Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

35 страниц

301.00 ₽

Купить МУК 4.1.2158-07 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Методические указания устанавливают методы определения остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы и сульфаниламидных препаратов в пищевом сырье и пищевых продуктах животного происхождения (в мясе и мясопродуктах; в птице и птицепродуктах; в молоке и молокопродуктах) на основе твердофазного иммуноферментного анализа.

Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы для проведения производственного контроля другими испытательными лабораториями, аккредитованными в порядке, установленном Правительством РФ.

Методические указания не могут быть применены для арбитражных исследований.

 Скачать PDF

Дата введения: с момента утверждения.

Оглавление

1. Область применения

2. Общие положения

3. Отбор и подготовка проб

4. Определение антибиотиков тетрациклиновой группы

     4.1. Принцип метода ИФА

     4.2. Аппаратура, материалы, реактивы

5. Характеристика наборов для иммуноферментного определения тетрациклина

     5.1. Состав набора "Ридаскрин Тетрациклин"

     5.2. Аналитические характеристики набора

     5.3. Рекомендации по использованию наборов "Ридаскрин Тетрациклин"

6. Требования техники безопасности при проведении испытаний

7. Проведение испытаний с применением набора "Ридаскрин Тетрациклин"

     7.1. Подготовка проб для анализа

     7.2. Приготовление реагентов для анализа

     7.3. Процедура анализа

8. Определение антибиотиков тетрациклиновой группы в исследованных пробах

9. Обработка результатов

10. Определение сульфаниламидных препаратов в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа

     10.1. Принцип метода

     10.2. Аппаратура, материалы, реактивы

     10.3. Состав набора "Ридаскрин Сульфаметазин"

     10.4. Состав набора "Ридаскрин Фаст Сульфаметазин"

     10.5. Аналитические характеристики наборов для определения сульфаниламидных препаратов

     10.6. Рекомендации по использованию наборов "Ридаскрин Сульфаметазин" и "Ридаскрин Фаст Сульфаметазин"

11. Проведение испытаний с применением набора "Ридаскрин Сульфаметазин"

     11.1. Подготовка необходимых реагентов

     11.2. Подготовка проб для анализа

     11.3. Подготовка проб молока к исследованию

     11.4. Подготовка проб мяса к исследованию

     11.5. Приготовление реагентов для анализа

12. Процедура анализа

13. Определение количества сульфаметазина в исследованных пробах

     13.1. Обработка результатов

     13.2. Учет результатов при качественном определении сульфаметазина в исследованных пробах

14. Проведение испытаний с применением набора "Ридаскрин Фаст Сульфаметазин"

     14.1. Подготовка необходимых реагентов

     14.2. Подготовка проб для анализа

     14.3. Подготовка проб молока к исследованию

     14.4. Приготовление реагентов для анализа

     14.3. Процедура анализа

     14.4. Определение количества сульфаметазина в исследованных пробах

15. Обработка результатов

Нормативные ссылки:
Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18
Стр. 19
стр. 19
Стр. 20
стр. 20
Стр. 21
стр. 21
Стр. 22
стр. 22
Стр. 23
стр. 23
Стр. 24
стр. 24
Стр. 25
стр. 25
Стр. 26
стр. 26
Стр. 27
стр. 27
Стр. 28
стр. 28
Стр. 29
стр. 29
Стр. 30
стр. 30

Страница 1

ГОСУДАРСТВЕННОЕ


САНИТАРНО-ЗПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ НОРМИРОВАНИЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Страница 2

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека


Сборник


методических документов, необходимых для обеспечения применения Федерального закона от 12 июня 2008 г. № 88-ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию»


Часть 4

Страница 3

ББК51.23

C23


C23 Сборник методических документов, необходимых для обеспечения применения Федерального закона от 12 июня 2008 г. № 88-ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию».—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009.—75 с.


ISBN 5—7508—0771—1


В сборник включены методические документы, содержащие правила и методы исследований (испытаний) и измерений, а также правила отбора образцов для проведения исследований (испытаний) и измерений, в соответствии с постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации Г. Г. Онищенко от 08.12.2008 № 67.


