Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств хизалофоп-П-Этила в зеленой массе рапса, семенах и масле рапса и сои по основному метаболиту хизалофоп-П кислоте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2336—08

Издание официальное

Москва * 2009

Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств хизалофоп-П-Этила в зеленой массе рапса, семенах и масле рапса и сои по основному метаболиту хизалофоп-П кислоте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2336-08

МУК 4.1.2336-08

2.6.2. Очистка экстрактов.

2.6.2.1. Очистка переэкстракцией Отобранные аликвоты экстрактов, полученных по п. 2.6.1, упаривают на роторном испарителе до объема 7-10 см³ при температуре 40°С Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 см³, приливают 15 см³ бидистиллированной воды, 20 см³ гексана и смесь встряхивают в течение 1 мин. Верхний органический слой отбрасывают. Водную фазу подкисляют 1 н соляной кислотой до pH 2, переносят в делительную воронку, прибавляют 20 см³диэтилового эфира и смесь встряхивают 1мин. Собирают органический слой, а экстракцию водной фазы повторяют дважды по 10 см³ диэтилового эфира. Объединенную органическую фазу пропускают через слой безводного сульфата натрия и выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30°С

2.6.2.2. Очистка на патронах с силикагелем Остаток в колбе, полученный после упаривания очищенных по п.

2.6.2.1. экстрактов, растворяют в 2 см³ этилацетата и раствор переносят на предварительно промытый 3 см³ этилацетата концентрирующий патрон Bond Elut . Затем патрон промывают двумя порциями по 2 см² этилацетата и двумя порциями по 2 см³ элюента №1 (смеси этилацетат-метанол = 80:20). Элюаты отбрасывают. Хизалофоп-П элюируют 4 см³ элюента №2 (смеси этилацетат-метанол = 60:40). Элюат собирают в грушевидную колбу-концентратор и выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30°С

Сухой остаток растворяют в 1.25 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ и 10 мм⁵ вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.3. Условия хроматографирования Жидкостный хроматограф с УФ-детектором Acuity (Waters, USA). Колонка стальная длиной 10 см, внутренним диаметром 2.1 мм, заполненная октадецилсиликагелем зернением 1.7 мкм (ВЕН С18). Температура колонки 30±1°С

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0.005М ортофосфорная кислота (50:50). Скорость потока элюента 0.25 см³/мин.

Рабочая длина волны 235 нм.

Дозируемый объем 10 мм³.

Линейный диапазон детектирования 1-10 нг.

Время удерживания хизалофоп-П кислоты 4,05±0,05мин.

Ю

МУК 4.1.2336-08

2.7. Обработка результатов анализа Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание хизалофоп-П кислоты в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S₂ С • V • п

S.-P

где Sp высота (площадь) пика хизалофоп-П в стандартном растворе, мм (мвсек);

S₂ - высота (площадь) пика хизалофоп-П в анализируемой пробе, мм (мв сек);

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г;

С - концентрация стандартного раствора хизалофоп-П, мкг/см³.

п - коэффициент, учитывающий отбор аликваты экстракта (п=2 для зерна сои, зеленой массы и семян рапса; п=1 для масла сои и рапса).

Содержание остаточных количеств хизалофоп-П в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор хиза-лофоп-П 1 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ

Пересчет на содержание хизалофоп-П-этила (Х|) проводят по формуле: Х|= 1,08Х

3. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости(1):

2- |Х,-Х₂|100

------------<г    (I)

(Х, + Х₂)

где Х|, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг; г - значение предела повторяемости (г = 2.8а_г).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

11

МУК 4.1.2336-08

4. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(X ± Л) мг/кг при вероятности Р=0.95,

где X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

А - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

Д = 6*Х/Ю0,

6 - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0.005 мг/кг*, где *-0.005 мг/кг - предел обнаружения).

5. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

5.1.    Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

5.2.    Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки С^должна удовлетворять условию:

C# = А _я,х ⁺ А_{я Х} ,

где ± А я.х (± Д_я.х ) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

Д_я = ± 0.84 Д . где Д - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

МУК 4.1.2336-08

Д = 5*Х/100,

6 - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К* рассчитывают по формуле:

К« = Х'-Х-С_а,

где X', X, Сг - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п.4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

К = V Д²л^с + Д²д.х Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|К_к|<К,    (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

5.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости

(R):

2* | X, -Хг| * 100

--------------<R,    (3)

(Х, + Х₂)

где Х_ь Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций).

