Федеральная сдужба по напору в сфере защиты прав потреби!еден и бдаюнодумпи человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств пропиконазола в ягодах винограда и виноградном соке, зеленой массе, семенах и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2592—10

ББК51.23

060

060 Определение остаточных количеств пропиконазола в ягодах винограда и виноградном соке, зеленой массе, семенах и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии:    Методические указания.—М.:    Федеральный

центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. 2010.—14 с.

1.    Разработаны Всероссийский НИИ защиты растений (В. И. До.тженко. И. Л. Цибульская. И. К. Журкович, Н. В. Луюккина.

И. Г. Ковров).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиш прав по1рсбитслей и благополучия человека (протокол от 03.12.2009 № 3).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 26 марта 2010 г.

4.    Введены в действие с 26 марта 2010 г.

5.    Введены впервые.

ББК 51.23

<    Роспотребнадзор, 2010

<    Федеральный петр гигиены и эпидемии ни ни Роспотребнадзора, 2010

МУК 4.1.2592—10

2.6.3. Очистка на концентрирующем патроне, заполненном Силикагелем 60 (0,5 г)

Сухой остаток, полученный по п. 2.6.2. растворяют в 2.5 см³ гексана и количественно вносят в подготовленный по п. 2.5.6.2 концентрирующий патрон, заполненный силикагелем 60. Патрон промывают 5 см³ гексана и для проб масла дополнительно 5 см³ хлористого метилена. Фильтрат и промывки отбрасывают. Пропиконазол элюируют 5 см³ смеси гексан-ацетон (80 : 20). Полученный раствор упаривают на ротационном испарителе (40 °С). сухие остатки семян и зеленой массы растворяют в 2 см³, а масла - в 1 см³ подвижной фазы и 10 мм³ образца вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.4. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы Waters с быстросканирующим УФ-дстсктором. снабженный дегазатором. автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Для анализа проб ягод и сока винограда, зеленой массы и семян рапса используют колонку 1.

Температу ра колонки (30 ± 1) °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0.005 М ортофосфорная кислота в соотношении 55 :45.

Скорость потока элюента: 0.2 см³/мин.

Рабочая длина волны 220 нм.

Объем вводимой пробы 10 мм³.

Время удерживания пропиконазола (5,15 ±0,05) мин (изомер 1) и (5,30 ± 0.05) мин (изомер 2).

Пробы, полученные из масла рапса, анализируют на колонке 2.

Температу ра колонки (30 ± 1) °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0.005 М орто<|юс(|юрн;1я кислота в соотношении 45 : 55.

Скорость потока элюента: 0.8 см³/мин.

Рабочая длина волны 220 нм.

Объем вводимой пробы 10 мм³.

Время удерживания совоку пного пика пропиконазола (5.1 ±0.1) мин.

3. Обработка результатов анализа

Содержание пропиконазола в образцах ягод винограда и виноградном соке, зеленой массе, семенах и масле рапса (А', мг/кг) вычисляют по формуле:

11

S₂C Л S_rp ’

S/ - площадь пика пропиконаюла в стандартном растворе. (мВ • с): S₂ - площадь пика пропикона юла в анализируемой пробе. (мВ с); V — объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г;

С - концентрация стандартного раствора пропикона юла. мкг/см³. Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор пропиконаюла 1 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

4. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми нс превышает придела повторяемости (1):

Л'/, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг; г - значение предела повторяемости (г = 2.8 <т_г).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

5. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(X± А) мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

X- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

А - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

Д = <5-Х/100.

3 - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапа юном концентраций). %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

МУК 4.1.2592—10

«содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0.01 мг/кг*. где * - 0.01 мг/кг - предел обнаружения).

6. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

6.1.    Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

6.2.    Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

Q = Д_лд + Алд-. где

± Д_лд (± А_лд ) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг: при этом:

Д_л = ± 0.84 • А. где

А - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

А = S -X/100.

S - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций). %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

К_к = X - X - С_д. где

A\ X, С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (/Q с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

13

МУК 4.1.2592—10

\К_к\<К    (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

6.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X_h Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг:

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций). %.

7. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности. установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

8. Требования к квалификации оператора

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа. освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых резу льтатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 6.

14

МУК 4.1.2592—10

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в с(|>срс защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

26 марта 2010 г.

