осударственнос санитарно-эпидемиологическое нормирование _ Российской    Федерации_

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение пентахлорфенола в пищевых продуктах

Методические указании МУК 4.1.2479—09

Издание официальное

Москва • 2009

ББК 51.21 060

060 Определение остаточных количеств пентахлорфенола в нишевых продуктах: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009.—16 с.

1.    Разработаны ГУ НИИ питания РАМН (академик РАМН В. А. Тутельян, С. А. Хотимченко, К. И. Эллер, В. В. Пименова, М. Г. Киселева, С. В. Волкович, Ю. В. Медведев).

2.    Рекомендованы к ушерждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 декабря 2008 г. № 3).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.

4.    Введены в действие с момента утверждения.

5.    Введены впервые.

ЬБК 51.21

Технический редактор А. В. Терентьева

11одписано в печать 31.07.09 Формат 60x88/16    Псч.    л.    1,0

Тираж 200 экз.

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковскнй пер., л 18/20

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделом издательского обеспечения Федерального центра п<гиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш„ 19а Отделение реализации, тел./факс 952-50-89

О Роспотребнадзор, 2009 О Федеральный центр пн пены и

эпидемиологии Росно 1 ребиадзора, 2009

МУК 4.1.2479 09

2.7. Обработка результатов и /моренно

2.7.1.    Калибровка хроматографа и построение градуировочной кривой. Хроматографируют по 0,001 см¹ каждого рабочего раствора метилового эфира ПХФ (п. 2.5.3). Хромат!рпфиронинпс пропоят фпжлм и строят график зависимости средних площадей никои oi концентрации ПХФ в мг/скг (приложение I).

2.7.2.    Оформление результатов. Расчет содержании ПХФ и анализируемой смеси проводят по формуле:

_{М =} ^КутШШ*Л..!Ж    (I)

V

"не С Г

М- масса анализируемою вещества (11ХФ), мы , твн.сг - масса введенною iinyipciiiicio стандарт (альдрин). мкг, (0,02 мкг),

S - площадь пика анализируемою истее та (ПХФ),

Sbhct. — площадь пика внутреннего стандарт (альдрин),

К - поправочный коэффициент вещества (метил ПХФ) по внутреннему стандарту (альдрин), (формула 2).

Поправочный коэффициент определяю! и coothciciiiiiii с нарами-рами калибровочной смеси по следующей формуле:

?МЛ.., где    (2)

”',шп х S т - масса ПХФ, нг, (50 иг), ^твнег- масса альдрина, нг, (20 нг),

Sbhct- - площадь альдрина,

S - площадь метил-ПХФ.

Пересчет количества ПХФ на кг исследуемою продукта проводят следующим образом

М, =—> где т

Mj - содержание ПХФ, мг/кг,

М- масса анализируемого вещества (11ХФ), мы, (формула I). т - масса анализируемой пробы, г, (1 г).

11

3. Оперативный контроль результатов измерений

3.1. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

Для устранения инструментальных ошибок при газовой хроматографии (постоянство температуры колонки, скорости и деления потока газа и др.) применяют метод внутреннего стандарта, в качестве которого используют вещество с близкими физико-химическими и хроматофа-фическими характеристиками (альдрин). При анализе в каждую пробу добавляют точно известное количество альдрина. Хроматографирование проводят дважды, сравнивают отношение площади пика исследуемого вещества к площади пика внутреннего стандарта и результат считают удовлетворительным, если эта величина не превышает 5 %.

Допустимое расхождение между параллельными измерениями (R) определяют на основании предела повторяемости (г) (табл. 1):

R = 0,01 (г,%) х X ,мг/кг

Если расхождение между параллельными определениями не превышает допустимого:

|^(/ш>)1 “ ^(//*</»)г| ^ ^

го среднее арифметическое принимают за результат анализа.

При превышении норматива R следует повторить измерения, используя новую пробу.

3.2. Контроль качества результатов измерений

Периодичность контроля пофешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами контроля являются рабочие пробы продовольственною сырья, пищевых продуктов и БАД. Отбирают пробу и разделяют ее на 2 равные части. Одну из них оставляют без изменений, а к другой добавляют раствор стандарта ПХФ, такое количество, чтобы его массовая доля в пробе по сравнению с исходным значением увеличилась на 50—100 %. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.

Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной пробы (С₍пхф)) и пробы с добавкой (С'(пхф))- Определение проводят в одинаковых условиях.

MV|< -I I M7»j 09

а именно: анализ проводит один аннашик. г i«c пени*юнниигм одною набора мерной посулы, реактивом, рш тором и ( л

Алгоритм проведения оперитимиот мнмролм hoi рентой и с не пользованием метода добавок состой г н (равнении |»о lyiii.niin кошроль ного определения, равного разности между ре»улылтм нош рол иного измерения пробы с добавкой (С'₍цхф)). пробы 0i»i лоПимкн ((\п\>н) и величиной добавки (СмцпхФ)) е нормптимом опораiiimiioiо ношролм (К). Решение об удовлетворительной ши решит ш принимавк и при иынол-нении следующего условия (при Г 0,9.1)

Р(//Т0) ~ * (П\Ф)    *    Л*(»М    f    ||    ^%    ^

Норматив оперативного кошронм iioipeimmiiM paccMHibiiiaioi по формуле (Р = 0,90):

К = 0,84x(A'q_m<„ . л'(

При превышении норматива операпннюго кошронм noipeiiiiiociii эксперимент повторяют с использованием друюй пробы

4. Трсбонании техники бе iohhciioc i и

При выполнении измерений необходимо i об шопам. ipe6oiiniin>i техники безопасности при работе с химическими рев к i имам и но ГОСТ 12.1.007, требования электробе(опасное!и при рабою < шемроусшпонками по ГОСТ 12.1.019, а также трсбонании, итоженные а ичмичсской документации на газовый хромаю! рлф

5. Трсбонании к KiiiiJiin|)iik^,niiiiii онернюрон

Работу' по указанной методике Moiyi исполни!ь иысококиааифнпн-рованные специалисты в области ппожидкш той хрома ни рафии и санитарной химии. Исполнители должны бьиь принт |рукгиронппм об основных мерах техники безопасности при рабще « иепич щами I 2 класса опасности, органическими рас тори юлами, а ткже с основными правилами безопасности при рабою и химической набораюрии (н 1)

6. У слонин измерений

Помещение лаборатории должно coonum-moiiaii. ciimiiapiibiM правилам проектирования, обо рудо аа ни я, >кснлул1лппи и солержании про изводствснных и лабораторных помещений, прелнашаченмыч дли проведения работ с веществами I 2 класса опасности, органическими рас-

I I

творителями. Аналитическая лаборатория должна быть оснащена вентиляционной системой согласно ГОСТ 12.4.021.

Температура окружающего воздуха должна быть от 15 до 25 °С. Относительная влажность воздуха не более 80 % при 25 °С. Атмосферное давление 730—760 мм рт. ст. Напряжение электропитания 210— 220 В. Частота переменного тока 45—50 Гц.

Рис. 1. Прибор для получения диазометана: 1 - реакционный сосуд, 2 - переходник с капельницей, 3 - холодильник, 4 - переходник, 5 - насадка с отводом, 6 - приемная колба

14

МУК 4.1.2479--09

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

2 февраля 2009 г.

Дата введения: с момента утверждения

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение иентахлорфенола в пищевых продуктах

Методические указания МУК 4.1.2479—09

Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в пищевых продуктах массовых концентраций иентахлорфенола (ПХФ) в диапазоне 0,005—1,0 мг/кг.

Предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, находящиеся в обращении на территории Российской Федерации, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию.

Методические указания могут быть использованы другими лабораторными центрами, осуществляющими контроль качества и безопасности пищевых продуктов и аккредитованными в установленном порядке.

1. Краткая характеристика иентахлорфенола

Общепринятое название: иентахлорфенол (ПХФ).

Название по номенклатуре ИЮПАК: 2,3,4,5,6-пентахлорфсиол.

Синонимы: пентахлорфенол, 1-гидроксипентахлорбснзол, хлоро-фен, пенхлорол, пента.

Структурная формула:

3

ОН

Cl

С₆С1₅ОН

Мол.масса: 266,34

CAS номер: 87-86-5

Физические свойства: белый или слегка коричневатый порошок, с характерным фенольным запахом, температура плавления 190°С, температура кипения 310 °С, плотность D 1,978 r/см³, константа диссоциации рКа 4,7. Растворим в большинстве органических растворителях: ацетон (500 г/л), бензол (150 г/л), этанол (1 200 r/л), метанол (1 800 г/л); малорастворим в воде (2 г/л). Растворил! в маслах.