ББК 51.23


Технический редактор Г. И. Климова


Формат 60x88/16


Подписано в печать 25.02.09 Тираж 200 экз.


Печ. л. 4,75 Заказ 15


Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., д 18/20


Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделом издательского обеспечения Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш , 19а 0|дсление реализации, тел /факс 952-50-89


@ Роспотребнадзор, 2009 © Федеральный центр гигиены и


эпилемиоло! ни Роспотребнадзора, 2009

Страница 4

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ


Определение остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы и сульфаниламидных препаратов в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа


Методические указания МУК 4.1.2158—07

Страница 5

1.    Методические указания разработаны ГУ НИИ питания РАМН: Ту-тсльян В. А. (руководитель), Хотимченко С. А., Шевелева С. А., Ефимоч-кина Н. Р., Барбер Н. В., Григорьев А. М.; ФГУЗ «Центр государственного санитарно-эпидемиологического надзора в г. Москве» (Иванова Л. И., Кругликова Т. А.).


2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Российской Федерации.


3.    Утверждены и введены в действие 18 января 2007 г. Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко.


4.    Введены впервые.


46

Страница 6

МУК 4.1.2158—07


УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации


Г. Г. Онищенко


18 января 2007 г.


Дата введения: с момента утверждения


4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ


Определение остаточных количеств антибиотиков


тетрациклиновой группы и сульфаниламидных препаратов в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа


Методические указания _МУК    4.1.2158—07_


1. Область применения


1.1.    Настоящие методические указания устанавливают методы определения остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой труп-пы и сульфаниламидных препаратов в пищевом сырье и пищевых продуктах животного происхождения (в мясе и мясопродуктах; в птице и птицепродуктах; в молоке и молочных продуктах) на основе твердофазного иммуноферментного анализа.


1.2.    Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы для проведения производственного контроля другими испытательными лаборатория, аккредитованных в порядке, установленном Правительством Российской Федерации. Методические указания не могут быть применены для арбитражных исследований.


2. Общие положения


2.1. Среди контаминантов продовольственного сырья и пищевых продуктов важное место занимают остатки антимикробных ветеринарных препаратов, используемых для лечения и профилактики инфекци-


47

Страница 7

онных заболеваний животных и птицы, в том числе антибиотики тетра-циклиновой группы и сульфаниламидные препараты. При их поступлении в организм человека могут возникать аллергические реакции, дис-биотические изменения микрофлоры кишечника, а также происходит формирование антибиотикоустойчивых форм микроорганизмов.


Для определения остаточных количеств антибиотиков в пищевых продуктах в настоящее время в основном применяют микробиологические методы, которые являются сравнительно простыми и дешевыми, однако, отличаются недостаточной специфичностью результатов.


2.2.    Для скрининга пищевых продуктов на загрязненность антибактериальными препаратами, в том числе сульфаниламидами, целесообразно использовать методы иммунохимичсского анализа, обеспечивающие высокую специфичность и точность, при этом предпочтительнее применять методы твердофазного иммуноферментного анализа (далее -ИФА), которые являются высокочувствительными.


2.3.    При определении методом ИФА в соответствии с настоящими Методическими указаниями антибиотиков тетрациклиновой группы предел обнаружения их составляет от 0,0015 мг/кг до 0,15 мг/кг в зависимости от вида продукта; для сульфаниламидных препаратов - от 0,002 мг/кг до 0,02 мг/кг в зависимости от вида продукта.


3. Отбор и подготовка проб


3.1.    Отбор пищевых образцов для исследования осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ 7269-79 «Мясо», ГОСТ 7202.0-74 «Мясо пггицы», ГОСТ 3622-68 «Молоко и молочные продукты».


3.2.    Отобранные образцы продуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки, стеклянные банки с притертыми крышками, маркируют и нумеруют. Образцы доставляют в лабораторию для анализа сразу же после отбора проб. В случае необходимости допускается хранить при температуре 4 ± 2 °С в течение времени не более срока годности пищевых продуктов или замораживать до температуры минус 10— 12 °С и хранить не более 2 недель.


3.3.    К исследованию скоропортящихся образцов следует приступать в день их доставки в лабораторию.


