.

Дальнейшую очистку сухого остатка проводят на патронах для твердофазной экстракции по п. 9.3.

11

9.3. Очистка жстракта на патронах для твердофазной жстракции Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов по п. 9.2. растворяют в 1 см³ гексана и переносят на подготовленный патрон (п. 7.5). Колбу обмывают 1 см³ гексана и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 10 см³ гексана. 2 см³ хлористого метилена, элюаты отбрасывают. Карбоксин элюируют 3 см³ смеси № 1. Элюат количественно переносят в круглодонную колбу вместимостью 10 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани нс выше 30 °С.

Внимание! Температу ра бани нс должна превышать 30 °С. экстракты следует упаривать осторожно, так как вещество лету чес.

Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фаты (смесь ацетонитрила и 0.005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 30 : 70) и анализируют на содержание карбоксина по п. 9.4.

9.4. Условия хроматографирования Ультраэффсктивный жидкостный хроматограф с быстросканирую-щнм ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка (2.1 х 100) мм. 1,7 мкм. заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18. Температура колонки (30±1)°С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0.005 М ортофос-<|юрной кислоты в соотношении 30:70. Скорость потока элюента 0.2 см /мин. Рабочая длина волны ультрафиолетового детектора 250 нм. Объем вводимой пробы 10 мм³.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание карбоксина в пробе (X. мг/кг) вычисляют по формуле:

_v S-K-V 100

X - ----.где

Р /

S_x - площадь пика карбоксина на хроматограмме испытуемого образца, мм² (AU):

К - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости:

V — объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа. см³:

Р - навеска анализируемого образца, г.

МУК 4.1.3054—13

/- полнота извлечения карбоксина. приведенная в табл. 2. %. Содержание остаточных количеств карбоксина в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор карбоксина с концентрацией 1'Омкг/см³. разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми нс превышает предела повторяемости (1):

X_hX₂ - результаты параллельных определений, мг/кг; г - значение предела повторяемости (г = 2.8<т_г).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

О- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг:

Л - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

8-д

Д =-.    где

100

<5 - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций). %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,01 мг/кг*. где * - 0.01 мг/кг - предел обнаружения карбоксина в зерне).

13

МУК 4.1.3054—13

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерении осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1.    Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2.    Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки Са должна удовлетворять условию:

-Ч, = 0,0 + D, _лг где

± Д₇д- (± Д_7Х) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг: при этом:

Д_л = ± 0.84 Д. где

Д - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

S-6

100

3 - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций). %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

К_к =Х'-Х-С_д, где

A'', X, С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испыту емом образце, концентрация добавки. соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Ё=^о\~Г6~₀

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

' (2) процедуру анализа признают удовлетворительной.

МУК 4.1.3054—13

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

15

МУК 4.1.3054—13

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в с(|>ерс защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

5 июля 2013 г.

Дата введения: с момента утверждения

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств карбоксина в зерне кукурузы, сои и растительном масле методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.3054—13

Свидетельство о метрологической аттестации №01.5.04.128/ 01.00043/2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэф(|юктивной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации карбоксина в зерне кукурузы, зерне сои и растительном масле в диапазоне концентраций 0.01— 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Карбоксин

5.6- дигндро-2-метил-1.4-оксатиин-З-карбоксанилид (IUPAC)

5.6- дигидро-2-мстил-Ь1-фснил-1,4-оксатиин-З-карбоксамид (С. А.)

Ci:H₁₃NO:S.

Мол. масса 235.3.

3

Белый кристаллический порошок бел запаха.

Температура плавления: 91,5—92.5 °С и 98—100 °С (в зависимости от типа кристаллов).

Давление паров при 25 °С: 2.5 * 10 ² мПа.

Коэффициент распределения н-октанол-вода:    IogP    =    2.2 (20 °С).

Растворимость (в г/дм³ при 20 °С): вода - 0.134. метанол - 89. ацетон - 220. этилацетат -111. дихлорметан - 353.

Вещество устойчиво к гидролизу (25 °С. pH 5—9). быстро разлагается в водных растворах при выдерживании на свету (pH 9. DT*, < 3 ч).

Краткая токсикологическая характеристика: острая пероральная токсичность LD*, для крыс - 2 588 мг/кг. острая дермальная токсичность LD*, для кроликов > 4 000 мг/кг.

Мутагенный э(|н|)скт при использовании препарата нс наблюдался. Класс токсичности по ВОЗ - III.

Область применения препарата, карбоксин - фунгицид системного действия, используется хтя обработки семян зерновых культур против головневых болезней, корневых гнилей и плесневсния семян. Не применяется совместно с пестицидами, имеющими в молекуле длинные углеводородные цепи или обладающими кислой реакцией.

Гигиенические нормативы для карбокенна в России: ОДУ в воде водоемов 0.02 мг/дм³; ОДК в почве 0.05 мг/кг: МДУ: кукуруза (зерно), просо. зерно хлебных злаков. карто(|юль - 0.2 мг/кг. кукуруза (масло) - нт.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0.95 нс превышает значений, приведенных в табл. 1. для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Объект анализа Диапазон определя емых концен траций, мг/кг 1Указатель повторяемости (он гасительное сред-иеквадратическое отклонение повторяемости), о„ % I Указатель внутрила-бора горной прецизионности, Gr.i.% 1 Указатель воспроизводимости. Or, % I Указатель точности** Ораиицы относительной ГЮ-1 рсшности'). ±6, % Зерно кукурузы 0.01—0,1 6 8 11 22 Зерно сои 0,01—0,1 6 8 11 22 Масло 0,01-0.1 6 7 10 20

Таблица 2 Полнота извлечения карбоксина, стандартное отклонение, доверительный интервал среднею результата дли и = 20, Р= 0.95

Анализи руемый объект Предел обнару жения, мг/кг Диапазон определяемых концен-траций, мг/кг 11олно га извлечения, % Стандартное отклонение, S, % Доверительный интервал среднего резхлыата, ±% Зерно кукурузы 0,01 0,01—0,1 87,9 0,96 0,48 Зерно сои 0,01 0,01—0,1 83,6 5,20 2,60 Масло 0,01 0,01—0,1 83,2 1,11 0,55

2. Метод измерений

Методика основана на определении карбоксина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его извлечения из образцов ацетонитрилом. очистки экстракта промывкой гексаном и последующей очистки на патронах хля твердофазной экстракции.

