Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации
Федеральная
служба по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека
4.1.
МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Обнаружение, идентификация и
количественное определение охратоксина А
в продовольственном сырье и пищевых
продуктах методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии
Методические
указания
МУК 4.1.2204-07
Москва 2007
1.
Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (академик РАМН, профессор В.А. Тутельян,
д.х.н. К.И. Эллер, к.м.н. И.В. Аксёнов).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по
санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в
сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3.
Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом
Российской Федерации Г.Г. Онищенко 20 мая 2007 г. и введены в действие с 1
августа 2007 г.
4. Введены
впервые.
СОДЕРЖАНИЕ
1. Назначение и область применения. 2
2. Общие положения. 2
3. Принцип метода. 3
4. Средства измерений, вспомогательные устройства,
посуда, реактивы и материалы.. 3
4.1. Средства измерений. 3
4.2. Вспомогательное оборудование. 3
4.3. Реактивы и материалы.. 4
5. Подготовка к выполнению измерений. 4
5.1. Приготовление стандартных
растворов охратоксина А.. 4
5.2. Приготовление фосфатного
буферного раствора, рН = 7,4. 5
5.3. Приготовление смесей
растворителей. 5
6. Отбор и подготовка проб для анализа. 5
6.1. Отбор проб. 5
6.2. Подготовка проб для анализа. 5
6.2.1. Экстракция. 5
6.2.2. Очистка экстракта. 5
7. Выполнение измерений. 6
7.1. Приготовление тестового
образца. 6
7.2. Условия хроматографирования. 6
8. Обработка результатов измерения. 6
8.1. Построение градуированной
зависимости. 6
8.2. Оформление результатов. 6
8.3. Проверка приемлемости
результатов параллельных определений. 7
9. Контроль качества результатов измерений. 7
10. Требования техники безопасности. 7
11. Требования к квалификации
исполнителя. 8
12. Условия
выполнения измерений. 8
|
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации
Г.Г. Онищенко
20 мая 2007 г.
Дата введения: 1 августа 2007 г.
|
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Обнаружение, идентификация и
количественное определение охратоксина А
в продовольственном сырье и пищевых продуктах
методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии
Методические указания
1. Назначение и
область применения
Методические указания устанавливают метод
высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) определения охратоксина А в
продовольственном сырье и пищевых продуктах и предназначены для проведения
лабораторных исследований учреждениями Федеральной службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей и благополучия человека, в организациях,
осуществляющих контроль безопасности продовольственного сырья и пищевых
продуктов.
2. Общие положения
Охратоксин А - микотоксин, продуцируемый
микроскопическими грибами родов Aspergillus и Penicillium. Основными продуцентами охратоксина А
являются A. ochraceus и P. verrucosum.
Охратоксин A (C20H18ClNO6; молекулярная масса 403,8),
представляющий собой по химической структуре 5-хлоризокумарин, связанный
пептидной связью с L-фенилаланином, хорошо растворим в
полярных органических растворителях и водном растворе гидрокарбоната натрия,
малорастворим в воде. При фотометрировании раствора охратоксина А в
толуол-уксусной кислоте (99:1) максимум поглощения наблюдается при длине волны,
равной 333 нм, при этом относительный молярный коэффициент поглощения равен 544
м2/моль.
В экспериментах in vivo показано нефротоксическое, канцерогенное, тератогенное,
эмбриотоксическое, нейротоксическое и иммунотоксическое действие охратоксина А.
Международное агентство по изучению рака классифицирует охратоксин А как
соединение, потенциально канцерогенное для человека (Группа 2В). Комитетом
экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам и контаминантам установлена величина
условно переносимого недельного поступления охратоксина А с пищей - 100 нг/кг
массы тела.
Охратоксин А выявляется
повсеместно в качестве природного загрязнителя продовольственного и кормового
зерна, кофе и какао-бобов, винограда и специй.
3. Принцип метода
Метод включает следующие этапы:
• экстракция охратоксина А из пробы смесью
ацетонитрил-вода (60:40 % об.);
• очистка экстракта на
иммуноаффинной колонке;
• определение охратоксина А с помощью ВЭЖХ
с флуориметрическим детектированием при длине волны возбуждения (lвозб.) 333 нм
и длине волны эмиссии (lэмис) 466 нм.
Диапазон определяемых
концентраций: 0,0001 - 0,016 мг/кг.
Предел количественного
определения: 0,0005 мг/кг.
