Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств трифенацина (по дифенацину) в воде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2405—08

Издание официальное

Москва • 2009

Федеральная служба но надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.1. Методы контроля. Химические факторы

Определение остаточных количеств трифенацина (по дифенацину) в воде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2405-08

МУК 4.1.2405-08

п. 7.2., тщательно перемешивают, получают рабочие растворы №№ 2 -5 с концентрацией дифенацина 0,05; 0,1; 0.25 и 0,5 мкг/см³, соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике в течение недели.

7.5. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика дифенацина (относительные единицы) от концентрации вещества в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки №№ 2-5.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений. Устанавливают площади пиков дифенацина.

Градуировочный график проверяют ежедневно по анализу 2-х растворов для градуировки различной концентрации. Если значения площадей отличаются более чем на 10% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

7.6. Приготовление 1% раствора уксусной кислоты в этилацетате

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 50 - 70 см³ этил-ацетата, вносят 2 см³ ледяной уксусной кислоты, доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают.

7.7. Подготовка концентрирующего патрона Sep-Pak Silica для очистки экстракта

Патрон Sep-Pak Silica устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума*, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом Льюера объемом не менее 10 см³, используемый в качестве емкости для элю-ента.

Концентрирующий патрон промывают последовательно 5 см³ этил-ацетата, затем 5 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему). Процедуру проводят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин, при этом нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

МУК 4.1.2405-08

* Примечание: В отсутствии специального аллонжа, жидкость продавливают через патрон с помощью шприца, скорость продавливания раствора не должна превышать 1-2 капли в сек.

7.8. Проверка хроматографического поведения дифенацина на концентрирующем патроне Sep-Pak Silica

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,2 см³ градуировочного раствора № 1 дифенацина (п. 7.4.2), растворитель упаривают досуха при температуре не выше 35°С, остаток растворяют в 2 см³ этилацетата, помещая на 30 сек в ультразвуковую баню. Затем в колбу добавляют 2 см³ гексана, смесь тщательно перемешивают и вносят на концентриующий патрон, подготовленный по п. 7.7. Колбу обмывают 5 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) и также вносят на патрон. Патрон дополнительно промывают 15 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему), 20 см³ смеси этих же растворителей в объемном соотношении 3:7, затем 20 см³ этилацетата. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1-2 капли в сек. Элю-ат отбрасывают.

Дифенацин элюируют с патрона 40 см³ 1% уксусной кислоты в этилацетате (п. 7.6), собирая 5 порций элюата по 5 см³ каждая непосредственно в круглодонные колбы. Растворы в колбах упаривают досуха при температуре не выше 35°С. Остаток в каждой колбе растворяют в 2-х см³ подвижной фазы (приготовленной по п. 7.2) и анализируют содержание дифенацина по п. 9.3. Фракции, содержащие дифенацин, объединяют и вновь анализируют. Рассчитывают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюента.

ПРИМЕЧАНИЕ: Проверку хроматографического поведения дифенацина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8, Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб», «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№> 2051-79 от 21.08.79).

Пробы воды анализируют в день отбора, при необходимости хранят в холодильнике при температуре 4-6°С в течение 10-ти недель. Для

11

МУК 4.1.2405-08

длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре -18°С.

Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция

Образец анализируемой воды объемом 500 см³ помещают в делительную воронку вместимостью 1000 см³, добавляют 75 см³ хлористого метилена, интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний органический слой переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 см³, фильтруя его через 2-х см слой безводного сульфата натрия, помещенный в конусную химическую воронку диаметром 60 мм, снабженную бумажным фильтром «красная лента». Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды порциями этилацетата по 50 см³. Отстоявшийся слой хлористого метилена (нижняя фаза) фильтруют в колбу с ранее полученным экстрактом.

Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40°С, подвергают очистке в соответствии с п. 9.2.

9.2. Очистка экстракта

Сухой остаток в колбе, полученный по п. 9.1, растворяют в 2 см³ этилацетата, помещая на 30 сек в ультразвуковую баню. Затем в колбу добавляют 2 см³ гексана, смесь тщательно перемешивают и вносят на концентрирующий патрон Sep-Pak Silica, подготовленный по п. 7.7. Колбу обмывают 5 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) и также вносят на патрон. Патрон дополнительно промывают 15 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему), 20 см³ смеси этих же растворителей в объемном соотношении 3:7, затем 20 см³ этилацетата. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1-2 капли в сек. Элюат отбрасывают.