Форма выпуска: порошок.

Область применения. ПХФ используют в качестве фунгицида, бактерицида, гербицида, инсектицида, а также как консервант древесины.

Токсичность. Высоко токсичное соединение: при оральном введении крысам LD50 составляет 27 мг/кг. При контакте с кожей появляются белые пятна; ингаляция вызывает сильную головную боль, усталость, утомляемость, потливость, жажду, обмороки, повышение температуры тела.

Гигиенические нормативы. Согласно европейским стандартам содержание ПХФ в воде не должно превышать 9,0 нг/л (WHO, 2001). Установленное U.S.EPA суточное потребление при оральном поступлении ПХФ, вызывающее минимальный риск для здоровья человека, составляет 0,005 мг/кг/сутки, а при хроническом его потреблении - 0,001 мг/кг/суткн.

Рекомендуемый гигиенический норматив для Российской Федерации: содержание пентахлорфенола в пищевых продуктах нс допускается (на уровне предела обнаружения метода).

2. Методика определении ПХФ в продуктах питании методом газо-жидкостной хроматографии

2. /. Основные положении

2.1.1. Принцип метода. Методика основана на определении ПХФ в продуктах питания методом газо-жидкостной хроматофафнн О'ЖХ) с использованием электронзахватного детектора (ЭЗД) после экстракции ПХФ из подкисленной анализируемой пробы органическим растворите-

4

МУК 4.1.2479 -09

лем, переэкстракции ПХФ в водную фазу мри подщелачивании, подкислении пробы и вновь экстракции ПХФ органическим растворителем. Количественное определение проводится методом внутреннего стандарта после метилирования диазомстаном. 1* качестве внутреннего стандарта используется альдрин.

2.1.2. Метрологические характеристики метода, установленные для разных концентраций ПХФ в пробе.

Метрологические характеристики Концентрация ПХФ и пробе 0,01—0,5 мг/кг > 0,5 мг/кг Границы относительной пофешности (показатель точности) (±5), %, Р=0,95 ± 18,18 ± 13,09 Стандартное отклонение повторяемости (<тг), мг/кг 0,005 0,139 Предел повторяемости (г), мг/кг 0,013 0,385 Предел обнаружения, мг/кг 0,001 Полнота извлечения веществ, % 75,8 88,3

* - Метрологические характеристики рассчитаны для образцов с содержанием пентахлорфенола 0,02 мг/кг и 1,0 мг/кг.

2.2. Реактивы

н-Гексан, хч    ТУ 6-09-4521 — 84

Этиловый эфир    ГОСТ 84-2006- 88

Трихлорметан, хч    ТУ 6-09-4263—76

Гидразин-гидрат, чда    I'ОСТ 5832—65

Кали едкое, Lachema, Чехия

Тетраборат натрия, декагидрат, ч    ГОС Т 8429 - 77

Натрий сульфат безводный, хч    ГОСТ 4166- 76

Кислота серная, хч концентрацией

17,91 моль/л    ГОСТ 4204 77

Вода дистиллированная    ГОС!' 6709

Пентахлорфенол, «PolyScience Corporation», США

ГСО 7296-96 альдрина. Государственный инженерный ценгр «РЕАКТИВ», стандартный образец в ацетоне концентрацией 0,1 мг/мл.

2.3. Приборы, аппаратура, посуда Газовый хроматограф с детектором электронного захвата и инжектором с делением потока «split-splitless injector» для капиллярной колонки

5

МУК 4.1.2479 -09

2.4. Отбор проб

Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией на конкретную продукцию.

Перед анализом пробу образца перемалываю г на мясорубке или в кофемолке и тщательно перемешивают в блендере.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1.    Приготовление стандартных растворов ПХФ. Навеску 0,0025 ± 0,0001 г кристаллического ПХФ количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³, растворяют в 150 см³ гексана, доводят гексаном до метки и тщательно перемешивают. Получают основной стандартный раствор в гексане с массовой долей 11ХФ 0,01 мг/см’;

Для получения рабочих стандартных растворов последовательно разбавляют основной стандартный раствор гексаном. Для этого аликвоты 5,0, 2,0, 1,0 и 0,1 см³ помещают в мерные колбы вместимостью 100 см³ и растворы доводят гексаном до метки; получают рабочие стандартные растворы с содержанием ПХФ 0,0005, 0,0002, 0,0001 и 0,00001 мг/см³ соответственно.