4. Определение антибиотиков тетрациклиновой группы 4.1. Принцип метода ИФА


Базовым принципом для количественного определения антибиотиков тетрациклиновой группы в пищевых продуктах является твердофазный конкурентный иммуноферментный анализ на полистироловых


48

Страница 8

МУК 4.1.2158—07


планшетах. Метод основан на конкуренции свободного антибиотика из исследуемых образцов и антибиотика, предварительно адсорбированного на твердой фазе (лунке планшета) в составе белкового конъюгата, за центры связывания специфичных к тетрациклинам антител во вносимом растворе. После отделения не связавшихся реагентов количество антител, прореагировавших с иммобилизованным антигеном, определяют с помощью вторичных антивидовых антител, меченных пероксида-зой хрена. Количество связавшегося с антителами конъюгата вторичных антител определяют с помощью субстрат - хромогенной смеси. При этом количество определяемого антибиотика, содержащегося в исследуемом образце, обратно пропорционально регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной реакции.


4.2. Аппаратура, материалы, реактивы

Перечень и характеристики оборудования и материалов


Нормативные документы, примечания

1


2

Фотометр планшетный вертикального сканирования, с фильтрами, соответствующими длине волны 450 нм


«Униплан», «Мультискан» или иного типа с теми же характеристиками

Дозаторы пипеточные автоматические с переменным объемом 0,02—0,2 см3, 0,1—1 смодноканальные


«Ленпипет», «Термолабсистемс» или иные тех же объемов

Дозаторы пипеточные автоматические восьмиканальные с переменным объемом 0,05—0,3 см3

Наконечники для автоматических пипеток объемом до 0,30 см3 и до 1,00 см3 однократного применения


По спецификации изготовителя

Анализатор потенциометрический, погрешность измерений pH ± 0,01 или pH - м


ГОСТ 19881-74 или другие марки с аналогичными характеристиками

Весы аналитические 120 г/0,001мг


ГОСТ 24104—88Е

Весы лабораторные общего назначения, 2 класса точности, до 200 г/0,1 г


ГОСТ 24104—88Е

Гомогенизатор лабораторный


Типа «Ультратюрракс», «Диакс» или аналогичные

Аквадистиллятор


В соответствии с ГОСТ 6709-72

Холодильник бытовой электрический


ГОСТ 16317-87

Стаканы химические и колбы мерные вместимостью 25, 50, 200 и 500 см3


ГОСТ 1770-74

Пипетки градуированные, 2 класса точности 1, 2, 5, 10 см3


ГОСТ 20292- -74 или аналогичные

49

Страница 9

Продолжение


2


1

Часы механические сигнальные


ГОСТ 3145-84

Центрифуга настольная с эффективностью не менее 4000 g


По ТУ 5.375-4261 или иного типа

Колонка для твердофазной экстракции RIDA® Cl8 или аналогичная с такими же характеристиками


По спецификации изготовителя

Цилиндры мерные вместимостью 25 см3


По спецификации изготовителя

Шейкер лабораторный для пробирок


Типа «Вортекс»

Микроиспаритель лабораторный одноканальный


Моделей ПЭ-2300, «Мини-бал» или других аналогичного назначения

Насос (компрессор) мембранный


РКадет, РКадмирал или иных моделей аналогичного назначения

Устройство для твердофазной экстракции


«Доркус», «Вакэлют» или иных моделей аналогичного назначения

Аппарат универсальный для встряхивания


ТУ 64-1-2451—78

Шкаф (стол) лабораторный с вытяжным устройством


Набор реагентов для количественного определения тетрациклина типа «Ридаскрин Тетрациклин»


По спецификации изготовителя

Дигидрофосфат натрия водный


хч**

Г идрофосфат натрия


хч

Г идрофосфат натрия двухводный


хч

Хлорид натрия


хч

Гидрооксид натрия


хч

Моногидрат лимонной кислоты


хч

Щавелевая кислота


хч

ЭДТ А-натриевая соль


хч

Твин 20


По спецификации изютовителя

Метанол* или этанол 95,0 %


хч

Этилацстат


хч

н-гексан


хч

Ацетонитрил


хч

Дистиллированная вода


метанол* - ядовитое вещество, требует мер безопасности при работе: хч** - химически чистые вещества

50

Страница 10

МУК 4.1.2158—07


5. Характеристика наборов для иммунофермеитного определения тетрациклина


Для иммунофермеитного определения тетрациклина могут быть использованы промышленно изготовленные наборы, метрологические характеристики которых не ниже указанных в настоящем документе после процедуры стандартизации их относительно данного метода.


