Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств феназахина в ягодах винограда и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2213—07

Издание официальное

Москва • 2009

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.1. Методы контроля. Химические факторы

Определение остаточных количеств феназахина в ягодах винограда и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2213-07

МУК 4.1.2213-07

7.5.2.    Раствор № 1 феназахина для градуировки (концентрация 10 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора феназахина с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.5.1), разбавляют ацетонитрилом до метки. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

7.5.3.    Рабочие растворы №2-5 для градуировки и внесения (концентрация 0.1 - 1.0 мкг/см³). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают по 1.0, 2.0, 5.0 и 10.0 см³ раствора №1 с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 7.5.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.3., тщательно перемешивают, получают рабочие растворы №№ 2 - 5 с концентрацией феназахина 0.1, 0.2, 0.5 и 1.0 мкг/см³, соответственно. Растворы хранятся в холодильнике в течение 10-ти дней.

Эти растворы используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения феназахина из исследуемых образцов методом «внесено-найдено».

7,6. Установление градуировочных характеристик

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ*сек) от концентрации феназахина в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки №№ 2-5.

В инжектор хроматографа вводят 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

7.7. Подготовка колонки с оксидом алюминия для очистки экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8-10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, помещают в колонку 5 г оксида алюминия (постукивая резиновой грушей о стенки колонки для уплотнения сорбента), пропускают через колонку 15-20 см³ гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1,5 см. Колонка готова к работе.

МУК 4.1.2213-07

7.8. Проверка хроматографического поведения феназахина на колонке с оксидом алюминия

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора № 1 для градуировки с концентрацией феназахина 10 мкг/см³ (п. 7.5.2.), растворитель упаривают досуха. Остаток растворяют в 3 см³ гексана и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают трижды порциями гексана по 3 см³, которые также наносят на колонку. Промывают колонку последовательно порциями по 25 см³ вначале гексаном, затем смесью гексан-этилацетат (9:1, по объему), элюат отбрасывают.

Далее колонку промывают 50 см³ смеси гексан-этилацетат (7:3, по объему) со скоростью 1-2 капли в сек. Фракционно (по 10 см³) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 2 см³ подвижной фазы, подготовленной по п. 7.3, анализируют по п. 9.4.

Фракции, содержащие феназахин, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.

ПРИМЕЧАНИЕ: Проверку хроматографического поведения феназахина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

8. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами 25896-83 «Виноград свежий столовый, ТУ», 28472-90 «Виноград свежий ручной уборки для консервирования. Требования при заготовках и поставках», 26313-84 «Продукты переработки плодов и овощей», «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (№ 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы ягод винограда и виноградного сока хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 10-ти дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18°С.

И

МУК 4.1.2213-07

9. Выполнение определения 9.L Экстракция

9.1.1. Виноград

Образец измельченных ягод винограда массой 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 см³, вносят 75 см³ ацетонитрила, гомогенизируют в течение 3-х минут, затем помещают на встряхи-ватель на 30 мин. Экстракт фильтруют через складчатый бумажный фильтр, сливая способом декантирования в колбу для упаривания вместимостью 250 см³. Экстракцию пробы повторяют новой порцией ацетонитрила объемом 50 см³, встряхивая 20 мин. Экстракт также фильтруют в колбу для упаривания, концентрируют на ротационном вакуумном испарителе (при температура 40°С) до водного остатка (около 10 см³) и подвергают очистке по п. 9.2.

9.1.2. Виноградный сок К образцу сока массой 20 г в конической колбе (с пришлифованной пробкой) вместимостью 250 см³ добавляют 75 см³ ацетонитрила, интенсивно встряхивают в течение 5 мин, помещают в холодильник (4°С) на 1 час. Экстракт фильтруют через складчатый бумажный фильтр, сливая способом декантирования в колбу для упаривания вместимостью 250 см³. Экстракцию пробы повторяют новой порцией ацетонитрила объемом 50 см³, встряхивая 2 мин и выдерживая в холодильнике (4°С) 30 мин. Экстракт также фильтруют в колбу для упаривания, концентрируют на ротационном вакуумном испарителе (при температура 35-40°С) до водного остатка (около 10 см³) и подвергают очистке по п. 9.2.

9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Водный остаток, полученный по п. 9.1.1. или 9.1.2., переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³. Колбу ополаскивают 75 см³ 5%-ного раствора хлористого натрия, который также переносят в делительную воронку. Вносят в делительную воронку 30 см³ гексана, интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отделяют, фильтруют через безводный сульфат натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 150 см³. Операцию экстракции повторяют еще дважды, используя по 20 см³ гексана. Объединен-

МУК 4.1.2213-07

ную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают до объема 3-5 сиг и подвергают дополнительной очистке на колонке поп. 9.3.

