Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств пиноксадена по основным метаболитам в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостпой хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2457—09

Издание официальное

Москва • 2009

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств пиноксадена по основным метаболитам в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2457—09

МУК 4.1.2457—09

Стекловата Стеклянные палочки

Патроны для твердофазной экстракции Oazis® HLB Зсс (60 mg), WAT094226,

Lot No 077В37297С (Waters, США)

Патроны для твердофазной экстракции Oazis® МСХ 6сс(500 mg) LP, Part No 186000776,

Lot No 0025376232A (Waters, США)

Плитка электрическая (или колбонагреватель)

Ротационный вакуумный испаритель В-169

фирмы Buchi, Швейцария

Установка для перегонки растворителей

Холодильник водяной обратный    ГОСТ    9737

Хроматографическая колонка стальная, длиной

250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая

Symmetry® С18, зернением 5 мкм

Хроматографическая колонка стальная, длиной

250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая

Zorbax SB С8, зернением 5 мкм

Шприц для ввода образцов для жидкостного

хроматографа вместимостью 50—100 мм³

Шприцы медицинские с разъемом Льюера

вместимостью 5 и 10 см³    ГОСТ    22090

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1.    При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2.    Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313—03 «Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Обучение работников соблюдению безопасности условий труда по ГОСТ 12.0.004.

МУК 4.1.2457—09

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

•    процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %.

•    выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, растворов внесения, смеси для экстракции, подвижных фаз для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик, подготовка концентрирующих патронов Oazis® HLB nOazis® МСХ.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1.    Ацетонитрил. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксцдом фосфора не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2.    Ацетон. Растворитель сушат над молекулярными ситами 4 А и подвергают фракционной перегонке на ректификационной колонне, целиком собранной из стекла с числом теоретических тарелок не менее 30. До начала отбора главной фракции приемник несколько раз промывают дистиллятом. Перегонку продолжают до тех пор, пока в сосуде для перегонки не останется приблизительно 100 см³ ацетона. Температуру водяной бани следует снижать по мере уменьшения объема ацетона, во всех случаях она не должна превышать температуру кипения ацетона (56 °С) более чем на 20 °С.

7.1.2.    Дихлорметан. Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор, пока она не

11

МУК 4.1.2457—09

перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.3. Этилацетат. Этилацетат промывают последовательно 5 %-м водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.2. Приготовление растворов соляной кислоты

Для приготовления 1 N раствора в мерную колбу вместимостью 1 ООО см³, содержащую 300—400 см³ деионизованной воды, помещают 82 см³ концентрированной соляной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

Для приготовления 0,2 N раствора в мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 200 см³ 1 N раствора соляной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

7.3. Приготовление 10 % раствора хлористого натрия

В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 50 г хлорида натрия, доводят водой до метки, перемешивают.

7.4. Приготовление растворов уксусной кислоты в этилацетате

Для приготовления 2% раствора в мерную колбу вместимостью 500 см³, содержащую 200—300 см³ этил ацетата, помещают 10 см³ ледяной уксусной кислоты, доводят этил ацетатом до метки, перемешивают.

Для приготовления 1 % раствора в мерную колбу вместимостью 500 см³, содержащую 200—300 см³ этилацетата, помещают 5 см³ ледяной уксусной кислоты, доводят этилацетатом до метки, перемешивают.

7.5. Приготовление 1 % раствора уксусной кислоты в ацетонитриле

В мерную колбу вместимостью 500 см³, содержащую 200—300 см³ ацетонитрила, помещают 5 см³ ледяной уксусной кислоты, доводят ацетонитрилом до метки, перемешивают.

7.6. Приготовление 0,2 % водного раствор муравьиной кислоты

В мерную колбу вместимостью 500 см³, содержащую 200—300 см³ деионизованной воды, помещают 1 см³ муравьиной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

МУК 4.1.2457—09

7.7. Приготовление смеси растворителей для экстракции метаболита М2

В мерную колбу вместимостью 1 ООО см³ помещают 900 см³ 1 N соляной кислоты и 100 см³ ацетонитрила, перемешивают.

7.8. Подготовка концентрирующих патронов Oazis® HLB и Oazis* МСХ

Патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума*.