13

6. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности» установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками необходимо соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и требования инструкций по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

7. Требования к квалификации оператора

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п.5.

14

ББК 51.21 0-60

0-60    Определение    остаточных    количеств    хизапофоп-П-

этила в зеленой массе рапса, семенах и масле рапса и сои по основному метаболиту хизалофоп-П кислоте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 14 с.

1.    Разработаны Всероссийским НИИ зашиты растений (В.И. Довженко, И.А. Цибульская, И.К. Журкович, Н.В. Луговкина, Н.Г. Ковров).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по защите прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 декабря 2007 г. № 3).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онишенко 15 февраля 2008 г.

4.    Введены в действие с 10 апреля 2008 г.

5.    Введены впервые.

ББК 51.21

Формат 60x88/16    Печ.    л.    1,0.

Тираж 200 эю.

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., д. 18/20

Тиражировано отделом издательского обеспечения Федерального центра гигиены и эпидемиологам Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Отделение реализации, тел ./факс 952-50-89

€> Роспотребнадзор, 2009 © Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009

МУК 4.1.2336-08

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный Государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

15 февраля 2008 г.

Дата введения: 10 апреля 2008 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств хизалофоп-П-Этила в зеленой массе рапса, семенах и масле рапса и сои по основному метаболиту хизалофоп-П кислоте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2336-08

1. Вводная часть

Краткая характеристика препарата:

Действующее вещество (д.в.): хизалофол-П-этил.

Название д.в. по номенклатуре ИЮПАК: (Л)-2-[4-[(6-хлор-хиноксалин-2-илокси)-фенокси] пропионовой кислоты этиловый эфир. Структурная формула д.в.:

Эмпирическая формула д.в.: C19H17CIN2O4.

Молекулярная масса д.в.: 372,8.

Химически чистое вещество: светло-коричневые кристаллы.

3

Температура плавления д.в.: 76-77°С

Давление пара д.в. при 20°С: 1.1-КГ¹ мПа.

Растворимость д.в. (г/л) при 20°С: в воде - 0,0004, в гексане - 5,0, этаноле - 22, ксилоле - 360, ацетоне - 650.

Стабильность д.в.: устойчив к действию света и при нагревании, разлагается до хизалофоп-П кислоты в щелочной среде. В почве разлагается до хизалофоп -П кислоты, To.s< 1 дня.

Острая пероральная токсичность препаратов (LDso) для крыс -1180-1210 мг/кг, для мышей - 1750-1800 мг/кг. Не оказывает раздражающего действия на кожу.

Гигиенические нормативы: ВМДУ в сое (семена, масло) -0,05 мг/кг.

Область применения: гербицид системного действия, применяется для борьбы с однолетними и многолетними злаковыми сорняками на различных культурах, в том числе на посевах сои и рапса.

Краткая характеристика хизалофоп-П кислоты.

Название по номенклатуре ИЮПАК: (Я)-2-[4-[(6-хлорхиноксалин-2-илокси)фен-окси) пропионовая кислота.

Структурная формула:

Эмпирическая формула д.в.: С₁₇Н,зС1Ы₂04.

Молекулярная масса д.в.: 344,8.

2. Метод определения хизалофоп-П-этила в зеленой массе рапса, семенах и масле рапса и сои по основному метаболиту хизалофоп-П кислоте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1. Область применения и принцип метода Настоящий документ устанавливает метод определения остаточных количеств хизалофоп-П-этила в зеленой массе рапса, семенах и масле

МУК 4.1.2336-08

рапса и сои в диапазоне концетраций 0,025-0,25 мг/кг. Метод основан на количественном определении хизалофоп-П кислоты, основного метаболита хизалофоп-П-этила, и включает извлечение остаточных количеств хизалофоп-П кислоты из анализируемого объекта органическими растворителями, очистку экстракта перераспределением в системе несме-шивающихся растворителей и на патронах с силикагелем (Bond Elut). Количественное определение проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектором.

2.1.2. Избирательность метода Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографического анализа.

