Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств фосэтил алюминия в ягодах и соке винограда методом капиллярной газожидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2273—07

Издание официальное

Москва • 2009

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.1. Методы контроля. Химические факторы

Определение остаточных количеств фосэтил алюминия в ягодах и соке винограда методом капиллярной газожидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2273-07

МУК 4.1.2273-07

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79 г.) и правилами, определенными ГОСТом 25896-83 «Виноград свежий столовый».

Пробы ягод анализируют в день отбора или замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре не выше -18°С.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция

9.1.1.    Ягоды. Образец растительного материала массой 20 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 см³, добавляют 80 см³ смеси метанол-вода (1:1, по объему) и гомогенизируют 3 мин. при 10000 об/мин. Суспензию центрифугируют при 6000 g в течение 5 минут. Над осадочную жидкость декантируют через бумажный фильтр в конусной воронке в мерный цилиндр. Остаток повторно гомогенизируют с 30 см³ смеси метанол-вода (1:1) в течение 1 мин. Суспензию центрифугируют при 6000 g в течение 3 минут и надосадочную жидкость фильтруют в этот же мерный цилиндр. Измеряют объем раствора, отбирают 1/40 объема этой фракции (эквивалентна 0,5 г образца) и переносят в грушевидную колбу вместимостью 50 см³. Далее проводят метилирование экстракта по п. 9.2.

9.1.2.    Сок. К образцу сока массой 20 г приливают 20 см³ дистиллированной воды, перемешивают. Отбирают 1/40 объема раствора (эквивалентна 0,5 г образца) и переносят в грушевидную колбу вместимостью 50 см³. Далее проводят метилирование по п. 9.2.

9.2. Метилирование

Аликвоты экстрактов ягод и сока, полученных по пп. 9.1.1 и 9.1.2 и помещенных в грушевидные колбы, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре 35^бС до объема 0,1-0,2 см³. К остатку приливают 1 см* смеси изопропанол-1% H₂S0₄ (9:1, по объему) и смесь помещают в ультразвуковую ванну на 2 минуты. Затем к образцу приливают 7 см³ эфирного раствора диазометана (п. 7.2.3) и колбу закрывают пробкой. Колбу периодически встряхивают. Через 15 минут к раствору в колбе приливают 1 см³ изопропанола и содержимое упари-

11

МУК 4.1.2273-07

вают на роторном вакуумном испарителе при температуре 30°С до объема 2-2,5 см⁵. Раствор переносят в градуированную пробирку. Колбу обмывают 1 см³ изопропанола, который также переносят в пробирку. Объем раствора в градуированной пробирке доводят до 4 см³ изопропанолом.

9.3. Условия хроматографирования

Газовый хроматограф «Кристалл 2000М» с термоионным детектором на фосфорсодержащие вещества с пределом детектирования не выше 2,82x10'⁵⁴ г/см³.

Колонка капиллярная кварцевая ZB-50 (типа OV-17), длина 30 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,5 мкм, фирма Phenomenex (США).

Температура термостата испарителя - 230°С, детектора - 300°С, термостата колонки (программа: от 85°С (3 мин.) со скоростью 2°/мин до 100°С (0 мин.); со скоростью 25°/мин до 260°С (5 мин.)

Расход газов: газа-носителя (азот) - 3,1 см³/мин; водорода и воздуха к ТИД - 11,2 и 200 см³/мин., соответственно

Деление потока: 1:2

Время удерживания метального производного фосэтил алюминия: 5 мин.00 сек - 5 мин.05 сек

Объем вводимой пробы: 1 мм³.

Линейный диапазон детектирования: 0,05 - 1,0 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю площадь хроматографического пика метального производного фосэтил алюминия.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/см³, разбавляют изопропанолом.

