Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств тебуконазола в зерне сои, соевом и кукурузном масле методом газожидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2549—09

Издание официальное

Москва * 2009

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств тебуконазола в зерне сои, соевом и кукурузном масле методом газожидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2549—09

МУК 4.1.2549—09

жды порциями по 30 см³. Для ускорения расслоения можно добавить небольшое количество (5 см³) насыщенного раствора хлорида натрия. Объединенные дихлорметановые экстракты фильтруют через слой безводного сернокислого натрия. Полученный раствор выпаривают на ротационном испарителе при температуре бани 50 °С до полного удаления дихлорметана. Далее проводят очистку экстрактов по п. 2.6.3.

2.6.2.    Экстракция тебуконазола из соевого и кукурузного масла. Навеску масла 10 г растворяют в 50 см³ гексана и экстрагируют тебуко-назол 50 см³ ацетонитрила в УЗ-ванне в течение 15 мин. Полученную смесь помещают в делительную воронку объемом 250 см³. После расслоения* нижний ацетонитрильный слой сливают, из верхнего гексанового слоя экстрагируют тебуконазол ацетонитрилом еще дважды порциями по 25 см³. К объединенному ацетонитрильному экстракту добавляют воду в соотношении ацетонитрил : вода - 1 :4 и переэкстрагируют тебуконазол дихлорметаном трижды порциями по 30 см³. Объединенные дихлорметановые экстракты сушат над безводным сернокислым натрием и выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 50 °С. Сухой остаток растворяют в 5 см³ ацетона и помещают в морозильную камеру с температурой - 18 °С на 2 ч. Охлажденный ацетоновый раствор декантируют в круглодонную колбу на 10 см³ через фильтр «красная лента», после чего фильтр промывают 2 см³ охлажденного ацетона. Полученный раствор упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40^ооС до полного удаления ацетона. Далее очистку проводят по п. 2.6.3.

*В случае образования сравнительно стойких эмульсий можно добавить несколько мл насыщенного раствора хлорида натрия.

2.6.3.    Очистка экстрактов на колонке с флористом. Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п.п. 2.6.1 и 2.6.2 экстрактов зерна сои или масла, количественно переносят двумя порциями по 2 см³ смеси i ексан-этилацегат (1 : 1, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2,5.5). Промывают колонку 20 см³ гексана, которые отбрасывают, затем 10 см³ элюента № 2, которые тоже отбрасывают. Тебуконазол элюируют 40 см³ элюента № 3 (гексан-этилацетат = 3:7). Весь элюат собирают в грушевидную колбу емкостью 100 см³. Раствор выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 50^ооС. Сухой остаток растворяют в 1—2 см³ гексана и 1 мм³ раствора вводят в хроматограф.

2.6.4.    Условия хроматографирования. Газовый хроматограф «Цвет-550М» с ТИД или аналогичный.

МУК 4.1.2549—09

Колонка стеклянная 1 м * 3 мм, заполненная хроматоном N-Super (0,125—0,160 мм) с 5 % SE-30. Температура колонки 235 °С, испарителя

-    250 °С, детектора - 390 °С.

Скорость газа-носителя (азот) через колонку 32,2 см³/мин, водорода

-    16,9 см³/мин, воздуха-200 см³/мин. Объем вводимой пробы 1—2 мкл.

Линейный диапазон детектирования 0,5—10 нг.

2.6.6. Обработка результатов анализа. Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание тебукона-зола в образце зерна сои или масла (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

Н₂хСхУ

Н_{хР

Н\ - высота (площадь) пика тебуконазола в стандартном растворе, мм (мв*сек);

Н₂ - высота (площадь) пика тебуконазола в анализируемой пробе, мм (мв-сек);

К- объём экстракта, подготовленного для хроматшрафирования, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г;

С - концентрация тебуконазола в стандартном растворе, мкг/см³.

Содержание остаточных количеств тебуконазола в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2 параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор тебуконазола 10 мкг/мл разбавляют.

3. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

Х\, X) - результаты параллельных определений, мг/кг; г - значение предела повторяемости (г = 2,8а_г).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

4. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

11

МУК 4.1.2549—09

X ± А мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

А - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

д*Х

100

S - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Б случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: «содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,01 мг/кг* где *- 0,05мг/кг - предел обнаружения в растительном масле).

5, Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ? ИСО 5725-1-6—2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

5.1.    Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

5.2.    Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

⁺ > ^где

± Д^ ^(± Ад. _х.) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

Д* = ±0,84Д, где

А - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

л 8*^Х

Д = — 100

12

МУК 4.1.2549—09

S - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

^=Г-Х-С„где

X^f, X, С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле

^ = ⁺ •

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

\K_k\zK    (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

5.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

2х\Х, -Л^хЮО

(*,+**)

Х\, Х_г - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

13

МУК 4.1.2549—09

6. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005-88).