2.1.3. Метрологические характеристики При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р=0.95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Объект анализа Диапазон определяемых концентраций, мг/кг Показатель точности (граница относительной погрешности), ±6. % Стандартное отклонение повторяемости, о„ % Предел повторяемости, г.% Предел воспроиз водимо сти, R, % Зеленая масса рапса 0.025-0.1 50 4.6 12.9 15.5 -«- 0.1-0.25 25 3.6 10.1 12.1 Семена рапса 0.025-0.1 50 4.8 13.4 16.0 -«- 0.1-0.25 25 3.8 10.6 12.7 Масло рапса 0.025-0.1 50 5.0 14.0 16.8 -«- 0.1-0.25 25 4.2 11.8 12.9 Зерно сои 0.025-0.1 50 4.6 12.9 14.2 0.1-0.25 25 5.2 14.6 17.5 Масло сои 0.025-0.1 50 4.6 12.9 15.5 0.1-0.25 25 5.3 14.8 17.7

5

МУК 4.1.2336-08

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (п=20) приведены в таблице 2.

Таблица 2

Полнота извлечения, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для о = 20, Р « 0.95

Анализи руемый объект	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение, S,%	Доверительный интервал среднего результата, ±, %
Зеленая масса	0.025	0.025-0.25	80.5	6.1	5.9
Семена рапса	0.025	0.025-0.25	81.5	5.2	4.9
Масло рапса	0.025	0.025-0.25	85.4	5.3	5.1
Семена сои	0.025	0.025-0.25	82.0	6.4	6.2
Масло сои	0.025	0.025-0.25	83.7	5.4	5.3

2.2. Реактивы, растворы, материалы Аналитический стандарт хизалофоп-П кислоты.

Ацетон, осч, ТУ 2633-004-11291058-94.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87. Вода бидистиллированная, ГОСТ 7602-72. н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный. Кислота ортофосфорная, хч, ГОСТ 6552-80; 2М и 0.005М водный раствор.

Натрий сернокислый б/в, чда, ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, чда, ГОСТ 4233-77.

Соляная кислота, хч, ГОСТ 3118-77.

Спирт метиловый, хч, ГОСТ 6995-77.

Стекловата.

Фильтры бумажные, красная лента, ТУ 2642-001-42624157-98. Этиловый эфир уксусной кислоты, хч, ГОСТ 22300-76.

Эфир диэтиловый, ОСТ 84-2006-88.

Элюент № 1 для концентрирующего патрона: смесь этилацетат -метанол (80:20).

Элюент Jfe 2 для концентрирующего патрона: смесь этилацетат - мет-нол (60:40, по объему).

Концентрирующие патроны Bond Elut марки SI Silica В, 500 мг (Varian) или заполненные силикагелем марки Kieselgel 60 (0.040-0.063) мм.

6

МУК 4.1.2336-08

Подвижная фаза для ВЭЖХ: ацетонитрил - 0.005М ортофосфорная кислота (50:50).

2.3. Приборы, аппаратура, посуда Жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы «Waters» с быстро-сканирующим УФ детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или хроматограф «Breeze» с УФ-детектором или аналогичный.

Колонка ACQUITY UPLC ВЕН С-18, (100x2.1) мм, 1,7 мкм (Waters).

Аппарат для встряхивания, ТУ 64-1-1081-73 или аналогичный.

Баня ультразвуковая ^нСерьга^и УЗМ002 или аналогичная.

Весы аналитические типа ВЛА-200, ГОСТ 24104-2001.

Воронки делительные емкостью 250 и 500 см³, ГОСТ 25336-82. Воронки химические конусные, ГОСТ 25336-82.

Индикаторная бумага универсальная, ТУ 6-09-1181-76. Колбы-концентраторы емкостью 100 и 250 см³, ГОСТ 25336-82. Колбы плоскодонные емкостью 100 и 300 см³, ГОСТ 25336-82. Колбы мерные со шлифом емкостью 25, 50, 100 см³, ГОСТ 1770-74. Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.

Ротационный вакуумный испаритель типа ИР-1 или аналогичный. Пипетки мерные емкостью 1,2, 5 и 10 см³, ГОСТ 20292-74. Пробирки мерные со шлифом емкостью 5,0 см³, ГОСТ 1770-74. Стаканы химические на 100, 200 и 500 см³, ГОСТ 25336-82. Установка для упаривания растворителей в токе азота.