Дифенацин элюируют с патрона 35 см³ 1% уксусной кислоты в этилацетате (п. 7.6), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35°С. Остаток в колбе растворяют в 2 см³ подвижной фазы (приготовленной по п. 7.2) и анализируют содержание дифенацина по п. 9.3.

МУК 4.1.2405-08

9.3. Условия хроматографирования

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

Жидкостный хроматограф «Perkin Elmer» (США) с ультрафиолетовым детектором

Хроматографическая колонка стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 2,0 мм, содержащая Spherisorb® S5 ODS 2, зернением 5 мкм

Температура колонки: комнатная

Подвижная фаза:    ацетонитрил-вода-орто-фосфорная    кислота

(85:15:0,1, по объему)

Скорость потока элюента: 0,3 см³/мин

Рабочая длина волны: 312 нм

Чувствительность: 0,01 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы: 20 мм³

Ориентировочное время выхода дифенацина: 6,25 - 6,40 мин

Линейный диапазон детектирования: 1 - 20 нг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор дифенацина с концентрацией 0,5 мкг/см³, разбавляют (не более чем в 50 раз) подвижной фазой для ВЭЖХ (подготовленной по п. 7.2).

10. Обработка результатов анализа

Содержание трифенацина в пробе рассчитывают по формуле:

Ах W

Х = «------------- , где

V х К

X - содержание трифенацина в пробе, мг/дм³;

А - концентрация дифенацина, найденная по градуировочному графику, в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

W - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования,

см³;

V - объем анализируемого образца воды, см³;

К - коэффициент пересчета, равный 0,66'.

' В случае иного содержания дифенацина в трифенацине коэффициент К соответствует этой величине.

13

МУК 4.1.2405-08

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

100

( * , +    *    г)

где Хь Х_г результаты параллельных определений, мг/дм³; г- значение предела повторяемости (таблица 1), при этом г ™ 2.8ст_г. При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(X ± А) мг/дм³ при вероятности Р= 0.95,

где X- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/дм³;

А- граница абсолютной погрешности, мг/дм³;

А -6*Х/Ю0,

S - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее 0.0002 мг/дм³»*

* - 0.0002 мг/дм³ - предел обнаружения.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецинзионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

14

МУК 4.1.2405-08

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

где ± д_л-(±д_лР) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/дм³, при этом:

А =8 *Х/100,

8D- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %. Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

К X' - X -

где X, X, С_д среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п.11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/дм³;

Норматив контроля К рассчитывают по формуле

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

Ik.Uk,

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

15

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R)

где Х|, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/дм³;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

14. Разработчики

Юдина Т.В., Федорова Н.Е., Волкова В.Н. (Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана).

МУК 4.1.2405-08

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный Государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

17 июля 2008 г.

Дата введения: 1 сентября 2008 г.

4.1. Методы контроля. Химические факторы

Определение остаточных количеств трифенацина (по дифенацину) в воде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2405-08

Настоящие методические указания устанавливают метод высоко-эффективной жидкостной хроматографии для определения в воде массовой концентрации трифенацина (по дифенацину) в диапазоне 0,0002 - 0,002 мг/дм³.

Трифенацин - смесь производных индан-1,3-дионов, основным компонентом которой является дифенацин (дифацинон)- содержание не менее 70%.

Дифенацин

2-(дифенилацетил)-индан-1,3-дион (ШРАС)

СгзН^Оз Мол. масса 340,4

Твердое вещество светло-желтого цвета. Температура плавления 145-147Х. Растворимость в органических растворителях (в г/кг): хло-

3

МУК 4.1.2405-08

роформ - 204; толуол - 73; ксилол - 50; ацетон - 29; этанол -2,1; н-гептан - 1,8. Практически не растворим в воде - менее 0,3 мг/дм³. Растворим в щелочах с образованием солей. Стабилен в течение 14 дней при pH 6-9, гидролизуется (< 24 час) при pH 4. Быстро разлагается в воде на солнечном свету. Слабая кислота, образует водорастворимые соли щелочных металлов.

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая пероральная токсичность (LD50) в мг/кг: для крыс - 2,3; мышей - 340; кроликов -35; кошек -14,7; собак - 3-7,5; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - менее 200 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC50) для крыс - менее 2 мг/дм³ (4 ч).

Область применения

Дифенацин - ротентицид класса индандионов, обладающий антикоагулянтной активностью, рекомендуется для борьбы с грызунами в открытом грунте (осень, зима, весна) на зимующих культурах (зерновые, пастбищные травы, древесные, кустарниковые насаждения и др.), в защищенном грунте на всех культурах независимо от сезона. Применяется в виде приманки.

ОДУ дифенацина в воде водоемов - 0,0008 мг/дм³.