5. Л Состав набора «Ридаскрин Тетрациклин»


Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов по 8 лунок),


сенсибилизированных препаратом тетрациклина- 1 шт._


Комплект стандартных растворов тетрациклина со следующими концентрациями: 0 нг/см3,0,5 нг/см3, 1,5 нг/см3, 4,5 нг/см3, 13,5 нг/см3, 40,5 нг/см3 в


буферном растворе по 1,3 мл - 6 флаконов____


Раствор антител - 6,0 см3


Коньюгат вторичных антител с псроксидазой - 10,0 см*


Субстрат, содержащий пероксид карбамида (мочевины) - 7,0 см3 Хромоген, содержащий тетраметилбензидин - 7,0 см*


Стоп-реагент, содержащий 1 № серную кислоту - 14,0 см3


Буфер 1, для разбавления стандартных растворов тетрациклина и растворов


образцов - 50,0 см3_


Буфер 2, для разбавления стандартных образцов при анализе молока - 10,0 см3


Примечание. Набор рассчитан на проведение анализа в 2 повторностях: 42 исследуемых образца и 6 калибровочных проб (всего 96 определений на один планшет).


5.2. Аналитические характеристики набора


5.2.1. Специфичность метода


Метод анализа при использовании набора «Ридаскрин Тетрациклин» характеризуется показателем специфичности*, составляющим для: Тетрациклина - 100 %


Хлортетрациклина -100 %


Окситетрациклина -10 %


Миноциклина - 125 %


Ролитетрациклина - 110 %


Демеклоциклина - 35 %


Доксицикпина -5%


* - гарантируется изготовителем


51

Страница 11

МУК 4.1.2158—07


5.2.2. Чувствительность метода


Предел обнаружения тетрациклина и хлортетрацнклина в молоке -0,0015 мг/кг, мясе - 0,006 мг/кг, окситетрациклина в молоке - 0,015 мг/кг, в мясе - 0,06 мг/кг.


Показатель извлекаемости составляет более 70 %, в т. ч. в молоке -(75 ± 5) %, в мясе и мясопродуктах - (85 ± 15) %.


При искусственном загрязнении проб молока 5 мкг/л тетрациклина или 100 мкг/л окситетрациклина степень извлечения составляет (90 ±10)%.


5.3. Рекомендации по использованию наборов «Ридаскрин Тетрациклин»


5.3.1.    При проведении испытаний следует использовать реагенты и компоненты, входящие в один и тот же набор. Разбавление или замена реагентов, использование реагентов из набора с другим номером партии может привести к потере чувствительности или ошибке определения.


5.3.2.    Хранить наборы следует при температуре в пределах от 2 до 8 °С. Категорически не допускается хранение при минусовой температуре и замораживание реагентов набора. Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) их упаковывают в оригинальный фольгированный пакет вместе с имеющимся осушителем в плотно закрытом виде.


5.3.3.    Следует избегать попадания прямых солнечных лучей на флакон с раствором хромогена из-за его светочувствительности.


5.3.4.    В случае окрашивания раствора хромогена его применение для анализа не рекомендуется, поскольку окрашивание раствора хромогена является признаком порчи.


6. Требования техники безопасности при проведении испытаний


Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту, поэтому следует избегать контакта стоп-реагента с кожей.


7. Проведение испытаний с применением набора «Ридаскрин Тетрациклин»


7. /. Подготовка проб для анализа


Отбор образцов для анализа ведется в соответствии с п. 3 данного документа. Образцы, предназначенные для анализа, должны храниться в холодильнике, в темном месте.


