Федора. 11,пан служба но надзору в сфере защиты нрав потребителей и благополучии человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение домоевой кислоты в морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2229—07

Определение домоевой кислоты в морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008.—11 с.

1.    Методические указания разработаны ГУ НИИ питания РАМН (В. А.Тутельян, С. А. Хотимченко, Ю. А. Коханова. Т. В. Киселева, К. И. Эллер).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Роспотребнадзора (протокол № 2 от 21 июня 2007 г.).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты нрав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 17 июля 2007 г.

4.    Введены в действие 1 ноября 2007 г.

5.    Введены впервые.

О Роспотребнадзор, 2008 СО Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008

МУК 4.1.2229—07

11. Обработка результатов

11.1. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Окончательный результат округляют до второго десятичного знака.

Содержание домоевой кислоты в пробе рассчитывают но формуле:

X = Srfp/Se, • С_ст/М • V, где X- содержание домоевой кислоты в пробе, мкг/г;

$обр. ~ площадь пика образца, см~;

S_cm, - площадь пика стандарта, см²;

('em. - концентрация стандарта, мкг/см³;

М- навеска образна, г;

V - конечный объем разведенной пробы, см³.

Таблица 1 Метролш ичсскис характеристики метола определении домоевой кислоты

Статиста чески й 11 ара метр Значения Нижний предел определения, мкг/г 0,5 Интервал надежного определения, мкг/г 0,5—200,0 Среднее значение открываемое»! (показатель правильности), % 80 Допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений ДК, полученными в одной лаборатории в одной серии измерений (сходимость), при Р 0,95 %, не должно превышать, % 7,0 Допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений ДК, выполненных в двух разных лабораториях (воспроизводимость), при Р 0,95 % не должно превышать по отношению к среднему, % 10

11.2. Если расхождение результатов двух параллельных определений (сходимость и воспроизводимость) превышает требования, указанные в таблице, то повторно проводят два новых параллельных определения.

11

МУК 4.1.2229—07

Содержание

1.    Назначение и область применения......................................................................4

2.    Общие положения.................................................................................................4

3.    Отбор и подготовка проб......................................................................................6

4.    Принцип метода....................................................................................................6

5.    Аппаратура, материалы, реактивы......................................................................6

6.    Требования техники безопасности при проведении испытаний......................7

7.    Подготовка к испытанию.....................................................................................8

7.1.    Приготовление реактивов.............................................................................8

7.1.1.    Приготовление мобильной фазы для В'ЭЖХ...................................8

7.1.2.    Приготовление калибровочных растворов.......................................8

7.1.3.    Приготовление рабочих растворов...................................................8

8.    Проведение испытания методом ВЭЖХ.............................................................9

8.1.    Подготовка образца для определения домоевой киеллоты........................9

9.    Условия хромато1рафирования (ВЭЖХ)..........................................................10

10.    Построение калибровочной кривой..................................................................10

11.    Обработка результатов.......................................................................................11

3

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

17 июля 2007 г.

Дата введения: 1 ноября 2007 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение домоевой кислоты в морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания _МУК    4.1.2229—07_

1. Назначение и область применения

1.1.    Настоящие методические указания устанавливают метод определения домосвой КИСЛОТЫ в морепродуктах на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии.

1.2.    Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также мо-гут быть использованы для производственного контроля другими испытательными лабораториями, аккредитованными в порядке, установленном Правительством Российской Федерации.

2. Общие положения

2.1. Представителем группы фикотоксинов является домоевая кислота (амнестический яд моллюсков). Основным продуцентом токсина являются диатомовые микроводоросли рода Pscudo-nitzschia. В зависимости от количества токсина, поступившего в организм, клиническая картина огравления может варьировать от гастроинтестинальных сим-томов (тошнота, рвота, диарея, боли в животе) и неврологической симптоматики (сильные головные боли, головокружение и т. д.) до иерма-

4

МУК 4.1.2229—07

нентной потери краткосрочной памяти и летального исхода. Воздействуя на глютаматные рецепторы нервной системы, токсин вызывает нейрональную дегенерацию, а морфологические изменения тканей характеризуются некрозом глубинных структур мозга (гиппокамп, миндалевидное ядро, таламус).

2.2.    В настоящее время во многих сгранах норматив содержания токсина в двустворчатых моллюсках определен на уровне нс более 20 мкг/г ткани моллюска. Содержание домоевой кислоты в крабах нормируется только для внутренних органов (не более 30 мг/кг). Известно, что распространение домоевой кислоты по пищевой цени затрагивает и другие морские организмы, в том числе ракообразных, головоногих моллюсков, рыб и даже млекопитающих (киты, морские львы, тюлени). Таким образом, источником поступления токсина в организм человека является потребление морепродуктов.