10. Обработка результатов анализа

Содержание фосэтил алюминия рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

Н, х А х V

X =--------------,    где

Н₀х m

X - содержание фосэтил алюминия в пробе, мг/кг;

Н| - площадь пика образца, мВ^фс;

Н₀ - площадь пика стандарта, мВ*с;

МУК 4.1.2273-07

А - концентрация стандартного раствора фосэтил алюминия, мкг/см³

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования,

см³;

m - масса анализируемой части образца (г) /для ягод и сока - 0,5 г/

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (I):

2 • \х , - х , 1-100

( X

где Х|, Х₂- результаты параллельных определений, мг/кг; г- значение предела повторяемости (таблица 1), при этом г = 2.8<т_г. При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(X ± А) мг/кг при вероятности Р= 0.95,

где Л”- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Д- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

Д = 5 *Х/100,

6 - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» менее 0,4 мг/кг для ягод и сока винограда *

* -0,4 мг/кг - предел обнаружения для ягод и сока винограда

13

МУК 4.1.2273-07

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1.    Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2.    Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки с_л должна удовлетворять условию:

где ± Д_д-(±д_#-) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

Да =±0,84 Д,

где Д- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

Д =5 *Х/ 100,

5 - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

Результат контроля процедуры К* рассчитывают по формуле: К_к=Г-7-с_м где X', X ,С_д- среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п.11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг;

Норматив контроля К рассчитывают по формуле

К=л/^Л'..-+ ⁴*..г

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К*) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

IkJsk,

процедуру анализа признают удовлетворительной.

14

МУК 4.1.2273-07

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R)

2 • \х , - X , |- юо (X , + X , )

где Х|, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

14. Разработчики

Дубовая Л.В., науч. сотр.; Макеев А.М., зав. лаб., канд. биол. наук. ГНУ ВНИИ фитопатологии, 143050, Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-20.

15

ББК 51.21 0-60

0-60 Определение остаточных количеств фосэтил алюминия в ягодах и соке винограда методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 15 с.

1.    Разработаны Всероссийским научно-исследовательским институтом фитопатологии (Л.В. Дубовая, А.М. Макеев).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол X* 2 от 21.06.2007 г.).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 сентября 2007 г.

4.    Введены в действие с 10 декабря 2007 г.

5.    Введены впервые.

ББК 51.21

Формат 60x88/16    Печ. л.    1,0

Тираж 200 экз.

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., д. 18/20.

Тиражировано отделом издательского обеспечения Федерального центра гагиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Отделение реализации, телефакс 952-50-89.

© Роспотребнадзор, 2009 © Федеральный центр гигиены н эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009

МУК 4.1.2273-07

В биологически активных почвах в аэробных и анаэробных условиях фосэтил алюминий быстро разлагается со средним значением DT50 от 20 минут до 1,5 часа.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD50) для крыс - >2000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD50) для крыс - >2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс - > 1,73 мг/дм³ воздуха. LC50 для рыб >100 мг/дм³ (96 час.). Вещество нетоксично для птиц, пчел и дождевых червей.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 3,0 мг/кг/сутки;

МДУ в винограде - 0,8 мг/кг.

Область применения

Фосэтил алюминий - системный фунгицид защитного и искореняющего действия. Высоко эффективен против возбудителей болезней плодовых, овощных и декоративных культур и виноградной лозы, вызываемых грибами из класса Phycomycetes. Вещество ингибирует прорастание спор или подавляет развитие мицелия и споруляцию. Проявляет также активность против некоторых бактериальных патогенов растений. Применяется в России в качестве фунгицида на огурцах открытого грунта, луке и винограде с нормой расхода до 2 кг д.в./га и трехкратной обработкой за сезон.

1. Метрологические характеристики метода

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р=0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Анализируемый объект Диапазон определяемых концентраций мг/кг Показатель точности (граница относительной погрешности ), ±5, % Р-0,95 Стандартное отклонение повторяемости ог> % Предел повто ряемости, г.% Предел воспроизводимости, R, % Ягоды винограда более 0,1 до _LL 25 3,4 9,5 14,6

МУК 4.1.2273-07

Сок вино!рада более 0,1 до 1.0 25 2,6 7.3 П.З

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (п=20) приведены в таблице 2.

Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n=20, Р = 0,95

Анализируемый объект Метрологические параметры, Р * 0,95, п = 20 Предел обнаружения, иг/кг Диапазон определяемых концентраций мг/кг Среднее значение определения % Стандартное отклонение, S.% Доверительный интервал среднего результата, ±% Ягоды винограда 0,4 0,4-4,0 84,2 3,7 *3,4 Сок винограда 0,4 0,4-4,0 84,1 2,7 ±2,5

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с термоионным детектором (ТИД). Контроль фосэтил алюминия в матрицах осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из ягод водным метанолом и последующей дериватизации диазометаном. Виноградный сок анализируют после разбавления водой. Идентификация проводится по времени удерживания пика вещества, количественное определение -методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора капиллярной колонки и условий программирования температуры колонки.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений Газовый хроматограф «Кристалл 2000М» с ТИД Номер Госреестра (СКВ «Хроматэк», Росси*)    №    14516-95

5

МУК 4.1.2273-07

Весы аналитические ВЛА-200

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой 1Ю1 ре ш кости +/- 0,036 г

Колбы мерные вместимостью 2-50-2, 2-100-2,2-1000-2 Меры массы

Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см³ Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой вместимостью 5 см³

Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 100, 500 и 1000 см³

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Фосэтил алюминий, аналитический стандарт фирмы Байер (Германия) с содержал и ем д.в. 96,2%

Вода дистиллированная Калия гидроксид, ч.

Кислота серная концентрированная, х.ч. К-мстил-Ы-нитрозо*п-толуолсульфонамид (Мерк, Германия) или N-нитрозо-метилмочевина Спирт изопропиловый, ч.

Спирт метиловый, х.ч.

Эфир диэтиловый медицинский

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Азот газообразный (баллон), осч    ГОСТ    9293

Ванна ультразвуковая, модель D-50, фирма Branson Instr. Со. (США) Воронки конусные диаметром 60 мм    ГОСТ    25336

6

Гомогенизатор

Генератор водорода, модель SPE, фирма General Electric (США) или аналогичный

Дефлегматор елочный Колбы плоскодонные вместимостью 250 см^;

Колбы грушевидные на шлифе вместимостью 50 и 100 см³ ГОСТ 9737 Колонка кварцевая капиллярная ZB-50 (тина OV-17), длина 30 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,5 мкм, фирма Phenomenex (США) или аналогичная Компрессор (СКВ «Хроматэк», Россия)

Насос водоструйный вакуумный    ГОСТ    10696

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М    ТУ 25-11-917

или ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi (Швейцария)

Стаканы химические вместимостью 250 и 500 см³    ГОСТ    25336

Установка для перегонки растворителей

Фильтры бумажные «красная лента», обеззоленные    ТУ 6-09-1678-86

или фильтры из хроматографической бумаги Ватман ЗММ Центрифуга Т-23 (Janetzki, Германия) или аналогичная Шприц для ввода образцов для газового хроматографа вместимостью 1-10 мм³ (Hamilton, США)

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1.    При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2.    Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

7

МУК 4.1.2273*07

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

б. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

•    процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20+5)°С и относительной влажности не более 80%.

•    выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1. Очистка диэтилового эфира

Растворитель предварительно встряхивают со свежеприготовленным раствором железного купороса, а затем последовательно промывают 0,5%-ным раствором перменганата калия, 5%-ным раствором гидроксида натрия и водой, после чего сушат над хлористым кальцием и перегоняют. Перегнанный эфир хранят над гидроксидом калия.

7.2. Приготовление рабочих растворов

7.2.1. Приготовление 40%-ного водного раствора гидроксида калия

Раствор готовят под тягой, строго соблюдая технику безопасности

В химический стакан вместимостью 250 см³ помещают 40 г гидроксида калия, приливают 60 см³ дистиллированной воды и осторожно перемешивают до полного растворения осадка.