Концентрирующие патроны промывают с помощью медицинского шприца (или разряжения, создаваемого водоструйным насосом) метанолом (объем растворителя для патронов Oazis® HLB - 2 см³, Oazis® МСХ - 3 см³), затем 2 см³ деионизированной воды (патроны Oazis® HLB) или дважды по 3 см³ 0,2 % муравьиной кислотой (патроны Oazis® МСХ) со скоростью прохождения растворителя через патрон 1—2 капли в сунду. Патроны готовят непосредственно перед использованием.

* Примечание: В отсутствие специального аллонжа, жидкость продавливают через патрон с помощью поршня медицинского шприца, скорость продав-ливания раствора не должна превышать 1—2 капли в секунду.

7.9.    Подготовка подвижной фазы Xs 1 для ВЭЖХ

(определение метаболита М2)

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 450 см³ деионизованной воды, 1 см³ муравьиной кислоты, 50 см³ изопропанола и 500 см³ метанола, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.10.    Подготовка подвижной фазы Л° 2 для ВЭЖХ

(определение метаболитов М4 и Мб)

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 620 см³ деионизованной воды, 1 см³ муравьиной кислоты, 40 см³ изопропанола и 340 см³ метанола, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.11. Кондиционирование хроматографических колонок

Промывают колонки подвижной фазой (приготовленной по п. 7.9 или 7.10) при скорости подачи растворителя 1,0см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.12. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения

7.12.1. Исходные растворы метаболитов М2, М4 и Мб для градуировки (концентрация Ю0мкг/см³) В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,0100 г метаболита М2 или Мб (содержание основ-

МУК 4.1.2457—09

ного вещества 99 и 99,6%, соответственно), 0,0116 г метаболита М4 (содержание основного вещества 86 %), добавляют 50—70 см³ метанола, перемешивают, доводят метанолом до метки, вновь перемешивают. Растворы хранятся в холодильнике в течете 3-х месяцев.

Растворы № 1—5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходных растворов для градуировки.

7.12.2.    Растворы № 1 метаболитов М2, М4 и Мб для градуировки и внесения (концентрация 10мкг/см³) В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора метаболитов М2, М4 или Мб с концентрацией 100мкг/см³ (п. 7.12.1), разбавляют метанолом до метки, перемешивают. Растворы хранится в холодильнике в течение месяца.

Растворы метаболитов с концентрацией 10 мкг/см³ используют для приготовления проб зерна и соломы с внесением при оценке полноты извлечения веществ методом «внесено-найдено», а также контроле качества результатов измерений методом добавок.

7.12.3.    Рабочие растворы № 2—5 метаболитов М2, М4 и Мб для градуировки (концентрация 0,1—1,0 мкг/см³). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см³ градуировочного раствора №1 с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 7.12.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.9 или 7.10, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы №№ 2—5 с концентрацией метаболитов М2, М4 или Мб 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см³ соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике в течение 7-ми дней.

7.13. Установление градуировочных характеристик

Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площади пика (мкВ • с) от концентрации метаболитов М2, М4 или Мб в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3.1 или 9.3.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

7.14. Подготовка колонки с оксидом алюмини для очистки экстракта

Приготовление оксида алюминия 3-й степени активности по Брокману: 100 г сорбента (алюминий оксид, активированный, нейтральный) помещают в круглордонную колбу вместимостью 500 см³, с помощью пипетки по каплям вносят в колбу 4,6 см³ деионизованной воды (после

МУК 4.1.2457—09

каждой капли встряхивая колбу для равномерно распределения жидкости по объему сорбента). Закрывают колбу пробкой, интенсивно встряхивают в течение 4-5-ти минут, затем оставляют на 12 часов, периодически перемешивая (встряхиванием).

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8—10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, через воронку насыпают в колонку 5 г приготовленного сорбента, уплотняют его (при открытом кране) постукиванием резиновой грушей о стенки. Промывают колонку 15—20 см³ этиладетакта. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонка готова к работе.

7.15.    Проверка хроматографического поведения метаболита М2 на колонке с оксидом алюминия

В круглодонную колбу вместимостью 20—25 см³ помещают 0,2 см³ раствора № 1 для градуировки и внесения с концентрацией М2 10 мкг/см³ (п. 7.12.2), растворитель упаривают досуха, добавляют 5 см³ этил ацетата, перемешивают (помещая на ультразвуковую баню на 20— 30 с) и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.14. Промывают колонку со скоростью 1—2 капли в сунду последовательно 20 см³ этил-ацетата (первыми 5 см³ предварительно ополаскивают колбу, в которой находилась проба), 10 см^смеси этилацетат-метанол (90 : 10, по объему), затем 50 см³ смеси этилацетат-метанол (50:50, по объему), элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 40 см³ смеси метанол-1 % уксусная кислота в этил ацетате (50 : 50, по объему) со скоростью 1—2 капли в сунду. Фракционно (по 5 см³) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 см³ подвижной фазы, приготовленной по п. 7.9, анализируют содержание метаболита М2 по п. 9.3.1.