Шприц для ввода образцов в концентрирующий патрон.

2.4. Подготовка к определению

2.4.1. Подготовка растворителей и приготовление растворов Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40°С до объема 1,0 см³ и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

Для приготовления 2М раствора ортофосфорной кислоты 200 г 98% (или 225 г 87%) кристаллической Н₃Р0₄ помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в 600 см³ дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7

МУК 4.1.2336-08

Для приготовления 0.005М раствора ортофосфорной кислоты 2.5 см³ 2М раствора Н3РО4 вносят в мерную колбу на 1 дм³ и доводят до метки деионизированной бидистиллированной водой.

Для приготовления подвижной фазы в колбе емкостью 1 дм³ смешивают 500 см³ ацетонитрила с 500 см³ 0.005М раствора ортофосфорной кислоты.

2.4.2. Кондиционирование колонки Перед началом анализа колонку (ВЕН С-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0.25 см³/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1-2 часов.

2.4.3. Приготовление стандартных растворов Основной раствор хизалофоп-П кислоты с содержанием 100 мкг/см³ готовят растворением в ацетонитриле 0,01 г аналитического стандарта в мерной колбе емкостью 100 см³. Раствор хранят в холодильнике при температурю +4-6°С не более двух недель.

Градуировочные растворы с концентрациями 0.1 , 0.2, 0.5, 0.75 и 1.0 мкг/см³ готовят из основного стандартного раствора хизалофоп-П кислоты последовательным разбавлением подвижной фазой для ВЭЖХ непосредственно в день проведения анализа.

При определении полноты извлечения хизалофоп-П-этила из модельных матриц используют растворы, приготовленные из основного стандартного раствора последовательным разбавлением ацетонитрилом.

2.4.4. Построение калибровочного графика Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 10 мкл приготовленных по п.2.4.2, растворов, содержащих хизалофоп-П кислоту. Осуществляют не менее трех параллельных измерений и находят среднее значение высоты (площади) хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты (площади) хроматографического пика в мм (мв сек) от концентрации хизалофоп-П кислоты в рабочем растворе в мкг/см³.

2.4.5. Подготовка концентрирующего патрона для очистки экстракта

Концентрирующий патрон промывают последовательно с помощью шприца 5 см⁵ бидистиллированной воды и 5 см³ацетонитрила со скоро-

8

МУК 4.1.2336-08

стью 5 см³/мин. Затем промывают патрон 3 см³ этил ацетата. Элюаты отбрасывают.

2.5. Отбор и хранение проб Отбор проб семян рапса и сои производится в соответствии с ГОСТ 10852-86. «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб». Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Масло рапса и сои хранят в холодильнике при температуре 0-4°С в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.

2.6. Проведение определения

2.6.1. Экстракция хизалофоп-П

2.6.1.1. Зерно сои и зеленая масса и семена рапса Навеску измельченных семян или зеленой массы рапса (10 г) помещают в плоскодонную колбу емкостью 250 см³ и добавляют 100 см³ смеси ацетонитрил-бидистиллированная вода (80:20, по объему) и помещают в УЗ-баню на 10 мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Растительный материал повторно экстрагируют 50 см³ той же смеси на УЗ-бане в течение 5 мин.

Из объединенного экстракта отбирают аликвоту (около 70 см³), соответствующую 5 г зерна сои, семян или зеленой массы рапса. Дальнейшую очистку проводят по п.2.6.2.

2.6.1.2. Масло сои и рапса Навеску масла (5 г) растворяют в 20 см³ гексана в конической колбе на 150 см³, затем приливают 50 см³ 80%-ного ацетонитрила и эмульсию энергично перемешивают в течение 30 мин на аппарате для встряхивания. Ацетонитрильный слой осторожно декантируют в делительную воронку емкостью 200 см³, а к оставшемуся маслу добавляют 50 см³ 80%-ного ацетонитрила и эмульсию перемешивают на аппарате для встряхивания 30 мин. Эмульсию количественно переносят в ту же делительную воронку, которую помещают в холодильник на 30 мин для четкого разделения слоев. Отделяют ацетонитрильную фазу и пропускают ее через слой ваты в грушевидную колбу емкостью 200 см³. Дальнейшую очистку проводят по п. 2.6.2.

9

1