1.Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и её составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р=0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1 Метрологические параметры

Анализиру емый объект Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (дм3) Показатель точности (граница относительной погрешности) ±5. % Р=0,95 Стандартное отклонение повторяемости, аг, % Предел Повторяемости, г, % Предел воспроизводимости, R, % Вода от 0,002 до 0,001 вкл. 100 5,2 14 17 менее 0,001 до 0,0002 150 5,4 15 18

МУК 4.1.2405-08

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (п = 20) приведены в таблице 2.

Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата

Анализи руемый объект Метрологические параметры, Р - 0,95, п = 20 Предел обнару жения, мг/дм3 Диапазон определяемых концентраций, мг/дм3 Среднее значение определения % Стандартное отклонение, S,% Доверительный интервал среднего результата, +,_% Вода 0.0002 0,0002-0,002 75,5 __ 2,0

2. Метод измерений

Методика основана на определении трифенацина (по дифенацину) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемой пробы воды дихлорметаном и последующей очистки экстракта на патроне для твердофазной экстракции Sep Рак Silica.

Для расчета содержания трифенацина в пробе воды используют поправочный коэффициент, учитывающий массовую долю дифенацина в трифенацине.

3, Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3,1, Средства измерений

Жидкостный хроматограф «Perkin Elmer» (США) с ульт- Номер в Государственном

рафиолетовым детектором Весы аналитические ВЛА-200 Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2 и 2-1000-2 Меры массы

Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0,2,0, 5,0, 10 см³

Пробирки градуированные вместимостью 5 или 10 см³ ГОСТ 1770 Цилиндры мерные 2>го класса точности вместимостью ГОСТ 1770 10, 50, 100 и 1000 см³

5

МУК 4 Л .2405-08

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Дифснацин, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества 98,2% («Блок-1»)

Ацетонитрил для хроматографии, хч    ТУ-б-09-4326-76

Вода бидистиллированная, деионизованная или перегнанная ГОСТ 6709 над КМп0₄

н-Гексан, хч    ТУ 6-09-33-75

11атрий сернокислый безводный, хч    ГОСТ

Кислота орто-фосфорная, хч, 85%    ГОСТ 6552

Метилен хлористый (дихлорметан), хч    ГОСТ 12794

Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат) эталонный ГОСТ 4166

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами)

Баня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария)

Бумажные фильтры "красная лента", обеззоленные Воронки делительные вместимостью 1000 см³ Воронки конусные диаметром 30-37 и 60 мм Груша резиновая

Колбы плоскодонные вместимостью 200 - 250 см³

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 100 и 250

см³

Мембранные фильтры капроновые, диаметром 47 мм Насос водоструйный

Патроны для твердофазной экстракции типа Sep-Pak Sillica Cartridges (масса сорбента 690 г)

Пробирки центрифужные

6

МУК 4.1.2405-08

Ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, ТУ 25-11-917-74 Швейцария

Стаканы химические, вместимостью 50 и 100 см⁵    ГОСТ    25336

Стекловата

Стеклянные палочки

Установка для перегонки растворителей

Набор для фильтрации растворителей через мембрану

Хроматографическая колонка стальная, длиной 250 мм,

внутренним диаметром 2,0 мм, содержащая Spherisorb® S5

ODS 2, зернением 5 мкм

Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50- 100 мм³

Шприц медицинский с разъемом Лмоера    ГОСТ    22090

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1.    При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезоиасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2.    Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

7

МУК 4.1,2405-08

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

•    процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20±5)°С и относительной влажности не более 80%.

•    выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление растворов для градуировки и внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка патронов для твердофазной экстракции, проверка хроматографического поведения вещества на них, отбор проб.

7.7. Подготовка органических растворителей

7.1.1, Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очисткаэтилацетата Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.1.3. Очистка н-гексана Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

8

МУК 4.1.2405-08

7.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 850 см³ ацетонитрила, 150 см³ бидистиллированной или деионизованной воды и 1 см³ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.2. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 0,3 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.4. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения

7,4.1. Исходный раствор дифенацина для градуировки (концентрация 100 мкг/см³)

В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,0100 г дифенацина, добавляют 50-70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Растворы № 1-5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.4,2. Раствор Ns 1 дифенацина для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см^J)

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора дифенацина с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.4.1), разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом «внесе-но-найдено», а также контроле качества результатов измерений методом добавок.

7.4.3. Рабочие растворы Ns 2-5 дифенацина для градуировки (концентрация 0_t05 -0,5 мкг/см³)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают по 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 см³ градуировочного раствора №1 с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 7.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по

9