Дата введения: 26 марта 2010 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств пропиконазола в ягодах винограда и виноградном соке, зеленой массе, семенах и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2592—10

1. Вводная часть

У. У. Краткая характеристика препарата

Действующее вещество: пропиконазол (смесь диастереомсров). Название действующего вещества по номенклатуре ИЮПАК: (±)-1-|2-(2.4-ди.\лоро(|)снил)-4-пропил-1.3-диоксалан-2-улметил|-1Я-1.2.4-триазол.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C15H17CI2N3O:

3

Молекулярная масса: 342.2.

Химически чистое вещество: вязкая желтоватая жидкость без запаха. Температура плавления: -23 °С.

Давление пара при 20 °С: 0.027 мПа. KowlogP = 3,72 (pH 6,6. 25 °С). Растворимость в воде (20 °С) - 100 мг/дм³. В н-гексане - 47. в ацетонитриле - 168 г/дм³. Растворим в этаноле, ацетоне, толуоле, хлористом метилене (25 °С). этилацстатс (25 °С) и н-октанолс. Стабилен до 320 °С без значительного гидролиза. Слабое основание. рК., 1.09.

1.2. Краткая токсикологическая характеристика ЛД50 для крыс 1517. мышей 1490 мг/кг (орально). При подкожном введении ЛДзддерм для крыс > 4 ООО. ятя кроликов > 6 ООО мг/кг.

ЛК50 (96 ч): ятя карпа 6.8. ушастого окуня 6,4. радужной <|юрсли 4,3—5,3 мг/дм³. Нс раздражает глаза и кожу кроликов.

1.3. Область применения препарата Системный фунгицид широкого спектра действия

2. Методика определения пропиконазола в ягодах винограда и виноградном соке, зеленой массе, семенах и масле рапса

методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.1.1. Область применения и принцип метода Настоящий документ устанавливает методик) определения остаточных количеств пропиконазола в ягодах винограда и виноградном соке в диапазоне концентраций 0.01—0.1 мг/кг. зеленой массе, семенах и масле рапса в диапазоне концентраций 0.025—0.250 мг/кг.

Методика основана на определении пропиконазола методом ВЭЖХ с использованием УФ-дстсктора после его извлечения из образцов водно-ацетонитрильной смесью или ацетонитрилом с последующей очисткой жидкостной экстракцией и на концентрирующих патронах.

2.1.2. Метрологические характеристики При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0.95 нс превышает значений, приведенных в табл. 1. ятя соответствующих диапазонов концентраций.

МУК 4.1.2592—10 Таблица 1

Метрологические параметры

Объект анализа Диапазон определяемых концентраций, мг/кг 1 Указатель точности (граница относительной погрешности), ±б,% Стандартное отклонение повторяемости, ог, % Предел повторяе мости, г,% Предел воспроиз водимо сти, R, % Ягоды ви-нограда 0,01—0,05 50 5,6 15,7 24,3 0,05—0,1 50 5 Л 14,6 22,6 Сок вино-1 рада 0,01—0,05 50 5,5 15,4 23,9 0,05—0,1 50 5,1 14,3 22,2 Зеленая масса рапса 0,025—0,1 50 5,3 14,8 22,9 0,1—0,25 25 5,2 14,6 22,6 Семена рапса 0,025—0,1 50 4,2 11,8 12,9 0,1—0,25 25 4,6 12,9 15,5 Масло рапса 0,025—0,1 50 3,6 10,1 12,1 0,1—0,25 25 3,8 10,6 12,7

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентрации (п = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Полнота извлечении нрониконазола, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для п = 20, Р= 0,95

Анализируе-мый объект 11 редел обнаружения, мг/кг Диапазон определяемых концен-траций, мг/кг Сре;щее значение определе ния, % Стандартное откло-ненис. S, % Доверительный интервал среднею 1>ез\.1ыата. ±% Ягоды вино-града 0,01 0,01—0,1 94,10 4,6 4,2 Сок виноipaда 0,01 0,01—0,1 91,90 4,8 4,4 Зеленая масса рапса 0,025 0,025—0,25 98,75 4,4 4,0 Семена рапса 0,025 0,025—0,25 91,25 5,2 4,7 Масло рапса 0,025 0,025—0,25 95,70 4,3 3,9

2.1.3. Избирательность метода Избирательность метода определения пропиконазола достигается условиями подготовки проб и хроматографического анализа.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, осч

Ацетонитрил для ВЭЖХ. «В-200нм». сорт 5 или хч Бумажные фильтры «красная лента»

Вода бидистиллиро ванная, деионизированная Пропикона юл смесь стереоизомеров, аналитический стандарт с содержанием д.в.