Основной и рабочие стандартные растворы ПХФ хранят в стеклянной посуде (мерной колбе) с притертой пробкой в прохладном месте (при температуре около 0 °С). Сроки годности основной) и рабочих стандартных растворов год.

2.5.2.    Получение диазометана. Диазом стан получают но следующей методике. В реакционную колбу прибора (рис. I) помещают 6 г гидроксида калия, добавляют 3 см³ метанола и 3 ем³ гидразин гидрата. В приемную колбу наливают 50 см³ диэтилоного эфира. При включенной через холодильник воде из воронки прикапывают со скоростью 1 капля за 1—2 с хлороформ. Окончание реакции получения диазомстана определяют по появлению белых паров или бурой окраски реакционной смеси. Эфирный раствор диазомстана интенсивно-желтого цвета хранят в герметично закрытой темной стеклянной посуде на холоду в течение 3—5 дней.

2.5.3.    Приготовление рабочих стандартных растворов метиловых эфиров ПХФ. По 0,5 см³ рабочих стандартных растворов ПХФ помещают в вайлы, растворитель упаривают досуха п токе азота, к остатку добавляют по 1,0 см³ насыщенною раствора диазомстана в эфире.

Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 15—20 мин, после обесцвечивания растворы досуха упаривают

7

в токе азота и остаток растворяют в 0,2 см³ гексана. Полученный раствор используют для построения калибровочной кривой (рис. 2).

2.5.4. Приготовление калибровочной смеси стандартных растворов метилового эфира ПХФ и альдрина (внутренний стандарт). 1 см³ ГСО альдрина помешают в мерную колбу вместимостью 1 ООО см³, доводят гексаном до метки и тщательно перемешивают. Получают стандартный раствор альдрина концентрацией 0,0001 мг/см³.

В вайл помещают 0,5 см³ рабочего стандартного раствора ПХФ концентрацией 0,0001 мг/см³ (50 нг). Растворитель упаривают досуха в токе азота, к сухому остатку добавляют 1,0 см³ насыщенного раствора диазометана в эфире. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 15—20 мин, после обесцвечивания раствор досуха упаривают в токе азота, к сухому остатку добавляют 0,2 см³ стандартного раствора альдрина (20 нг) и растворитель вновь упаривают в токе азота досуха. Полученный остаток растворяют в 0,2 см³ гексана. Полученный раствор используют для калибровки хроматографа.

2.5.5.    Подготовка пробы пищевого продукта для анализа.

2.5.5.1.    Приготовление 0,1М раствора тетрабората натрия. Навеску 38,12 ± 0,01 г тстрабората натрия декагидрата помещают в мерную колбу вместимостью 1 000 см³, до половины заполненную дистиллированной водой, перемешивают до полного растворения соли, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Получают раствор буры концентрацией 0,1М.

2.5.5.2.    Приготовление 3,0 М раствора серной кислоты. Мерную колбу вместимостью 100 см³ до половины заполняют дистиллированной водой. Добавляют 16,75 см³ концентрированной серной кислоты, раствор взбалтывают, доводят до комнатной температуры и водой доводят до метки, тщательно перемешивают. Получают раствор серной кислоты концентрацией 3,0М.

2.5.5.3.    Подготовка образца. Навеску 1,0 г ±0,01 измельченного и перемешанного в блендере образца пищевого продукта помещают в коническую колбу вместимостью 100 см³, добавляют 10 см³ дистиллированной воды, 10 cm^j концентрированной серной кислоты и 10 см³ смеси гексан—изопропанол (4 : 1). Смесь встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин, переносят в центрифужные пробирки, центрифугируют 15 мин при 2 000 об/мин и отделяют органический супернатант. Экстракцию повторяют дважды с 10 см³ смеси гексан-изопропанол (4 : 1) при встряхивании и центрифугировании. Гексановые экстракты объединяют.

МУК 4.1.2479 - 09

Объединенный гексановый экстракт помещают в делительную воронку вместимостью 100 м³, добавляют 10 м³ 0,1 М раствора тетрабората натрия (бура) и смесь встряхивают. Отделяют водную фазу и экстракцию повторяют еще дважды по Юм³ раствора буры. Объединенный водный экстракт при необходимости цен грифугируют и количественно переносят в делительную воронку вместимостью 100 м³, подкисляют 3 м³ ЗМ раствора серной кислоты и ПХФ экстрагируют гексаном 3 раза по 10 м\ Гексановый экстракт объединяют, сушат над безводным сульфатом натрия, порциями фильтруют через бумажный складчатый фильтр «синяя лента» или, при необходимости, фильтруют через нейлоновый фильтр в вайл и растворитель упаривают досуха в токе азота.