8

МУК 4.1.2273--07

7.2.2.    Приготовление 1%-ного раствора серной кислоты

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 50-60 см³ дистиллированной воды, вносят 1,05 см³ концентрированной серной кислоты, перемешивают, доводят водой до метки и вновь перемешивают.

7.2.3.    Приготовление эфирного раствора диазометана

Раствор готовят под тягой, строго соблюдая технику безопасности

В двугорлой круглодонной колбе вместимостью 100 см³, снабженной капельной воронкой, растворяют 5 г N-метил-М-нитрозо-п-толу-олсульфонамида в 30 см³ смеси диэтилового эфира и метанола (1:1, по объему). Колбу присоединяют к холодильнику, нижний конец которого снабжен алонжем с отводом, погруженным в слой эфира (100 см³) в приемной колбе, охлаждаемой смесью льда и соли. В воронку помещают 15 см³ 40%-ного раствора гидроксида калия. Реакцию начинают добавлением в реакционный сосуд раствора гидроксида калия по каплям, избегая бурного вскипания реакционной массы. Об окончании реакции судят по прекращению выделения диазометана в диэтиловый эфир. Раствор диазометана хранят в колбе с притертой пробкой в холодильнике не более пяти дней.

7.3. Подготовка и кондиционирование хроматографической колонки

Капиллярную кварцевую колонку ZB-50 (типа OV-I7) устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 270°С и скорости газа-носителя 2 см³/мин в течение 8-10 часов.

7.4. Приготовление градуировочных растворов

7.4.1.    Исходный раствор фосэтил алюминия для градуировки (концентрация 1 мг/см³). В мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают 0,052 г аналитического стандарта фосэтил алюминия, растворяют в 40 см³ дистиллированной воды, доводят объем раствора этим же растворителем до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике не более 3-х месяцев.

7.4.2.    Раствор фосэтил алюминия Ms1 для градуировки (концентрация 100 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10,0 см³ исходного раствора фосэтил алюминия с концентрацией 1 мг/см³ (п. 7.4.1),

9

МУК 4.1.2273-07

разбавляют смесью изопропанол-1% H2SO4 (9:1, по объему) до метки. Этот раствор используют для приготовления градуировочных растворов метильного производного фосэтил алюминия.

Для приготовления проб ягод и сока с внесением при оценке полноты извлечения фосэтил алюминия из исследуемых образцов используют водный раствор с концентрацией 10 мкг/см³.

Градуировочный раствор № 1 и водный раствор фосэтил алюминия хранятся в холодильнике в течение месяца.

7.4.3. Приготовление градуировочных растворов метильного производного фосэтил алюминия

Стандартные растворы метильного производного фосэтил алюминия используют для построения градуировочного графика. В грушевидную колбу вместимостью 50 см³ отбирают 1 см³ градуировочного раствора № 1, приливают 7 см³ эфирного раствора диазометана (п. 7.2.3) и колбу закрывают пробкой. Колбу периодически встряхивают. Через 15 минут к раствору в колбе приливают 1 см³ изопропанола и содержимое упаривают на роторном вакуумном испарителе при температуре 30°С до объема 2-3 см³. Раствор метильного производного фосэтил алюминия переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³. Грушевидную колбу обмывают трижды порциями по 10 см³ изопропанола, которые также переносят в мерную колбу. Объем раствора в колбе доводят изопропанолом до метки и получают градуировочный раствор № 2 с концентрацией 2,0 мкг/см³ (по кислоте). Из него последовательным разбавлением в изопропаноле готовят рабочие растворы для градуировки с концентрациями (по кислоте): 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/см³.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

7.5. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ*с) от концентрации фосэтил алюминия в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 рабочим растворам метильного производного вещества для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 1 мм³ каждого рабочего градуировочного раствора (п. 7.4.3) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.