98.6 % (HPLC)

Кислота орто(|юс(|юрная. хч. 0.005 М водный раствор

н-Гсксан. хч. свсжспсрсгнанный Метилен хлористый, хч

Подвижная фаза для ВЭЖХ: 1 - смесь ацетонитрила и 0.005 М Н3РО4 в соотношении 55 : 45; 2 -смесь ацетонитрила и 0.005 М Н_яРО., в соотношении 45 : 55.

Концентрирующие патроны, заполненные силикагелем 60 (0.040—0,063 mm). Merck Концентрирующие патроны Диапак С16 (0.4 г). БиоХимМак

2.3. Приборы и посуда Жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы «Waters» с быстросканирующим УФ-дстсктором. снабженным дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или «Вгее/е» фирмы «Waters» или аналогичный Аналитические колонки ACQUITY UPLC ВЕН С18 (100 х 2.1) мм. 1.7 мкм (Waters) (колонка 1) и Spherisorb Phenyl (4.6 х 150) мм. 3 мкм (Waters) (колонка 2)

Баня ультразвуковая «Серьга»    ТУ    3.836.008

или аналогичная

Весы аналитические ВЛ А-200    ГОСТ 24104-2001

или аналогичные Воронка Бюхнера

6

МУК 4.1.2592—10

Мельница ножевая РМ-120 и лабораторная зерновая ЛМЗ Насос водоструйный.

Центрифуга ОПн-8УХЛ4.2 Бидистиллятор

Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами)

Шприц медицинский с разъемом Льюера РН-мстр универсальный ЭВ-74 Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 ^/₃₂ ТС Колбы круглодонные на шлифах КШ50 ^y>/_i2 ТС Воронки лабораторные В-75-110 Цилиндры мерные на 100. 250 и 1 000 см³ Колбы мерные на 25. 50. 100 и 1 000 см³ Пипетки на 1. 2. 5. 10 см³ Микродозаторы Ленпипет переменного объема от 200 до 1 000 мм³ и от 1 до 5 см³

2.4. Отбор и хранение проб

Отбор проб винограда производится в соответствии с ГОСТ 25896-83 «Виноград свежий столовый. Технические условия». Пробы ягод винограда хранят до анализа в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение 6 месяцев. Пробы виноградного сока хранят в холодильнике при температуре 0—4 °С в течение недели.

Отбор проб семян и масла рапса производится в соответствии с ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб». Отобранные пробы семян рапса хранят в холодильнике при 4 °С нс более 10-ти дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят в морозильной камере при -18 °С. Перед анализом образцы семян измельчают.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители при необходимости перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой. 2 %-м раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 дм³ ацетона 10 г КМп0₄ и 2 г К_:СОз). Ацетонитрил сушат над пентокендом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

2.5.2. Кондиционирование колонки Перед началом анали з аналитические колонки кондиционируют в потоке подвижной фаты (0.1—0.2см³/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1 ч.

2.5.3. Приготовление растворов Для приготовления 0.005 М раствора ортофос(|юрной кислоты 0.5 г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистнллированной воде и доводят объем до метки.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Точную навеску пропикона юла (50 мг) помещают в мерную колбу объемом 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0.5 мг/см³.) Градуировочные растворы с концентрациями 0.1. 0.2, 0.5. 0.75 и 1,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы.

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике в силаннзи-рованном или тефлоновом флаконе при температу ре 0—1 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы используют в течение рабочего дня.

При изучении полноты извлечения пропиконазола используют ацетонитрильные растворы вещества.

2.5.4. Построение градуировочного графика Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация пропиконазола в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, нс менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации пропиконазола в градуировочном растворе.