Фракции, содержащие М2, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюаге, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

7.16.    Проверка хроматографического поведения метаболитов М4 и Мб на колонке с оксидом алюминия

В круглодонную колбу вместимостью 20—25 см³ помещают по 0,05 см³ исходных растворов метаболитов М4 и Мб для градуировки с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.12.1), добавляют 5 см³ этилацетата, перемешивают (помещая на ультразвуковую баню на 20—30 с) и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.14. Промывают колонку со скоростью 1—2 капли в секунду 50 см³ этилацетата (первыми 5 см³ предвари-

15

ББК 51.21 060

060 Определение остаточных количеств пиноксадена по основным метаболитам в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009.— 23с.

1.    Разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана (Т. В. Юдина, Н. Е. Федорова, В. Н. Волкова,

Л. В. Горячева).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 декабря 2008 г. №3).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.

4.    Введены в действие с 29 апреля 2009 г.

5.    Введены впервые.

ББК 51.21

© Роспотребнадзор, 2009 ©Федеральный центр гигиены и

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009

МУК 4.1.2457-4)9

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

2 февраля 2009 г.

Дата введения: 29 апреля 2009 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств пиноксадена по основным метаболитам в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2457—09

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации пиноксадена по его основным метаболитам в зерне и соломе зерновых колосовых культур в диапазонах 0,04—0,4 мг/кг и 0,08— 0,8 мг/кг соответственно.

Пнноксаден (NOA 407855)

2,2-Диметилпропионовая кислота, 8-(2,6-диэтил-4-метилфенил)-9-оксо-1,2,4,5тетрагидро-9Н-пиразоло[1,2ч!][1,4,5]оксадиазепин-7-ил эфир (ШРАС)

C₂₃H₃₂N₂0₄ Мол. масса 400,5

3

Бесцветное кристаллическое вещество, со сладковатым запахом. Температура плавления 120,5—121,6 °С. Давление паров - 2,0 х 10‘⁷ Па (при 20 С), 4.6 х 10'⁷ Па (при 25 °С). Растворимость в органических растворителях при 25 °С (в г/дм³): ацетон - 250; дихлорметан - > 500; этил-ацетат - 130; метанол - 260; толуол - 130; и-октанол - 140; «-гексан -1,0. Растворимость в воде 200 мг/дм³ (25 °С). Коэффициент распределения н-октанол-вода - logK™ = 3,2.

Г идролитическая стабильность (DTso) при 25 °С - 17,2 дней (pH 4); 17,5 дней (pH 5); 9,9 дней (pH 7); 0,2 дня (pH 9).

Основными продуктами метаболитической деградации (гидролиз, окисление) пиноксадена в зерне и соломе являются соответствующий дион - метаболит 2 (здесь и далее М2), 4-гидроксиметил-фенил-дион -метаболит 4 (здесь и далее М4) и 4-карбоксиметил-фенил-дион - метаболит 6 (здесь и далее Мб).

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 5 000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD50) для кроликов - более 2 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC50) для крыс (4 ч) -4,63 мг/дм³ (самцы), 6,24 мг/дм³ (самки).

Метаболит 2 (М2, NOA 407854)

8-(2,6-диэтил-4-метил-фенил)-тетрагидропиразоло[ 1,2-d][ 1,4,5] ок-садиазепин-7,9-дион (ШРАС).

c„h_mn₂o_<

Мол. масса 316,4

Бесцветное кристаллическое вещество, растворимость в воде -370 мг/дм³, давление паров - 5,2 * 10‘¹³ атм. Коэффициент распределения н-октанол/вода - logKo_W = 0,62—1,7.

Метаболит 4 (М4, SYN 505164)

8-(2,6-диэтил-4-гид роксиметил-фенил)-тетрагидропиразоло[ 1,2-d][ 1,4,5]окса-диазепин-7,9-дион (ШРАС).