2.5.5.4. Получение метилового производного ПХФ из экстракта пищевого продукта. К полученному сухому остатку добавляют по 1,0 м³ насыщенного раствора диазометана в эфире.

Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 15—20 мин, после обесцвечивания раствор досуха упаривают в токе азота. К сухому остатку добавляют 0,2 см³ стандартного раствора альдрина концентрацией 0,0001 мг/см³ (20 нг, внутренний стандарт), растворитель вновь упаривают досуха в токе азота и остаток растворяют в 0,2 см³ гексана.

2.6. Описание определения

2.6.1. Условия ГЖХ анализа. Хроматографическую колонку кондиционируют до минимального дрейфа базовой линии.

Условия ГЖХ: кварцевая капиллярная колонка 50 м, внутренний диаметр 0,32 мм, жидкая фаза полнметилфснилсилоксан (5 % фенила) DB-5 или SE-54 или Rtx-5 или НР-5:

температура колонки 250 °С;

температура испарителя 280 °С;

температура детектора 300 °С;

время выхода растворителя 2,5—3 мин (для колонки 50 м).

2.6.2.    Анализ пробы. Анализ проводят в условиях ГЖХ, описанных

вп. 2.6.1.

В инжектор газового хроматофафа с помощью микроишрица вместимостью 10 мкл последовательно вводят две аликвоты (около 0,0005—0,001 см³) калибровочной смеси метилового эфира ПХФ и альдрина. При использовании метода внутреннего стандарта нет необходимости вводить в хроматофаф точные количества проб. В каждом случае регистрируют время выхода растворителя гексана и времена вы-

9

хода метил-ПХФ и альдрина. Определяют относительное приведенное время удерживания (наиболее воспроизводимая величина для идентификации) и площади пиков стандарта и внутреннего стандарта ($сг• ^и Sbhct)- Относительные приведенные времена удерживания определяют по следующей формуле:

/' ₌ Jj£L—, где *вн ст ~ *о

относительное приведенное время удерживания, мин,

1₀ - время удерживания растворителя, мин,

/ст- - время удерживания метил-ПХФ, мин, tsHCT• - время удерживания альдрина, мин.

Площадь пиков определяют по показанию интегратора.

Затем в газовый хроматограф вводят 0,0005—-0,001 см³ раствора, полученного по п. 2.5.5.4. При наличии пика, соответствующего относительному приведенному времени удерживания метил-ПХФ, определяют его площадь (S_ol;p). Относительное приведенное время удерживания метил-ПХФ в зависимости от условий хроматографии может меняться в пределах 0,48—0,51.

Абсолютные времена удерживания ПХФ в приведенных условиях -11,2 ± 0,2 мин для метилового эфира ПХФ и 20,7 ± 0,5 - для альдрина (внутренний стандарт) (рис. 3).

2.6.3. Подтверждение результатов определения с помощью метода ГЖХ-МС. Анализ ГЖХ-МС проводили на приборе Poiaris-Q фирмы Finnigan (США) при следующих условиях: ГЖХ - капиллярная колонка длиной 30 м х 0,25 мм с неподвижной фазой DB-5 при программировании температуры: начальная температура 60 °С, 1 мин - 250 °С, 25 °С/мин, 1 мин - 280 °С, 5 °С/мин.; т-носитель гелий - 1 мл/мин. Температура инжектора 280 °С, интерфейса ГЖХ-МС - 250 °С. Условия МС: «ионная ловушка», сканирование в режиме полного ионного тока от 39 m/z до 550 m/z. Температура ионной коробочки 250 °С. В результате исследования на хроматограмме получен пик с молекулярным ионом М⁺ = 280 (70 %) и фрагментами с m/z 265 (100 %), 237 (82 %) с соответствующими изотопными хлорсодержащими пиками.

Таким образом, масс-спектр исследуемого соединения как по библиотечному поиску, так и по правилам фрагментации соответствует ме-тильному производному ПХФ, масс-спектр которого приведен на рис. 4.