2.3.    В связи с гем, что при попадании в организм небольшого количества токсина отмечаются только нсспсцифичсскис гастроинтестинальные симптомы, возможна гиподиагностика данного отравления. Это определяет необходимость разработки доступных и падежных методов обнаружения и количественного определения домоевой кислоты, что позволит проводить надзор за содержанием этого вещества в морепродуктах и оценить риск его влияния на здоровье населения.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C15H21NO6.

Молекулярная масса: 311,14.

Количественный метод определения домоевой кислоты в морепродуктах при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии отличается низким пределом обнаружения (0,5 мкг/г), хорошей воспро-

5

изводимостью и надежностью (габл. 1 в разделе 11). Диапазон определяемых концентраций составляет 0,5—200 мкг/г. Относительная почетность измерений составляет 25 %.

3. Отбор и подготовка проб

Отбор морепродуктов осуществляется в соответствии с требова-ниями ГОСТ 7631 «Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний».

Огобранныс образцы морепродуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки либо стеклянные банки с притертыми крышками. Образцы доставляют в лабораторию для анализа сразу же после отбора проб или, в случае необходимости, замораживают и хранят при температуре не менее - 10 °С, используя для этой цели морозильники или соответствующие приспособления.

После извлечения тела моллюска из раковины его необходимо обсушить для удаления соленой воды. Измельчить образцы в приборе для грубого измельчения. Подготовка образцов из этого гомогената может быть произведена либо немедленно после измельчения, либо позднее после повторного перемешивания. Гомогенат может храниться не более месяца при температуре -10...-20 °С, в плотно закрытой емкости.

4. Принцип метода

Метод основан на экстракции домоевой кислоты из гомогенизированных тканей морепродукгов водным раствором метанола (1:1, v/v). Количество токсина определяется при помощи ЮЖХ с УФ-дстсктором в обращенно-фазном варианте.

5. Аппаратура, материалы, реактивы

Жидкостный хроматограф с УФ-дстсктором (любой марки), длина волны 242 нм.

Колонка с обращенной фазой (С 18) (Vydac 201 ГР, Supelco LC-PAH) или эквивалентная, длина 25 см, диаметр 4,6 мм, диаметр сорбента 5 мкм.

Прибор для грубого измельчения тканей (блендер).

Гомогенизатор лабораторный.

Центрифуга любого типа, обеспечивающая 4 000 об./мин.

р! 1-метр.

6

МУК 4.1.2229—07

Весы аналитические по ГОСТ 24104.

Цилиндры мерные объемом 100, 200, 500 см³ по ГОСТ 1770.

Колбы мерные на 25 см³ по ГОСТ 1770.

Колбы мерные на 500 см³ по ГОСТ 1770.

Колбы конические на шлифе 500 см³ ГОСТ 25336.

Пинетки 2,0; 5,0 и 10,0 см³ но ГОСТ 29227.

Одноканальные автоматические пипетки переменного объема 100—1000 мм³.

Одноканальные автоматические пипетки переменного объема 1,0—5,0 см³.

Пробирки центрифужные 10см³по ГОСТ 1770.

Воронки стеклянные по ГОСТ 25336.

Фильтры метанол-совместимые с диаметром пор 0,45 мкм (Macherey-Nagel), либо аналогичные.

Система для твердофазной экстракции (Macherey-Nagel, Supelco), либо аналогичная.

Патроны для твердофазной экстракции вместимостью 3 см³, содержащие 500 мг силикагеля с закрепленными четвертичными аммониевыми 1руппами (JT Baker Scientific, Supelco), либо аналогичные.

Виалы темные с винтовой крышкой объемом 2 см³ (Supelco), либо аналогичные.

Стекла часовые по ГОСТ 14183.

Ацетонизрил по ТУ 6-09-3534.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Метанол (спирт метиловый) по ГОСТ 6995.

Трифторуксусная кислота (снеетрофогомстрического качества), хч. Лимонная кислота (моногидрат), хч, по ГОСТ 3652.

Натрий лимоннокислый трехзамещенный 2-водный, хч.

Аммиак водный, хч, по ГОСТ 3760.

Домоевая кислота-стандарт, импорт.

6. Требования техники безопасности при проведении испытаний

Помещение, в котором проводится определение домоевой кислоты, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Все операции анализа необходимо проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты.

7

7. Подготовка к испытанию

7.7. Приготовление реактивов 7.1.1. Приготовление мобильной фазы дли ВЭЖХ

Подкислить воду трифторуксусной кислотой до значения pH 2,5. Градиентная мобильная фаза для ВЭЖХ:

Время (мин) Соотношение компонентов мобильной фазы вода ацетонитрил метиловый спирт 0,0 89 10 1 15,0 85 14 1 20,0 89 10 1 25,0 89 10 1

7.1.2. Приготовление калибровочных растворов

Стандарт домоевой кислоты (5 мг) аккуратно растворить в мерной колбе на 25 см³ в растворе (ацетонитрил : вода - 1 : 9) и довести до метки для получения стандартного раствора 200 мкг/ см³ (стандартный раствор 1).