Таблица
Метрологические
характеристики метода, установленные для разных концентраций охратоксина А в
пробе
Метрологические характеристики
|
Концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг
|
0,0001 - 0,001
|
> 0,001
|
Границы относительной погрешности (показатель точности)
(±d), %, Р = 0,95
|
±30,72
|
±10,92
|
Стандартное отклонение повторяемости (sr), %
|
24,56
|
8,78
|
Предел повторяемости (r), %
|
68,77
|
24,58
|
Полнота извлечения веществ, %
|
88,80
|
86,28
|
4. Средства измерений,
вспомогательные устройства, посуда, реактивы и материалы
4.1.
Средства
измерений
Система
ВЭЖХ, состоящая из насоса высокого давления, инжектора типа Rheodyne-7125 с объемом петли-дозатора 50 мкл,
спектрофлуориметрического детектора, обеспечивающего возбуждение
флуоресценции в спектральной области 330 - 340 нм и регистрацию эмиссии
флуоресценции при длине волны 466 нм и системы для сбора и обработки данных
типа Мультихром (Амперсенд, Россия) или аналогичной, хроматографической
колонки (250´4,6 мм),
заполненной силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом с размером
частиц 5 мкм (например, Kromasil С18 (MetaChem Texnologies, США)
Весы аналитические
Микрошприц на 100 мкл для
ВЭЖХ
Дозатор пипеточный, 1 - 5
см3
Дозатор пипеточный, 100 -
1000 мкл
Дозатор пипеточный, 10 -
100 мкл
Цилиндры мерные с притертой
пробкой вместимостью 100 см3 тип 2-100 и
2-250
|
ГОСТ 1770-74
|
4.2. Вспомогательное
оборудование
Спектрофотометр
|
|
Аппарат для встряхивания
проб типа АВУ-6С или аналогичный
|
ТУ 64-1-2451
|
Ротационный испаритель
ИР-1М с ловушкой или аналогичный
|
ТУ 25-11917
|
Электрошкаф сушильный
лабораторный с погрешностью поддержания температуры ±2,5 в интервале от 50 до
350 °С
|
ТУ 16-531.639
|
Холодильник бытовой
|
ГОСТ 16317
|
Мельница лабораторная
электрическая ЭМ-3А или аналогичная рН-метр
|
ТУ 46-22-236-79
|
Магнитная мешалка типа ММ 5
с перемешивающим стержнем
|
ТУ 25-11.834-80
|
Колбы плоскодонные
конические на 250 см3 с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32
|
ГОСТ 10394-74
|
Флаконы стеклянные
завинчивающиеся из темного стекла (вайл), объемом 7 см3
|
|
Колбы мерные, вместимостью
100, 500, 1000 см3 тип 2-100-2,2-500-2
|
ГОСТ 1770-74
|
Воронки лабораторные
|
ГОСТ 25336
|
Колбы грушевидные на 10 см3
с НШ 14,5, тип ГрКШ-10-14/23
|
ГОСТ 10394-72
|
4.3. Реактивы и
материалы
Стандарт
охратоксина А, фирма «Sigma», кат. №
О-1877
|
|
Фильтры обеззоленные «синяя
лента»
|
ТУ 6-09-1678
|
Натрий фосфорно-кислый
двузамещенный, 12-водный, чда
|
ГОСТ 4172-76
|
Натрий фосфорно-кислый
однозамещенный, 2-водный, чда
|
ГОСТ 245-76
|
Натрий хлорид, хч
|
ГОСТ 4233-77
|
Ацетонитрил, осч, сорт 0
|
|
Метанол, осч
|
ГОСТ 6995-77
|
Кислота фосфорная, осч
|
ТУ 2612-014-00203677-97
|
Кислота уксусная ледяная,
хч
|
ГОСТ
61-75
|
Толуол, чда
|
ГОСТ
5789-78
|
Иммуноаффинные колонки Ochraprep (R-Biopharm, Великобритания)
|
|
5. Подготовка к
выполнению измерений
5.1.
Приготовление стандартных растворов охратоксина А
Для приготовления стандартного раствора хранения
(концентрация охратоксина А - 10 нг/мкл) навеску кристаллического охратоксина А
массой 5 мг помещают в мерную колбу объемом 500 см3, приливают 50 см3
смеси толуол-уксусная кислота (98:2 % об.), тщательно перемешивают до полного
растворения вещества и доводят той же смесью растворителей до метки. Для
установления точной концентрации раствора хранения измеряют его оптическую
плотность при длине волны 333 нм (Д333). Концентрацию раствора
вычисляют по формуле:
Далее 5 см3
стандартного раствора охратоксина А с концентрацией 10 нг/мкл разбавляют смесью
толуол-уксусная кислота (98: 2 % об.) до объема 100 см3, получая
рабочий раствор с концентрацией 0,5 нг/мкл.