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

7. Требования к квалификации оператора

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 5.

8. Разработчики

Долженко В. И., Цибульская И. А., Блинова Т. Ф.

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений (Санкт-Петербург, г. Пушкин).

Определение остаточных количеств тебуконазола в зерне сои, соевом и кукурузном масле методом газожидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2549—09

Технический редактор А. В. Терентьева

Подписано в печать 18.12.09 Формат 60x88/16    Г1еч.    л.    1,0

Тираж 200 экз.

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., д. 18, стр. 5, 7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделом издательского обеспечения Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Отделение реализации, тел./факс 952-50-89

ББК 51.21 060

060 Определение остаточных количеств тебуконазола в зерне сои, соевом и кукурузном масле методом газожидкостной хроматографии: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009.— 14 с.

1.    Разработаны ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений (авторы Долженко В. И., Цибульская И. А., Блинова Т. Ф.).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 июня 2009 г. № 2).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 9 сентября 2009 г.

4.    Введены в действие с 1 декабря 2009 г.

5.    Введены впервые.

ББК 51.21

© Роспотребнадзор, 2009 © Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009

МУК 4.1.2549—09

Содержание

1.    Вводная часть..........................................................................................................4

2.    Методика определения тебуконазола в зерне сои, соевом и кукурузном

масле методом газожидкостной хроматографии.................................................5

2.L Основные положения......................................................................................5

2.2.    Реактивы и материалы.....................................................................................6

2.3.    Приборы и посуда............................................................................................7

2.4.    Отбор и хранение проб....................................................................................8

2.5.    Подготовка к определению.............................................................................8

2.6.    Проведение определения................................................................................9

3.    Проверка приемлемости результатов параллельных определений..................11

4.    Оформление результатов......................................................................................11

5.    Контроль качества результатов измерений.........................................................12

6.    Требования техники безопасности......................................................................14

7.    Требования к квалификации оператора..............................................................14

8.    Разработчики.........................................................................................................14

3

МУК 4.1.2549-4)9

(RS)-1 р-хлорфенил-4,4-диметил-3-( 1Н-1,2,4-триазол-1 -ил    ме-

тил)пентан-3-ил (ШРАС).

Брутто формула: C₁₆H₂2CIN₃ О.

Мол. масса: 307,8.

Химически чистый препарат - бесцветное кристаллическое вещество.

Температура плавления: 105 °С.

Давление паров при 20 °С -1,7 * 10'³ шРа.

Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_ow log Р = 3,7 (20 °С).

Растворимость в воде при 20 °С - 36 мг/дм³ (pH 5—9); гексане <0,1; изопропаноле, толуоле - 5—100, дихлорметане > 200 (в г/дм³ при 20 °С).

Вещество стабильно на свету, при повышенной температуре и гидролизу в чистой воде.

Класс токсичности по ВОЗ - III, ЕПА - II.

Острая оральная токсичность (LD₅₀) для крыс 4 000 мг/кг, дермальная > 5 000 мг/кг.

Гигиенические нормативы для рапса: МДУ в кукурузе (зерно) -0,1 мг/кг, в сое (зерно, масло) - 0,1 мг/кг.

Область применения: системный фунгицид широкого спектра действия для борьбы с болезнями листьев и колосьев зерновых (фузариоз, септориоз, ржавчина, мучнистая роса и др.), серой гнилью виноградной лозы, некоторыми заболеваниями сои, рапса, подсолнечника. Используется как протравитель семян на зерновых.

2, Методика определения тебуконазола в зерне сои, соевом и кукурузном масле методом газожидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1. Область применения и принцип метода. Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств тебуконазола в зерне сои, соевом и кукурузном масле в диапазоне концентраций 0,05—1,0 мг/кг.

Методика основана на извлечении тебуконазола из зерна сои и растительного масла водно-ацетоновым раствором или ацетонитрилом с последующей очисткой перераспределением между двумя несмеши-вающимися жидкостями и на колонке с флорисилом. Количественное определение проводят методом газожидкостной хроматографии с использованием термоионного детектора.

5

МУК 4.1.2549—09

2.1.2.    Избирательность метода. Избирательность метода обеспечивается очисткой экстрактов анализируемых проб и сочетанием условий хроматографирования.

2.1.3.    Метрологическая характеристика метода. Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1 и 2.