9.5. Очистка экстракта на колонке с оксидом алюминия

Остаток в круглодонной колбе, полученный после упаривания (п. 9.2.), наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают трижды порциями гексана по 3 см³, которые также наносят на колонку. Промывают колонку последовательно порциями по 25 см³ вначале гексаном, затем смесью гексан-этил ацетат в соотношении 9:1 (по объему), элюат отбрасывают.

Феназахин элюируют с колонки 30 см³ смеси гексан-этилацетат (7:3, по объему) со скоростью 1-2 капли в сек, собирая элюат в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35°С, остаток в колбе растворяют в 1 см³ подвижной фазы, анализируют содержание феназахина по п. 9.4.

9.4. Условия хроматографирования

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором (фирмы Waters, США)

Хроматографическая колонка стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Symmetry® С18, зернением 5 мкм Температура колонки: комнатная Скорость потока элюента: 1 см³/мин Рабочая длина волны: 263 нм Объем вводимой пробы: 20 мм³ Чувствительность: 0,003 ед. абсорбции на шкалу Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (9:1, по объему) Ориентировочное время выхода феназахина: 7,8 - 8,0 мин Линейный диапазон детектирования 2 - 20 нг Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.3, не более чем в 50 раз.

10. Обработка результатов анализа

Содержание феназахина в пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

13

МУК 4.1.2213-07

C*V

X =---------- ,    где

m

С - концентрация феназахина, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования,

см³;

m - масса анализируемого образца, г.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

(1)

где Xi, Х₂- результаты параллельных определений, мг/кг; г- значение предела повторяемости (таблица 1), при этом г = 2.8а_г. При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(X ± А) мг/кг при вероятности Р= 0.95,

где X- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Д- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

Д = 6*Х/100,

где б - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

МУК 4.1.2213-07

«содержание феназахина в пробе менее 0,005 мг/кг»*

* - 0,005 мг/кг - предел обнаружения.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецинзионность) методов и результатов измерений».

13.1.    Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2.    Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки С, должна удовлетворять условию:

где ± д_#^(±д_л?) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой), мг/кг, при этом:

А_л =±0,84 А,

где А- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

А = Ъ *Х/ 100,

где 5CJ- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном определяемых концентраций, таблица 1), %.

Контрольный параметр процедуры К_к рассчитывают по формуле:

К_к= X' - X - С_Л,

где X, X,С_д среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п.11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг;

Норматив контроля К рассчитывают по формуле

15

ББК 51.21 0-60

0-60 Определение остаточных количеств феназахина в ягодах винограда и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 16 с.

1.    Разработаны Федеральным научным центром гигиены нм. Ф.Ф. Эрисмана (авторы Юдина Т.В., Федорова Н.Е., Волкова В.Н., Ларькина М.В.)

2.    Рекомендованы к утверждению комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол Jft I от 29.03.2007).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 25 мая 2007 г.

4.    Введены впервые.

ББК 51.21

Формат 60x88/16    Печ.    л.    1,0

Тираж 200 экз.

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковскнй пер., д. 18/20.

Тиражировано отделом издательского обеспечения Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Отделение реализации, телУфакс 952-50-89.

© Роспотребнадзор, 2009 © Федеральный центр гигнены н эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009

МУК 4.1.2213-07

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный Государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

25 мая 2007 г.

Дата введения: 15 августа 2007 г.

4.1. Методы контроля. Химические факторы

Определение остаточных количеств феназахина в ягодах винограда и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1. 2213-07

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации феназахина в ягодах винограда и виноградном соке в диапазоне 0,005 - 0,05 мг/кг.

Феназахин - действующее вещество препарата ДЕМИТАН, КС (200 г/л), фирма производитель «Кромптон», Англия 4-[2-(4-трет-бутилфенил)этокси]хиназолин (IUPAC)

C20H22N2O Мол. масса 306,4

Белое кристаллическое вещество без запаха, либо с легким органическим запахом. Температура плавления 77,5-80°С. Давление паров при 25°С: 3,4*10'¹ мПа. Растворимость в органических растворителях

МУК 4.1. 2213-07

при 25°С (г/дм³): хлороформ - более 500, толуол - 500, ацетон - 400, метанол, изопропанол - 50, ацетонитрил, гексан - 33. Растворимость в воде при 20°С - 0,22 мг/дм³. Коэффициент распределения н-октанол -вода: K_ow logP = 5,51. Стабильность в водных растворах при действии солнечного света (LD ₅₀) - 15 дней (pH 7, 25°С).

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая пероральная токсичность (LD 50) для крыс - 134-138 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD 50) для кроликов > 5000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LK50) для крыс - 1,9 мг/дм³.

Область применения препарата

Феназахин рекомендуется к применению в качестве акарицида против паутинных и галлообразующих клещей на яблоне, груше и винограде в личных подсобных хозяйствах.

МДУ феназахина в винограде 0,01 мг/кг.

X. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и её составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р=0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1 ²

Метрологические параметры

Анализи руемый объект Диапазон определяемых концентраций, мг/кг Показатель точности (граница относительной погрешности), ±6, %Р-0.95 Стандартное отклонение повторяемости, о,, % Предел повторяемости, г. У. Предел воспроизводимости, R, % Виноград (ягоды) от 0,005 до 0,01 вкл. 100 63 17 21 более 0,01 до 0.05 50 6,0 17 20 Виноградный сок от 0,005 до 0,01 вкл. 100 5,9 16 19 более 0,01 до 0.05 50 5,8 16 19

Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, довери тельный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (п = 20) приведены в таблице 2.

МУК 4.1.2213-07

Таблица 2

Анализируемый объект Метрологические параметры Р - 0,95. п т 20 Предел обнару жения, мг/кг Диапазон определяемых концентраций мг/кг Среднее значение определения % Стандартное отклонение, S, % Доверительный интервал среднего результата, +.% Виноград (ягоды) 0,005 0,005 - 0,05 84,2 5.7 7.1 Виноградный сок 0,005 0,005 - 0,05 85,8 5,5 6,8

2. Метод измерения

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемой пробы ягод винограда и виноградного сока - ацетоном, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на колонке с флориси-лом.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки. Нижний предел измерения в хроматографируемом объеме пробы: 0,25 нг.

В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии компонентов препаративной формы, включая манкоцеб.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детек- Номер в Государственном тором с переменной длиной волны (фирмы Waters, реестре средств измерений США)    15311-02

Весы аналитические ВЛА-200    ГОСТ 24104

Весы лабораторные общего    назначения, с наибольшим    ГОСТ 7328

пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г

Колбы мерные вместимостью    2-100-2,2-500-2,    2-1000-2    ГОСТ 1770

Меры массы    ГОСТ 7328 ³

МУК 4.1.2213-07

Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимо- ГОСТ 29227 стью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см³

Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой ГОСТ 1770 вместимостью 5 и 10 см³

Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью ГОСТ 1770 25, 50,100,250, 500 и 1000 см³

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Фсназахин с содержанием действующего вещества 99,3% (Дау Агросайнс, Швейцария)

Алюминий оксид, активированный, нейтральный, для колоночной хроматографии, 50-200 мкм («Акрос Органике»,

Бельгия)

Ацетонитрил для хроматографии, хч    ТУ-6-09-4326-76

Вода бидистиллнроваяная, деионизованная или перегнанная над КМпО<

н-Гексан, хч    ТУ-6-09-3375

Натрий сернокислый,    безводный, хч    ГОСТ 4166

Натрий хлористый, хч    ГОСТ 4233

Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат), ч    ГОСТ 22300

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Аквадистиллятор

Аппарат для встряхивания типа АВУ-бс Баня водяная

Бумажные фильтры "красная лента", обеззоленные Воронки делительные вместимостью 250 см³ Воронки конусные диаметром 30-37 и 60-70 мм Гомогенизатор Груша резиновая

6

МУК 4.1.2213-07

Колбы плоскодонные вместимостью 100, ISO и 250 см³ ГОСТ 9737 Колбы круглодокные на шлифе вместимостью 10, 100 и ГОСТ 9737 250 см³

Мембранные фильтры капроновые, диаметром 47 мм Набор для фильтрации растворителей через мембрану Насос водоструйный вакуумный    ГОСТ    10696

Колонка хроматографическая стеклянная длиной 30 см, внутренним диаметром 8-10 мм

Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок нс менее 50

Ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi,

Швейцария

Стаканы химические, вместимостью 100 и 400 см³    ГОСТ    25336

Стекловата

Стеклянные палочки

Термометр контактный    ГОСТ 9871

Установка для перегонки растворителей Хроматографическая колонка стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Symmetry®

С18, зернением 5 мхм

Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50-100 мм³

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1.    При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2.    Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превы-

МУК 4.1.2213-07

шать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

•    процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20±5)°С и относительной влажности не более 80%.

•    выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление раствора хлористого натрия, градуировочных растворов, растворов внесения, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с оксидом алюминия для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонке.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1. Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия. ⁴

МУК 4.1.2213-07

7.1.2. н-Гексан

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.3. Этилацетат

Этил ацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.2. Приготовление 5%-ного раствора хлористого натрия

В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 25 г хлористого натрия, растворяют в 300-350 см³ дистиллированной воды, доводя водой до метки, тщательно перемешивают.

7.5.    Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 900 см³ ацетонитрила, добавляют 100 см³ бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.4. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.3) при скорости подачи растворителя 1 см³/мин не менее 2-х часов до установления стабильной базовой линии.

7.5.    Приготовление градуировочных растворов

и растворов внесения

7.5.1. Исходный раствор феназахина в ацетонитриле для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,01 г феназахина, растворяют в 50-70 см³ ацетонитрила, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в морозильной камере в течение месяца.

Рабочие градуировочные растворы феназахина готовят объемным

методом путем последовательного разбавления исходного раствора. ⁵

1

2

3

4

5