52

Страница 12

МУК 4.1.2158—07


7.1.1. Подготовка проб молока


Молоко объемом 5 см3 охладить до температуры (6 ± 2) °С, перенести в центрифужную пробирку, центрифугировать при температуре 4 -10 °С в течение 15 мин при эффективности центрифугирования 4000 g*. Удалить верхний слой жира и перенести аликвоту обезжиренного молока в новую чистую пробирку. Смешать обезжиренное молоко с буфером № 1 в соотношение 1:10. Для анализа использовать 0,05 см3 разведения обезжиренного молока с буфером на I лунку планшета. Коэффициент разбавления - 10.


7.1.2. Подготовка проб мяса


7.1.2.1. Приготовление реагентов для пробоподготовки


При исследовании образцов мяса для пробоподготовки необходимо приготовить следующие реагенты:


•    метанол (допускается использование спирта этилового 95,0 %);


•    буфер Макллвейна: 12,9 г лимонной кислоты моногидрата; 10,9 г Na2HP04; 37,2 г ЭДТА-натриевой соли растворить в дистиллированной воде и довести до объема 1 000 см3; установить pH 3,8;


•    раствор 20 мМ щавелевой кислоты в метаноле (этаноле) (1,8 г/л).


7.1.2.2. Приготовление проб


Пробу мяса измельчить с использованием лабораторного гомогенизатора. Далее 5 г гомогенизированной пробы поместить в чистую центрифужную пробирку, смешать с 25 см3 буфера Макллвейна и встряхивать в шейкере в течение 30 мин. Полученную суспензию охладить до температуры 15°С и центрифугировать в течение 10 мин при эффективности центрифугирования 4000 g. Отобрать пипеткой верхний слой в чистую пробирку и повторить с оставшейся пробой экстракцию с 25 смбуфера Макллвейна. После этого объединить супернатанты (50 см3) и профильтровать раствор через гофрированный фильтр.


Эффективность центрифугирования измеряется в g и зависит от скорости и радиуса вращения (см. технический паспорт имеющейся центрифуги). Например, при использовании центрифуги ОПН-8 с угловым ротором эффективности 4000 g соответствует скорость вращения ротора около 7000 об/мин.


53

Страница 13

МУК 4.1.2158—07


7.1.2.3. Очистка раствора методом твердофазной экстракции


Из полученного по п. 7.1.2.2 фильтрата отобрать 5 см3 и очистить раствор методом твердофазной экстракции на колонке RIDA® С18 следующим образом:


•    предварительно колонку промывают 3 см3 метанола (этанола) со скоростью 1 капля в секунду: при отсутствии устройства для твердофазной экстракции можно использовать разовый пластиковый шприц на 5 см3;


•    промыть колонку 2 см3 дистиллированной воды со скоростью 1 капля в секунду;


•    пропустить через колонку 5 см3 подготовленного раствора исследуемой пробы со скоростью 15 капель в минуту;


•    промыть колонку 3 см3 дистиллированной воды со скоростью 1 капля в секунду;


•    удалить из колонки остатки жидкости и сушить колонку в токе воздуха или азота 2 минуты;


•    адсорбированные на колонке вещества осторожно, со скоростью 15 капель в минуту, элюировать 2 см3 20 мМ раствора щавелевой кислоты в метаноле (этаноле) в чистую пробирку;


•    элюат разбавить буфером № 1 в 10 раз (1 : 9), например, смешав 0,05 см3 элюата и 0,45 см3 буфера № 1. Раствор готов к испытанию в ИФА. Для анализа используют 0,05 см3 раствора.


7.2. Приготовление реагентов для анализа


Перед использованием набора довести температуру всех реагентов до комнатной температуры в пределах 20—25 °С, а после использования охладить все оставшиеся реагенты до температуры 4 ± 2 °С.


В процессе выполнения анализа нельзя допускать высыхания лунок планшета. На всех стадиях инкубации следует избегать воздействия прямого солнечного света. При инкубации планшета рекомендуется закрыть его непрозрачным экраном.


Все разведения реагентов и расчеты представлены для проведения анализа на одном планшете. Построение калибровочной кривой необходимо проводить для каждой серии определений.


7.2.1. Приготовление стандартных растворов


Подготовку стандартных растворов проводят только в стеклянной посуде, не допускается использование пластиковой посуды.