Таблица 1

Метрологические параметры

Объект анализа Диапазон определяемых концентраций, мг/кг Показатель точности (граница относительной погрешности), ±6, % Р~ 0,95 Стандартное отклонение повторяемости, аг, % Предел повторяе мости, /*, % Предел воспроиз водимости, /?,% Зерно сои 0,05—0,1 50 4,7 13,2 14,5 0,1—1,0 25 4,2 11,8 12,9 Масло соевое 0,05—0,1 50 4,8 13,4 14,8 ОД—1,0 25 4,6 12,9 15,5 Масло кукуруз ное 0,05—ОД 50 4,7 13,2 14,5 ОД—1,0 25 4,1 11,5 12,6

Таблица 2

Полнота определения тебуконазола в зерне сои, соевом н кукурузном масле (N==5 для каждой концентрации)

Анализи руемый объект Предел обнаружения, мг/кг Диапазон определяемых концентраций, мг/кг Среднее значение определения, % Стандартное отклонение, S,% Доверительный интервал среднего результата,*, % Зерно сои 0,05 Т о сГ 80,4 4,7 4,3 Масло сои 0,05 © © Vi 1 © 77,8 4,6 4,2 Масло кукурузы 0,05 © 0 1 © 78,4 4,2 3,8

2.2. Реактивы и материалы

Аналитический стандарт тебуконазола 99,6 % Ацетон, ч,д.а..

Ацетонитрил, х.ч.

Азот газообразный в баллонах с редуктором Бумажные фильтры «красная лента»

Вода дистиллированная

МУК 4.1.2549—09

Цилиндры мерные на 100 см³

Колбы мерные на 25, 50,100 см³

Пипетки на 1, 2, 5, 10 см³

Стаканы химические

Колонка стеклянная хроматографическая

длиной 25 см, диаметром 10 мм

2.4. Отбор и хранение проб Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 10852-86. «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб».

Для длительного хранения зерно сои подсушивают при комнатной температуре в отсутствие света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажности и измельчают. Пробы масла хранят в холодильнике при 0—4 °С в закрытой стеклянной таре не более 2 мес.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1.    Подготовка и очистка реактивов и растворителей. Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре + 40 °С до объема 1,0 см³ и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

2.5.2.    Кондиционирование колонки. Перед началом анализа колонку, заполненную хроматоном N-Super (0,125—0,160 мм) с 5% SE-30, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе инертного газа (азот) при температуре 250 °С до получения стабильной нулевой линии.

2.5.3.    Приготовление стандартного и градуировочных растворов. Берут точную навеску тебуконазола (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 см³, растворяют навеску в ацетоне и доводят до метки (Стандартный раствор с концентрацией 1,0мг/см³). Градуировочные растворы с концентрациями 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 и 10 мкг/см⁵ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя для разбавления гексан. Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0—4^о0С в течение 6 мес., градуировочные растворы - в течение недели.

Для внесения в образец при определении полноты извлечения используют градуировочные растворы.

2.5.4.    Построение градуировочного графика. Для построения градуировочного графика (высота или площадь пика - концентрация тебу-коназола в растворе) в хроматограф вводят по 1 мм³ градуировочных

МУК 4 Л .2549—09

растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют высоты или площади пиков и строят график зависимости среднего значения высоты (площади) пика от концентрации тебуконазола в градуировочном растворе (мкг/см³).

2.5.5.    Подготовка колонки с флористом для очистки экстракта. В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты и вносят суспензию 4 г флори-сила в 20 см³ смеси гексан:этилацетат (1 : ], по объему), дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку промывают 20 мл этой же смеси со скоростью 1—2 кап./сек, после чего она готова к работе.

2.5.6.    Проверка хроматографического поведения тебуконазола на колонке с флористом. В круглодонную колбу емкостью 10 см³отбирают

1    см³ стандартного раствора тебуконазола с концентрацией 2 мкг/см³. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в

2    см³ элюента № 1 и вносят в колонку. Колбу обмывают еще 2 см³ элю-ента № 1 и также вносят в колонку. Затем последовательно промывают колонку 20 см³ гексана и 10 см³ элюента № 2. Далее элюируют тебуко-назол 40 см³ элюента № 3 со скоростью 1—2 кап./сек. Отбирают фракции по 10 см³ каждая, упаривают досуха, остаток растворяют в 1 см³ гексана и анализируют на содержание тебуконазола по п. 2.6.4. Фракции, содержащие тебуконазол, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 1 см³ гексана и анализируют по п. 2.6.4. Рассчитывают содержание тебуконазола в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: профиль вымывания тебуконазола может меняться при использовании новой партии сорбента.

2.5.7.    Подготовка приборов и средств измерения. Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

2.6. Проведение определения

2.6.1. Экстракция тебуконазола из зерна сои. Навеску измельченного на лабораторной мелышце зерна сои, массой 10 г помещают в коническую колбу на 250 см³, заливают 50—100 см³ смеси растворителей ацетон - вода (в соотношении 1 : 1) и экстрагируют тебуконазол в ультразвуковой ванне в течение 10 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр («красная лента»). Экстракцию повторяют дважды порциями по 30 см³ той же смеси. Объединенный фильтрат помещают в делительную воронку и переэкстрагируют тебуконазол дихлорметаном три-

9