2.5.5. Подготовка приборов и средств измерения Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

МУК 4.1.2592—10

2.5.6. Подготовка концентрирующих патронов для очистки экстракта

2.5.6.1.    Кондиционирование патронов, заполненных гексадецнлси-ли на гелем - Днапак С16 (0.4 г), предназначенных для очистки экстрактов ягод и сока винограда, а также зеленой массы и семян рапса осуществляют. протекая через них последовательно по 1 см³ метанола и воды. Патроны для очистки проб масла рапса кондиционируют пропусканием 2 см³ ацетонитрила. Элюаты отбрасывают.

2.5.6.2.    Кондиционирование патронов для повторной очистки экстрактов ягод и сока винограда, зеленой массы, семян и масла рапса, заполненных Силикагелем 60 (0.5 г), осуществляют пропусканием 2,5 см³ гексана.

2.6. Проведение определения

2.6.1. Определение пропиконазола в ягодах и соке винограда

Гомогонезированную пробу ягод винограда массой 50 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 см³. прибавляют 10 см³ воды и 40 см³ ацетона. Пропиконазол экстрагируют на ультразвуковой бане в течение 10 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера с фильтром «красная лента», промывая массу на фильтре 10 см³ ацетона. Экстракцию повторяют и объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре бани нс выше 40 °С до полного удаления ацетона. Водный остаток (50—60 см³) фильтруют через бумажный фильтр «красная лента» и пропускают через концентрирующий патрон ДиапакС16. откондиционированный по п. 2.5.6.1. Фильтрат отбрасывают. Пропиконазол элюируют 5 см³ ацетона в чистую круглодонную колбу вместимостью 10 см. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °С).

Пробу виноградного сока объемом 50 см³ фильтруют через вороню Бюхнера с фильтром «красная лента», фильтрат прот екают через концентрирующий патрон ДиапакОб, откондиционированный по п. 2.5.6.1. Патрон промывают 5 см³ воды. Фильтрат и промывку отбрасывают. Пропиконазол элюируют 5 см³ ацетона в круглодонную колбу вместимостью 10 см³. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °С).

Сухой остаток проб ягод или сока винограда растворяют в 2.5 см³ гексана и полученный раствор количественно вносят в подготовленный концентрирующий патрон, заполненный силикагелем 60. Патрон промывают 5 см³ гексана. Фильтрат и промывку отбрасывают. Пропиконазол элюируют 5 см³ смеси гексан-ацетон (80 : 20). Элюат упаривают

9

досуха на ротационном испарителе (40 °С). сухой остаток растворяют в 5 см³ подвижной фазы и 10 мм³ образца вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.2. Определение пропиконазола в зеленой массе, семенах и масле рапса Навеску размолотых на лабораторной мельнице семян или измельченной зеленой массы (20 г) помещают в коническую колбу вместимостью 250 см³, прибавляют 75 см³ ацетонитрила, содержащего 20 % воды (по объему). Пропиконазол экстрагируют на ультразвуковой бане в течение 15 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера с фильтром «красная лента». Экстракцию повторяют. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе (40 °С) до полного удаления ацетонитрила.

Водный остаток экстракта семян рапса фильтруют через бумажный фильтр «красная лента» и пропускают через концентрирующий патрон Диапак С16, откондиционированный по п. 2.5.6.1. Фильтрат отбрасывают. Пропиконазол элюируют 5 см³ ацетона в круглодонную колбу вместимостью 10 см³. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °С). Дальнейшую очистку проб проводят по п. 2.6.3.

Водный остаток экстракта зеленой массы доводят до 100 см³ водой, фильтруют через бумажный фильтр «красная лента» и экстрагируют 25 см³ гексана. Экстракцию повторяют дважды. Объединенный гексановый экстракт промывают два раза водой по 20 см³. Промывки отбрасывают. а гексановый раствор сушат безводным сульфатом натрия и упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °С). Дальнейшую очистку проб проводят по п. 2.6.3.

К 10 г масла рапса прибавляют 50 см³ гексана и экстрагируют в делительной воронке вместимостью 100 см³ ацетонитрилом трижды по 10 см³. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе до объема 1 см³ и прот екают через два соединенных последовательно концентрирующих патрона Диапак С16 (0,4 г), подготовленных соответственно по п. 2.5.6.1. Промывают 2 см³ ацетонитрила. Фильтрат и промывку отбрасывают. Пропиконазол элюируют 3 см³ ацетонитрила. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °С). Дальнейшую очистку проб проводят по пункту 2.6.3.