54

Страница 14

МУК 4.1.2158—07


Для подготовки к использованию стандартных растворов тетрациклина концентраты растворов, входящие в состав набора, разбавляют буфером № 1 или буфером № 2 в нижеприведенных пропорциях. После разбавления необходимо тщательно перемешать готовые растворы:


Стандарт 1 (С1). Для приготовления стандарта 1 с концентрацией 0 мкг/л тетрациклина 0,05 см3 концентрата № 1 смешивают с 0,45 сиг буферного


раствора    __


Стандарт 2 (С2). Для приготовления стандарта 2 с концентрацией 0,05 мкг/л тетрациклина 0,05 см3 концентрата № 2 смешивают с 0,45 см3 буферного


раствора ______


Стандарт 3 (СЗ). Для приготовления стандарта 3 с концентрацией 0,15 мкг/л тетрациклина 0,05 см3 концентрата № 3 смешивают с 0,45 см3 буферного


раствора_


Стандарт 4 (С4). Для приготовления стандарта 4 с концентрацией 0,45 мкг/л тетрациклина 0,05 см3 концентрата № 4 смешивают с 0,45 см3 буферного


раствора_


Стандарт 5 (С5). Для приготовления стандарта 5 с концентрацией 1,35 мкг/л тетрациклина 0,05 см3 концентрата X® 5 смешивают с 0,45 см3 буферного


раствора_


Стандарт 6 (C6J. Для приготовления стандарта 6 с концентрацией 4,05 мкг/л тетрациклина 0,05 см3 концентрата № 6 смешивают с 0,45 см3 буферного раствора_


Буферный раствор № 1 используется для разведения стандартных растворов при исследовании проб мяса и мясопродуктов, птицы и пти-цепродуктов.


Буферный раствор № 2 используется для разведения стандартных растворов при исследовании проб молока.


Перед использованием буферного раствора № 2, использующегося при исследовании проб молока, следует энергично перемешать раствор с помощью встряхивателя типа «вортекс».


Для каждой серии исследований следует готовить свежие стандартные растворы.


7.2.2. Подготовка моющего буферного раствора


Для приготовления моющего фосфатного буферного раствора с твином навески 0,55 г NaH2P04 • Н20, 2,85 г Na2HP0420 и 9 г NaCI растворить в дистиллированной воде, добавить 1 мл твина 20 и довести до объема 1000 мл; pH моющего фосфатного буфера должен быть 7,3 ±0,1.


55

Страница 15

МУК 4.1.2158—07


7.23. Подготовка раствора антител


Раствор антител к тетрациклину (флакон с черной крышкой), входящий в состав набора «Ридаскрин», поставляется в готовом к употреблению виде. Перед употреблением достаточно вскрыть флакон.


7.2.4. Подготовка раствора коньюгата


Раствор коньюгата с ферментом (флакон с красной крышкой) также готов для использования. Перед употреблением достаточно открыть флакон.


7.2.5. Подготовка микротитровального планшета


Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов. Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре (4 ± 2) °С.


7.3. Процедура анализа


Вставить в рамку планшета стрипы (лунки) в количестве, необходимом для выполнения всех запланированных определений в двух повторностях. Записать координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов. Пример формы записи показан на рис. 1.

С1


С1


113


ПЗ


П11


ПИ


П19


П19


П27


П27


П35


П35

С2


С2


П4


П4


П12


П12


П20


П20


1128


П28


П36


П36

СЗ


СЗ


П5


П5


П13


П13


П21


П21


П29


П29


П37


П37

С4


С4


П6


П6


П14


П14


П22


П22


ПЗО


ПЗО


П38


П38

С5


С5


П7


П7


П15


1115


1123


Г123


П31


П31


П39


П39

С6


С6


П8


П8


П16


П16


П24


П24


П32


П32


П40


П40

П1


П1


П9


119


П17


П17


П25


П25


ПЗЗ


ПЗЗ


П41


П41

П2


П2


1110


П10


П18


П18


П26


П26


П34


П34


П42


П42

Рис. 1. Пример формы записи координат лунок перед выполнением анализа («С»-стандартные растворы, «П»-исслелуемыс пробы)


7.3.1.    Добавить по 0,05 см3 стандартных растворов и подготовленных растворов исследуемых образцов в соответствующие пары лунок.


7.3.2.    Добавить по 0,05 см3 раствора антител в каждую лунку, перемешать вручную, легкими круговыми движениями рамки планшета по


56

Страница 16

МУК 4.1.2158—07


поверхности стола, избегая попадания смеси в соседние лунки, и оставить на инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре в пределах


20—25 °С.


7.3.3.    Вылить жидкость из лунок, перевернув рамку планшета и выбить капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполнить лунки 0,25 см3 раствора фосфатного моющего буфера и снова удалить раствор из лунок. Выбить капли жидкости, как описано выше. Повторить процедуру промывки лунок раствором фосфатного буфера еще два раза.


7.3.4.    Добавить в каждую лунку по 0,1 см3 раствора конъюгата. Тщательно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 15 мин при комнатной температуре в пределах 20—25 °С.


73.5. Вылить жидкость из лунок, перевернув рамку и тщательно выбить капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполнить лунки 0,25 см3 раствора фосфатного буфера и снова опорожнить лунки. Выбить капли жидкости, как описано выше. Повторить процедуру промывки лунок раствором фосфатного буфера еще два раза.


7.3.6.    Добавить по 0,05 см3 субстрата и по 0,05 см3 хромогена в каждую лунку. Тщательно перемешать и инкубировать при комнатной температуре в пределах 20—25 °С в течение 15 мин в темноте.


7.3.7.    Добавшъ в каждую лунку по 0,1 см3 стоп-реагента и перемешать вручную. В течение 60 мин, не более, после добавления стоп-реагента измерить оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм (бланк или нулевое считывание по воздуху), используя фотометр планшетный.


8. Определение количества антибиотиков тетрациклиновой группы в исследованных пробах


Средние из 2 значений оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами, делятся на среднее значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Результат измерения оптической плотности измеряемой пробы выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом (% поглощения, или относительное поглощение) по формуле:


57

Страница 17

МУК 4.1.2158—07


--100 = % поглощения, где


ОП°


ОГГ - среднее значение оптической плотности в лунках со стандартной пробой или с пробами исследуемого образца;


ОП° - среднее значение оптической плотности лунки с нулевым стандартом (С1).


Примечание. Если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, составляет значение ниже 0,6 - это может быть признаком порчи реагентов. В таком случае следует заменить реагенты и повторить процедуру.


По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов, и соответствующим известным значениям концентрации тетрациклина в мкг/кг (мкг/л) строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат. При правильно проведенном определении калибровочная кривая должна быть почти линейна в диапазоне 0,15—1,35 мкг/кг (рис. 2).


JO*


I


X


\—


о


с;


с


к


о


Ф


У


С


О


0.05    0.1$    0.4$    1.)$    4.05


(И0*в1


Концентрация, мкг/кг


Рис. 2. Образец калибровочной кривой для набора реагентов «Ридаскрин Тетрациклин»

Страница 18

МУК 4.1.2158—07


Концентрация тетрациклина в растворах исследуемых образцов в мкг/кг (или мкг/л) определяется по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов.


Для того, чтобы вычислить концентрацию тетрациклина в исследуемой исходной пробе, величину концентрации тетрациклина, полученную по калибровочной кривой, следует умножить на соответствующий коэффициент разбавления. При выполнении пробоподготовки и анализа в полном соответствии с приведенной методикой коэффициент разбавления имеет следующие значения:


Молоко - 10;


Мясо - 40.


Окончательный результат исследования выражают в мг/кг или мг/л, для чего величины, полученные в мкг/кг или мкг/л, делят на 1 ООО.


9. Обработка результатов


9.1.    За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Окончательный результат округляют до второго десятичного знака.


9.2.    Метрологические характеристики иммуноферментного метода определения антибиотиков тетрацикп и новой группы в продуктах питания животного происхождения (молоке, мясе) - табл. 1.


Таблица 1

Статистический параметр


Соединение - тетрациклин

мясо


молоко

1


2


3

Нижний предел определения, мг/кг


0,006


0,0015

Интервал надежного определения, мг/кг


0,01—0,1


0,005—0,05

Среднее значение открывасмости (показатель правильности), %


80-115

Допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений тетрациклина, полученными в одной лаборатории в одной серии измерений (сходимость), при Р = 0,95 %, не должно превышать, %


9,0

Допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений тетрациклина, выполненных в двух разных лабораториях (воспроизводимость), при Р = 0.95 % не должно превышать по отношению к среднему, %


10,0

59

Страница 19

МУК 4.1.2158—07


9.3. Если расхождение результатов двух параллельных определений (сходимость и воспроизводимость) превышает требования по п. 9.2, то повторно проводят два новых параллельных определения.


10. Определение сульфаниламидных препаратов в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа


10.1. Принцип метода Сущность метода и принципиальная схема определения сульфаме-тазина с помощью иммуноферментного анализа в основном соответствует описанию, приведенному в п. 4 для антибиотиков тетрациклиновой группы. Отличие состоит в использовании первичных антител захвата, адсорбированных на поверхности планшета, неконъюгированных вторичных анти-видовых антител и сульфаметазина, коньюгированного с пероксидазой. Дополнительно предусмотрена процедура качественного определения сульфаниламидных препаратов в мясных и молочных продуктах, а также метод экспрессного определения количества сульфаниламидов в молоке с использованием тест-системы «Ридаскрин Фаст Сульфаметазин».


10.2. Аппаратура, материалы, реактивы

Перечень и характеристики оборудования и материалов


Нормативные документы, примечания

1


2

Фотометр планшетный вертикального сканирования, с фильтрами, соответствующими длине волны 450 нм


«Униплан», «Мультискан» или иного типа с теми же характеристиками

Дозаторы пипсточные автоматические с переменным объемом 0,02—0,2 см3,0,1—1 см3 одноканальные


«Ленпипет», «Термо-лабсистсмс» или иные тех же объемов

Дозаторы пипеточные автоматические восьмиканальные с переменным объемом 0,05—0,3 см3

Наконечники для автоматических пипеток объемом до 0,30 см3 и до 1,00 см3 однократного применения


Анализатор потенциометрический, погрешность измерений pH ± 0,01 или pH - метр


ГОСТ 19881-74 или другие марки с аналогичными характеристиками

Весы аналитические 120 г/0,001 мг


ГОСТ 24104-—88Е

Весы лабораторные общего назначения, 2 класса точности, до 200 г/0,1 г


ГОСТ 24104—88Е

Страница 20

МУК 4.1.2158—07


Продолжение

1


2

Гомогенизатор лабораторный


Типа «Ультратюрракс», «Диакс» или аналогичные

Аквадистиллятор


В соответствии с ГОСТ 6709-72

Холодильник бытовой электрический


ГОСТ 16317-87

Стаканы химические и колбы мерные вместимостью 25, 50, 200 и 500 см3


ГОСТ 1770-74

Пипетки градуированные, 2 класса точности на 1,2, 5, 10 см3


ГОСТ 20292-74 или аналогичные

Часы механические сигнальные


ГОСТ 3145-84

Центрифуга настольная с эффективностью центрифугирования не менее 4000 g


По ТУ 5.375-4261 или иного типа

Цилиндры мерные вместимостью 25 см3


Шейкер лабораторный для пробирок


Типа «Вортекс»

Микроиспаритель лабораторный одноканальный


Моделей ПЭ-2300, «Ми-ни-Вап» или других аналогичного назначения

Насос (компрессор) мембранный


РКадет, РКадмирал или иных моделей аналогичного назначения

Аппарат универсальный для встряхивания


ТУ 64-1-2451—78

Шкаф (стол) с вытяжным устройством


По спецификации изготовителя

Набор реагентов для количественного определения тетрациклина типа «Ридаскрин Сульфаметазин»


По спецификации изготовителя

Набор реагентов для количественного определения сульфаметазина типа «Ридаскрин Фаст Сульфаметазин»


По спецификации изготовителя

Этилацетат


хч*

н-гексан


хч

Ацетонитрил


хч

Дистиллированная вода


хч*- химически чистые вещества

61