Пинеткой отобрать 2 см³ стандартного раствора 1, внести его в мерную колбу и довести до 25 см³ раствором (ацетонитрил : вода -1:9) для получения стандартного раствора 16 мкг/ см³.

Повторить эту процедуру еще два раза для получения стандартных растворов с концентрацией 1,28 и 0,1024 мкг/см³. Калибровочная кривая представлена на рис. 1 (раздел 10).

Хранить не более 1 года при температуре - 12 °С в темноте. Заморозить неиспользованные растворы. При повторном использовании довести до комнатной температуры.

7.1.3. Приготовление рабочих раст воров

•    раствор для экстракции: смешать равные количества перегнанного метанола и воды (из расчета 6 см³ метанола и 6 см³ воды на 1 образец (3,0 г ткани),

•    раствор для патронов твердофазной экстракции и промывания петли: смешать ацетони грил и воду (ацетонитрил : вода - 1 : 9),

•    цитрат ный буфер (0,5 М, pH 3,2): растворить 52,55 г моногидрата лимонной кислоты в 400 см³ дистиллированной воды. Довести pH раствора до значения 3,2 концешрированным раствором аммиака водного.

МУК 4.1.2229—07

Добавить 50 см³ ацетонитрила и довести до 500 см³ дистиллированной водой.

Также этот буфер может быть приготовлен следующим обратом: растворить 40,4 г моногидрата лимонной кислоты и натрий лимоннокислый трехзамещенный 2-водный (17,0 г) в 400 ем³ дистиллированной воды, добавить 50 см³ ацетонитрила и довести до 500 см³ дистиллированной водой.

8. Проведение испытания методом ВЭЖХ

8.1. Подготовка одр ища для определения домоевои кис. йоты

Экстракция: взвешивают 3,0 г измельченной ткани моллюсков. Добавляют 12,0 см³ экстракционного растворителя (метанол : вода -1:1) и гомогенизируют 3 мин при 2 000 грш. Обязательна тщательная промывка гомогенизатора для предупреждения смешивания образцов. Центрифугируют при 4 000 об./мин в течение 10 мин. Отфильтровывают 5— 10 см³ надосадочной жидкости через сухой мстанол-совмест имый фильтр (0,45 мкм) в сосуд с завинчивающейся крышкой (виалу) и плотно закупоривают . Экстракт необходимо использоват ь в течение 2—3 ч, в противном случае, хранить при температуре -Ю...-20°С, в плотно закрытой емкости.

Образцы экстрактов вводятся в систему либо непосредственно после фильтрации неочищенного экстракта, либо очищения его на патронах твердофазной экстракции. Эго обеспечивает выделение домоевой кислоты и родственных компонентов из экстракта.

Условия для патрона для твердофазной экстракции: пропускают 6 см³ метанола, затем 3 см³ воды и 3 см³ экстрагирующего раствора (мс-ганол : вода -1:1) через патрон перед его использованием, либо проверкой. Патрон не должен высыхать ни на каком этапе процедуры.

Очистка на патроне твердофазной экстракции: помещают 2,0 см³ отфильтрованной надосадочной жидкости на поверхность патрона и дают медленно стекать (1 капля/с). Останавливают ток, как только мениск образца достигнет верхней точки упаковки патрона. Промывают патрон (1 капля/с) 2 см³ раствора для промывания (ацетонитрил : вода -1 : 9). Останавливают ток, как только мениск образца достигнет верхней точки упаковки патрона. Добавляют 0,5 см³ нитратного буферного элю-ента и осторожно позволяют стекать до момента, пока мениск образца нс достигнет верхней точки упаковки патрона. Помещают виалу для

сбора элюата под патрон. Элюируют домосвую кислоту 2 см³ нитратного буфера.

Перед отбором аликвоты полученный раствор размешать. Образцы должны быть использованы как можно быстрее, либо храниться в тщательно закрытой емкости в холодильнике, нс замораживая, в течение 1 недели.

9. Условия хроматографирования (ВЭЖХ)

В жидкостной хроматограф с колонкой (ODS, С|₈) 5 мкм (250 х 4,6 мм), УФ-дстектором при X = 242 нм, температура колонки 40 °С; скорость потока мобильной фазы 1,0—1,5 см³/мин; петля 20 мм³, используя градиент мобильной фазы вода-ацстонитрил-мстанол (см. п. 7.1.1) вводят 20 мм³ стандартного раствора домосвой кислоты. В тех же условиях вводят экстракт образца (морепродукта).

10. Построение калибровочной кривой

На рис. 1 представлена градуировочная характеристика, выражающая зависимость площади хроматографического пика от концентрации домосвой кислоты в растворе.

20000000

5000000    •

0    50    100    150    200

Концентрация (мкг/ см³)

Рис. 1. Зависимость площади хроматографического пика от концентрации домосвой кислоты в растворе