Идентификация карбокенна проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства и змерений Жидкостный хроматограф с быстросканиру-ющим ультрафиолетовым детектором, снабженным дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки Весы аналитические с пределом взвешивания до 210 г и пределом допустимой погрешности 0.2 мг Весы технические с пределом взвешивания до 400 г и допустимой погрешностью 0.1 г Колбы мерные на 10. 100 и 1 000 см³ Микродозаторы одноканальные переменного объема от 200 до 1 000 мм³ и от 1 до 5 см³ Цилиндры мерные на 50 и 100 см³

МУК 4.1.3054—13

Примечание: Допускается исполь зование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Карбоксин. аналитический стандарт. 99.2 %. Ацетон, осч Ацетонитрил, хч

Вода для лабораторного анализа (бидистилли рованная. деионизованная) н-Гсксан. хч

Кислота орто(|юс(|юрная (Н3РО4), хч Метилен хлористый, хч Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,005 М Н3РО4 в соотношении 30 : 70. Смесь № 1: хлористый метилен-ацетон в соотношении 9 : 1 по объему.

Примечание: Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18. (100 х 2.1) мм. 1.7 мкм Аппарат хзя встряхивания проб Воронки делительные, вместимостью 250 см³ Воронки химические конусные Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10 и 100 см³

Колбы плоскодонные конические вместимостью 100 см³

Патроны для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля. 0.4 г Пробирки полипропиленовые центрифужные с крышками объемом 50 см³ Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар

Фильтры бумажные средней плотности

6

МУК 4.1.3054—13

Центрифуга с максимальной рабочей частотой вращения 4 ООО об./мин.

Примечание: Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования бешпасности

4.1.    При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007—76. требования по элсктробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2.    Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточновытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГЫ 2.2.5.1313—03 и 2.2.5.2308—07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэф(|>ск-тивной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

•    процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

•    выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору .

7

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0.1—0.2 см/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Приготовление растворов

7.2.1.    0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: в мерную колбу объемом 1дм³ помещают (0,5 ±0.01) г 98% ортофосфорной кислоты, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.2.    Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0.005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 30 : 70 по объёму, используя мерные цилиндры.

7.2.3.    Дня приготовления ацетонитрила, насыщенного гексаном, в делительной воронке смешивают ацетонитрил и гексан в соотношении 5:1. встряхивают в течение 2 мин. после разделения слоев нижний ацетонитрильный слой готов к использованию.

7.3. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.3.1.    Основной раствор с концентрацией 0,5мг/см³: точную навеску карбоксина (50 ± 0.5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Градуировочные растворы с концентрациями карбоксина 0.05, 0.1. 0.2. 0.5. 1.0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0.005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 30 : 70).

7.3.2.    Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³ \ в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0.2 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.3.3.    Раствор №2 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помешают 5.0 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4.    Раствор ЛЬ 3 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5.    Раствор ЛЬ 4 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

МУК 4.1.3054—13

7.3.6. Раствор ЛЬ 5 с концентрацией 0,05 мкг/см³. в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0.5 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0—4 °С в течение 3 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения карбоксина в зерне кукурузы, семенах сои и растительном масле используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация карбоксина в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (нс менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации карбоксина в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

С = KS. где

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0.99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

IС-СЛ

где

С - аттестованное значение массовой концентрации карбоксина в градуировочном растворе:

С_к - результат контрольного измерения массовой концентрации карбоксина в градуировочном растворе.

А_Контр. - норматив контроля градуировочного коэффициента. %. {/■контр. = 10 % при Р = 0.95).

9

7.5. Подготовка патрона для очистки экстрактов

Патроны для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля, промывают последовательно 3 см³ смеси № 1 и 3 см³ гексана, после чего патрон готов к работе.

7.6. Проверка хроматографического поведения карбоксипа

на патроне

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора карбоксина с концентрацией 1 мкг/см³. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 2 см³ гексана и переносят на подготовленный патрон. Колбу обмывают 2 см³ гексана и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 10 см³ гексана и 2 см³ хлористого метилена, элюаты отбрасывают. Затем элюируют карбоксин смесью № 1 со скоростью 1—2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы (ацетонитрил - 0.005М Н3РО4,30 : 70) и анализируют по п. 9.4.

Фракции, содержащие карбоксин. объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюатс. определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Внимание! Температу ра бани нс должна превышать 30 °С. экстракты следует упаривать осторожно, так как вещество достаточно высоколетучее.

Примечание: 11роверку хроматографического поведения карбоксина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколи-чсств пестицидов» (от 21.08.79 №2051—79). а также отбор проб зерна кукурузы производится по ГОСТ 13634-90 «Кукуруза. Требования при заготовке и поставках», зерна сои - по ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб». Пробы зерна для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре.

Для длительного хранения зерно подсу шивают при комнатной температуре в отсутствие света. Сухие образцы могу т храниться в течение года. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажно-