Федеральная служба по напору в сфере защтм нрав потребителей и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств флуксапнроксада в зеленой массе и клубнях картофеля, яблоках, яблочном соке, винограде и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.3051—13

ББК 51.23 060

060 Определение остаточных количеств флуксапироксада в зеленой массе и клубнях картофеля, яблоках, яблочном соке, винограде и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. 2013.—15 с.

1.    Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийский НИИ защиты рас-гений Россельхозакадсмии (В. И. Должен ко, И. Л. Цибульская. Т. Д. Чер-менская. Л. С. Комарова. В. В. Человечкова).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарноэпидемиологическому нормированию при Федеральной службе но надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 года № 1).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 5 июля 2013 г.

4.    Введены впервые.

ББК 5L23

< Роспотребнадзор, 2013 С Федеральный центр гигпены н

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2013

МУК 4.1.3051—13

носят на подготовленный патрон. Колбу обмывают 1 см³ гексана и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 6 см³ смеси № 1. элюат отбрасывают. Затем элюируют флуксапироксад смесью № 2 со скоростью 1—2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха. растворяют в 1 см³ подвижной фазы (ацетонитрил-0.005М H^PO.j. 40 : 60) и анализируют по п. 9.4.

Фракции, содержащие флуксапироксад. объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюатс. определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматснрафического поведения ф.туксанироксада следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой парши патронов и растворителей.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды хтя определения мнкроколи-чсств пестицидов» (от 21.08.79 №2051—79). а также отбор проб винограда производят в соответствии с ГОСТ 25896-83 «Виноград свежий столовый. Технические условия». Пробы ягод винограда хранят до анализа в герметично закрытом двойном полиэтиленовом пакете в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение 6 месяцев. Отбор проб яблок производят в соответствии с ГОСТ 27572-87 «Яблоки свежие для промышленной переработки». Пробы виноградного и яблочного сока хранят до анализа в морозильной камере при температуре нс выше -18 °С в течение месяца, в холодильнике при температуре 0—1 °С в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.

Отбор проб картофеля производится в соответствии с ГОСТ 26832-86 «Картофель свежий для переработки на продукты питания». Пробы клубней и ботвы картофеля для определения остатков в урожае хранят в морозильной камере при -18 °С.

9. Проведение определения

9.1. Экстракция флуксапироксада из зеленой массы и шуб ней картофеля, яблок и винограда

Навеску измельченной культу ры (10 г - зеленая масса. 20 г - клубни картофеля, яблоки, виноград) помещают в коническую колбу вместимостью 100 см³, добавляют 40 см³ смеси № 3 и колбу помещают в ультразвуковую ванну на 10 мин. Водно-ацетоновый экстракт дсканти-

11

МУК 4.1.3051—13

руют в круглодонную колбу вместимостью 100 см³, пропуская через бумажный фильтр к остатку в колбе добавляют 30 см³ смеси № 3 и повторяют экстракцию. Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка, доводят объем до 100 см³ 20 %-м водным раствором хлорида натрия и переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³, добавляют 30 см³ хлористого метилена и интенсивно встряхивают 2—3 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 см³ хлористого метилена и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции дважды промывают в делительной воронке 20 см³ 0.0025 М раствора гидроксида натрия, пропускают через воронку. содержащую безводный сульфат натрия, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см⁵ и растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани нс выше 40 °С. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.3.

9.2. Экстракция флуксапироксада из яблочного и виноградного соков

Навеску 10 г сока помещают в стакан вместимостью 150 см³, доводят объем до 100 см³ 20 %-м водным раствором хлорида натрия и переносят в делительную воронку вместимостью 250 см . добавляют 30 см³ хлористого метилена и интенсивно встряхивают 2—3 мин. После полного разделения фаз. нижний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 см³ хлористого метилена и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции промывают в делительной воронке два раза по 20 см³ 0.0025 М раствора гидроксида натрия, пропускают через воронку, содержащую безводный сульфат натрия, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см³ и растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани нс выше 40 °С. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.3.

9.3. Очистка на патроне для твердофазной жстракции

Сухой остаток, полученный по пп. 9.1 или 9.2, растворяют в 1 см³ гексана, наносят на предварительно кондиционированный патрон, колбу ополаскивают 1 см³ гексана и так же наносят на патрон. Патрон промывают 6 см³ смеси № 1. элюат отбрасывают. Флуксапироксад элюируют 5 см³ смеси № 2. элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в 1 см подвижной фазы и 10 мм³ вводят в хроматограф.

МУК 4.1.3051—13

г - значение предела повторяемости (г = 2.8а_г).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

( О ± Д) мг/кг при вероятности Р = 0.95. где

О- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг:

Д - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

S - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций). %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее нижней границы определения» (например: менее 0.005 мг/кг*. где * - 0.005 мг/кг - предел обнаружения флуксапироксада в клубнях картофеля).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

1.3.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки Q должна удовлетворять условию:

Я =    +    ^D,.ar    га

± Д_лд- (± A_vV) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг. при этом:

А, = ± 0.84 Д. где

Д - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

14

МУК 4.1.3051—13

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзор) в с(|)срс защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный гос> дарственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

5 июля 2013 г.

Дата введения: с момента утверждения

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств флуксапироксада в зеленой массе и клубнях картофеля, яблоках, яблочном соке, винограде и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.3051—13

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.127/01.00043/2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации флуксапироксада в клубнях картофеля. яблоках, винограде, яблочном и виноградном соках в диапазоне концентраций 0.005—0.050 мг/кг. в зеленой массе - в диапазоне концентраций 0.01—0.10 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: флуксапироксад.

Название действующего вещества по ИЮПАК: (±)3-(дифтормс-тил)-1-метил-Ы(3\4\5'-трифтор( 1. Г-бифенил|-2-ил)-1 Н-лиразол-4-карбо-ксамид.

3

МУК 4.1.3051—13

Структурная формула:

Эмпирическая формула: CixH^FsN^O.

Молекулярная масса: 381.

Химически чистое вещество представляет собой кристаллический порошок бежевого цвета без запаха.

Температу ра плавления: > 157 °С.

Давление пара 1.1 • К) мРа.

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода lgP > 3.0 (20 °С).

Растворимость в воде (мг/дм³, 20 °С): 3.88.

Растворимость в органических растворителях (г/дм³. 20 °С): ацетон > 250: ацетонитрил, дихлормстан. этилацетат > 100. метанол - 53.4. толуол - 20.0.

Гидролитичсски стабилен в водных растворах при pH 4—9.

Кроткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная - ЛД_Ч1 > 2 000 мг/кг массы тела. Острая кожная - ЛДчо > 2 000 мг/кг массы тела. Острая ингаляционная - ЛЮ*, (4 ч) >5.1 мг/л Раздражающее действие - кролики: кожа - нс раздражает: глаза - нс раздражает.

Сенсибилизация - не обладает.

Область применения: фунгицид для обработки вегетирующих растений против комплекса болезней зерновых культур.

В России для флуксапироксада гигиенические нормативы нс установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности

МУК 4.1.3051—13

Р = 0.95 нс превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Объект анализа Диапазон определяемых кон-цен зраций, мг/кг (мг/дм3) I Указатель повторяемости (от-носительное среда 1еквадрати-ческое отклонение повторяемости), аГУ % Показатель внутрила-бора горной прецизионности, <Jr„ % Пока затель воспро изводи мости. Or, % I Указатель точности* (фанши>1 ошоситель-ной погрешности), ±6У % Зеленая масса 0,01—0,1 6 7 10 20 Клубни картофеля 0,005—0,05 7 9 12 23 Яблоки 0,005—0,05 7 9 12 23 Яблочный сок 0,005—0,05 6 7 10 20 Виноград 0,005—0,05 7 9 12 23 Виноград-ный сок 0,005—0,05 6 7 10 20 * Соответствует расширенной неопределенности £/<*** при коэффициенте охвата А-=2

Полнота извлечении флуксаиироксада, стандартное отклонение, доверительный интервал среднею результата для л = 20, Р= 0,95

Таблица 2

Анализируе мый объект 11редел обнаружения, мг/кг (мг/дм3) Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (мг/дм3) 11олната извлечения, % Стандартное отклонение, S Доверительный интервал среднего результата. ±% Зеленая масса 0,01 0,01—0,1 91,0 0,89 0,45 Клубни картофеля 0,005 0,005—0,05 86,1 2,71 1,36 Яблоки 0,005 0,005—0,05 90,9 2,95 1,48 Яблочный сок 0,005 0,005—0,05 95,5 3,55 1,78 Виноград 0,005 0,005—0,05 96,2 2,97 1,49 Виноградный сок 0,005 0,005—0,05 94,4 3,32 1,66

2. Метод измерений

Методика основана на определении флуксапироксада методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью, очистки перераспределением в системе нссмс-шивающихся растворителей и последующей очистки на патроне с гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля.

Идентификация флуксапироксада проводится по времени удерживания. количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства и змерении Жидкостный хроматограф с быстросканиру-ющим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки Весы аналитические с пределом взвешивания до 210 г и пределом допустимой погрешности 0.2 мг ГОСТ 24104-01 Весы технические с пределом взвешивания до 400 г и допустимой погрешностью 0.1 г    ГОСТ 24104-01

Колбы мерные на 10. 100 и 1 000 см³    ГОСТ 23932-90

Микродозаторы одноканальные переменного объема от 200 до 1 000 мм³ и от 1 до 5 см³ Цилиндры мерные на 50 и 100 см³    ГОСТ 23932-90

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характерис тиками.

3.2. Реактивы

Ацетон, осч Ацетонитрил, хч

Вода для лабораторного анализа (бидистилли рованная. деионизованная) н-Гсксан. хч

Кислота орто(|юс(|юрная (Н3РО4), хч Метилен хлористый, хч Натрия гидроксид, хч

6

МУК 4.1.3051—13

Натрий серно-кислый безводный, хч    ГОСТ 4166-76

Натрия хлористый, чистый для анализа    ГОСТ 4233-77

Смесь № 1: этилацстат-гсксан в соотношении 1 : 4 по объему

Смесь № 2: этилацстат-гсксан в соотношении 1 : 1 по объему

Смесь № 3: ацетон-вода в соотношении 3 : 1 по объему

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0.005 М Н₃Р0₄ в соотношении 40 : 60 Флуксапироксад с содержанием основного вещества 99.7 %

Этилацетат. хч    ГОСТ    1138—84

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и матери алы

Аналитическая колонка заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18. (100 х 2.1) мм. 1.7 мкм Воронки лабораторные В-75-110 Воронки делительные вместимостью 250 см³ Колбы круглодонные на шлифе вместимостью И), 100 см³

Колбы плоскодонные конические вместимостью 100 см³

Патроны для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля. 0.4 г Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар

Стаканы химические вместимостью 150 см³ Ультразвуковая ванна с рабочей частотой 35 кГц Фильтры бумажные средней плотности

Примечание. Допускается применение оборудования с аналошчными или лучшими техническими характеристика ми.

7

МУК 4.1.3051—13

4. Требования безопасности

4.1.    При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007—76. требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2.    Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточновытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе нс должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313—03 и 2.2.5.2308—07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэф<|>ск-тивной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методик) и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

•    процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %:

•    выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.7. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0.1—0.2 см/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Кондиционирование патрона для твердофатои экстракции

Патрон с гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля промывают 2 см³ смеси № 2. затем 3 см³ гексана.

МУК 4.1.3051—13

7.3. Приготовление растворов

7.3.1.    0,005 Л/ раствор ортофосфорной кислоты: в мерную колбу объемом 1 дм³ помсищют (0,5 ± 0,01) г 98 %-й орто(|юс<|юрной кислоты, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2.    Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0.005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 40 : 60 по объёму, используя мерные цилиндры.

7.3.3.    20 %-й раствор хлорида натрия: в мерную колбу объемом 1 дм³ помешают 200 г хлорида натрия, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.4.    0,0025 Л/ раствор гидроксида натрия: в мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 1.0 г гидроксида натрия, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.4. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.4.1.    Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³\ томную навеску флуксапироксада (50 ± 0.5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2.    Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями флуксапироксада

0.05; 0.1; 0.2; 0.5 и 1.0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0.005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 40 : 60).

7.4.2.1.    Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/см: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0.2 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.2.    Раствор ЛЬ 2 с концентрацией 0,5 мкгем³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5.0 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.3.    Раствор ЛЬ 3 с концентрацией 0,2мкг ем³. в мерную колбу вместимостью К) см³ помещают 2 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.4.    Раствор ЛЬ 4 с концентрацией 0,1 мкг ем³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 ем³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5.    Раствор ЛЬ 5 с концентрацией 0,05 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0—1 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

9

При изучении полноты определения флуксапироксада в клубнях и зеленой массе картофеля, яблоках, яблочном соке, винограде и виноградном соке используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.5. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика -концентрация флуксапироксада в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (нс менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, нс менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации флуксапироксада в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

С = KS. где

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается нс ниже 0.99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

I С-С_к\

С - аттестованное значение массовой концентрации флу ксапироксада в градуировочном растворе.

С_к - результат контрольного измерения массовой концентрации флуксапироксада в градуировочном растворе:

Контр. - норматив контроля граду ировочного коэффициента. % (Л»*т,.= 10 % при Р = 0.95).

7.6. Проверка хроматографического поведении флуксапироксада на патроне

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора флуксапироксада с концентрацией 1 мкг/см³. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см³ гексана и перс-