Для приготовления рабочих
растворов охратоксина А с концентрацией 0,005; 0,05 и 0,1 нг/мкл отбирают
соответственно 50, 500 и 1000 мкл раствора с концентрацией 0,5 нг/мкл,
упаривают досуха и растворяют в 5 см3 подвижной фазы.
Раствор хранения охратоксина А
содержат в стеклянной посуде с притертой пробкой в темном прохладном месте (при
температуре около 0 °С) до одного года и используют для приготовления рабочих
стандартных растворов. Рабочие стандартные растворы хранят в вайлах из темного
стекла в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) в течение 1
месяца.
Перед использованием рабочих
стандартных растворов их следует довести до комнатной температуры и только
после этого следует открывать пробки.
5.2. Приготовление
фосфатного буферного раствора, рН = 7,4
Навеску натрия фосфорнокислого
двузамещенного 12-водного массой 1,15 г, навеску натрия однозамещенного
2-водного массой 0,124 г и навеску натрия хлорида массой 1,74 г переносят в
мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 10 - 20 см3
дистиллированной воды. Перемешивают и доводят объем раствора в колбе до метки.
Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.
5.3. Приготовление
смесей растворителей
Толуол-уксусная кислота (98:2
% об.).
В мерную колбу на 1000 см3
вносят 20 см3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят толуолом до
метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.
Ацетонитрил-вода (60:40 % об.).
В мерную колбу на 1000 см3
вносят 600 см3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят водой до метки.
Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.
Ацетонитрил-вода (60:40 % об.;
рН = 3,0).
В мерную колбу на 1000 см3
вносят 600 см3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят
бидистиллированной водой до метки. Внесением фосфорной кислоты подводят рН
смеси до величины, равной 3,0. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном
месте.
Метанол-уксусная кислота (98:2
% об.).
В мерную колбу на 1000 см3
вносят 20 см3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят метанолом до
метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.
6. Отбор и подготовка
проб для анализа
6.1.
Отбор проб
Для учета специфики отбора проб отдельных
видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической
документацией:
• «Зерно. Правила приемки и
методы отбора проб» ГОСТ 13586.3-83;
• «Крупа. Правила приемки и
методы отбора проб» ГОСТ 26312.1-84;
• «Мука и отруби. Приемка и
методы отбора проб» ГОСТ 27668-88;
• «Продукты пищевые
консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию» ГОСТ
8756.0-70.
Пробы для анализа, представительные по
концентрации микотоксинов для всей партии, следует отбирать из предварительно
гомогенизированного среднего (исходного) образца массой 2 кг.
6.2. Подготовка проб
для анализа
Отобранные пробы измельчают в течение 1 -
2 мин в лабораторной мельнице. При этом используют две параллельные пробы.
6.2.1. Экстракция
Навеску 25 г измельченной пробы помещают в
плоскодонную коническую колбу на 250 см, добавляют 100 см3 смеси
ацетонитрил-вода (60:40 % об.). Экстрагируют на аппарате для встряхивания проб
в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр
«синяя лента». Отбирают 10 см3 фильтрата и добавляют 90 см
фосфатного буферного раствора, рН = 7,4.
6.2.2. Очистка
экстракта
На иммуноаффинную колонку наносят 100 мл
полученной смеси со скоростью 1 - 2 капли в секунду, промывают 20 см3
фосфатного буферного раствора, рН = 7,4. Охратоксин А элюируют 3 см3
смеси метанол-уксусная кислота (98: 2 % об.).
7. Выполнение
измерений
7.1.
Приготовление тестового образца
Элюат упаривают досуха. Сухой остаток
растворяют в 400 мкл подвижной фазы (раствор А).
7.2. Условия
хроматографирования
Условия ВЭЖХ: подвижная фаза -
ацетонитрил-вода (60:40 % об.; рН = 3,0); скорость подвижной фазы - 1,5 см3/мин.
Флуориметрический детектор
устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 333 нм, на линии эмиссии
устанавливают эмиссионный фильтр с полосой пропускания 466 нм.
Для анализа проб в инжектор
хроматографа вводят с помощью микрошприца 50 мкл тестового образца (раствора
А). При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с охратоксином А,
рассчитывают массу охратоксина А во вколе с помощью градуировочного графика.
8. Обработка
результатов измерения
8.1.