4

МУК 4.1.2457—09

C,₈H₂₄N₂0₄ Мол. масса 332.4

Метаболит 6 (Мб, SYN 502836)

4-(7,9-диоксо-гексагидро-пиразоло[ l,2-d][ 1,4,5]окса-диазепин-8-ил)-3,5-диэтил-бензойная кислота (ШРАС)

c_I8h₂₂n₂o₅

Мол. масса 346,4

Область применения препарата

Пиноксаден рекомендуется в качестве высокоэффективного селек-тивного послевсходового гербицида для подавления роста широкого спектра злаковых сорняков на посевах ячменя, пшеницы, ржи и тритикале.

Рекомендуемый МДУ в зерне зерновых колосовых культур -0,1 мг/кг.

1. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и её составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

5

Таблица 1 Метрологические параметры

Определяемое вещество Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (дм3) Показатель точности (граница относительной погрешности), ±б,%/> - 0,95 Стандартное отклонение повторяемости, ог, % Предел повторяемости, г, % Предел воспроиз водимости, R Зерно Метаболит М2 от 0,04 до 0,1 вкл. 50 10,0 28 33 более 0,1 до 0,4 25 7,3 20 24 Метаболит М4 от 0,04 до 0,1 вкл. 50 6,6 18 22 более 0,1 до 0,4 25 5,0 14 16 Метаболит Мб от 0,04 до 0,1 вкл. 50 5,8 16 19 более 0,1 до 0,4 25 5.9 16 20 Солома Метаболит М2 от 0,08 до 0,1 вкл. 50 6,6 18 22 более 0,1 до 0,8 25 6,7 19 22 Метаболит М4 от 0,08 до 0,1 вкл. 50 6,4 18 21 более 0,1 до 0,8 25 6,3 18 21 Метаболит Мб от 0,08 до 0,1 вкл. 50 6,1 17 20 более 0,1 до 0,8 25 6,3 18 21

Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (п = 20) приведены в табл. 2.

6

МУК 4.1.2457—09

Таблица 2

Определяе мое вещество Метрологические параметры, Р = 0.95, и = 20 Предел обнаружения, мг/кг (дм3) Диапазон определяемых концентраций, мг/кг(дм3) Среднее значение определения, % Стандартное отклонение, S, % Довери тельный интервал среднего результата, % Зерно Метаболит М2 0,04 0,04—0,4 78,9 5,7 ±3,1 Метаболит М4 0,04 0,04—0,4 80,0 3,8 ±2,0 Метаболит Мб 0,04 0,04—0,4 78,9 3,6 ±2,0 Солома Метаболит М2 0,08 0,08—0,8 79,1 4,9 ±2,6 Метаболит М4 0,08 0,08—0,8 79,3 4,1 ±2,2 Метаболит Мб 0,08 0,08—0,8 80,2 4,1 ±2,2

2. Метод измерений

Методика основана на определении веществ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Контроль пиноксадена в образцах зерна и соломы осуществляется по содержанию его основных метаболитов (М2, М4 и Мб) после экстракции из анализируемых образцов смесью 1 N соляная кислота-ацетонитрил (М2) или 1 N соляной кислотой (М4 и Мб) при кипячении, последовательной очистки аликвоты экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, на колонке с оксидом алюминия, затем концентрирующих патронах Oazis® HLB (М2) или дважды Oazis® МСХ (М4 и Мб).

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

7

МУК 4.1.2457—09

3. Средства измерений, вспомогательные устройства,

реактивы и материалы 3.1. Средства измерений Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны (фирмы Номер Госреестра Perkin-EImer, США) 15311—02 Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104 Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности ± 0,038 г ГОСТ 7328 Колбы мерные вместимостью 2-100-2, 2-500-2,2-1 000-2 ГОСТ 1770 Меры массы ГОСТ 7328 Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3 ГОСТ 29227 Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой вместимостью 10 см3 ГОСТ 1770 Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50,100, 500 и 1 000 см3 ГОСТ 1770

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы Метаболит 2 (NOA 407854), аналитический стандарт с содержанием основного вещества 99,6 %

(Сингента, Швейцария)

Метаболит 4 (SYN 505164), аналитический стандарт с содержанием основного вещества 86 %

(Сингента, Швейцария)

Метаболит 6 (SYN 502836), аналитический стандарт с содержанием основного вещества 99 %

(Сингента, Швейцария)

Алюминий оксид, активированный, нейтральный, для колоночной хроматографии, 50—200 мкм («Акрос Органике», Бельгия)

Ацетон, хч    ГОСТ 2306

Ацетонитрил для хроматографии, хч    ТУ 6-09-4326—76

Вода деионизованная    ГОСТ 6702