Построение градуированной зависимости
Для построения градуировочного графика
проводят хроматографический анализ серии рабочих растворов стандартов. В
инжектор с помощью микрошприца вводят 50 мкл рабочего раствора стандарта с
концентрацией 0,005 нг/мкл, что соответствует 0,25 нг охратоксина А. Подобное
делается для других стандартных растворов с концентрациями 0,05 и 0,10 нг/мкл,
что в свою очередь соответствует 2,5 и 5,0 нг охратоксина А во вколе. В указанных
условиях время удерживания находится для охратоксина А в диапазоне от 4 до 5
мин. На основании полученных данных строят градуировочный график (зависимость
площади хроматографического пика от массы охратоксина А во вколе).
8.2. Оформление
результатов
Расчет концентрации
охратоксина А в пробе проводится по формуле:
С(охр. А) - концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг;
М - масса навески для анализа, г (25,0);
т - масса охратоксина А, соответствующая введенному в хроматограф
объему раствора А, нг;
V1 - объём
раствора для экстракции, см3 (100);
V2 - объём
экстракта, нанесенный на ПАК, см3 (10);
V3 - общий объём
раствора А, см3 (0,4);
V4 - объём
раствора А, введенный в хроматограф, см3 (0,05).
При высоких уровнях загрязнения
охратоксином А пробы необходимо увеличить объем раствора A (V3) с внесением соответствующих изменений в
формулу.
За окончательный результат
испытаний принимается среднее арифметическое значение результатов двух
параллельных определений:
Результат анализа
представляют в виде (при вероятности Р = 0,95):
D - граница абсолютной погрешности:
d - граница относительной погрешности методики (показатель точности),
% (табл. 1).
Если содержание охратоксина А в пробе
менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа
представляют в виде:
«содержание охратоксина А в
пробе зерна менее 0,0001 мг/кг»*
______________
* 0,0001 мг/кг - предел обнаружения.
8.3.
Проверка приемлемости результатов параллельных определений
Допустимое расхождение между параллельными
измерениями (R) определяют на основании предела повторяемости (r) (табл. 1):
R = 0,01 (r, %)×, мг/кг
Если расхождение между
параллельными определениями не превышает допустимого:
то среднее арифметическое
принимают за результат анализа.
При превышении норматива R следует повторить измерения, используя резервные пробы.
9. Контроль качества результатов
измерений
Периодичность контроля погрешности измерений зависит
от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами
контроля.
Образцами контроля являются
рабочие пробы продовольственного сырья и пищевых продуктов. Отбирают пробу и
разделяют ее на 2 равные части. Одну из них оставляют без изменений, а к другой
добавляют такое количество раствора стандарта охратоксина А, чтобы его массовая
доля в пробе по сравнению с исходным значением увеличилась на 50 - 100 %.
Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.
Обе пробы анализируют в
точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной
пробы (С(отр.А)) и пробы с добавкой (С¢(отр.А)). Определение проводят в одинаковых условиях, а именно: анализ
проводит один аналитик, с использованием одного набора мерной посуды,
реактивов, растворов и т, д.
Алгоритм проведения
оперативного контроля погрешности с использованием метода добавок состоит в
сравнении результата контрольного определения, равного разности между
результатом контрольного измерения пробы с добавкой (С¢(охр.А)), пробы без добавки (С(охр.А)) и величиной
добавки (Сдоб(охр.А)) с нормативом оперативного контроля (K). Решение об удовлетворительной погрешности принимается при выполнении
следующего условия (при Р = 0,95):
Норматив оперативного
контроля погрешности рассчитывают по формуле (Р = 0,90):
K = 0,84×(D2С¢(охр.А)
+ D2С(охр.А))1/2
При превышении норматива
оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют с использованием другой
пробы.
10. Требования техники
безопасности
При выполнении анализов необходимо
соблюдать правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ
12.1.005, ГОСТ
12.2.007.0 и ГОСТ 4658. Помещение лаборатории должно
соответствовать санитарным правилам проектирования, оборудования, эксплуатации
и содержания производственных и лабораторных помещений, предназначенных для
проведения работ с органическими растворителями. Аналитическая лаборатория
должна быть оснащена вентиляционными системами по ГОСТ
12.4.021.
11. Требования к
квалификации исполнителя
К выполнению анализа охратоксина А в зерне
и зернопродуктах допускаются лица со специальным высшим образованием или
средним специальным образованием, владеющие техникой ВЭЖХ-анализа, прошедшие
соответствующую подготовку и имеющие опыт работы в химической лаборатории.
12. Условия выполнения
измерений
Температура окружающего
воздуха от 15 до 25 °С.
Относительная влажность
воздуха не более 80 % при 25 °С.
Атмосферное давление 730 -
760 мм рт.ст.
Напряжение электропитания:
210 - 220 В. Частота переменного тока: 45 - 50 Гц.