«УТВЕРЖДАЮ»

Руководитель Федеральной-службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный Сосуда рэденныр санитарный врач РФ

Г.Г. Онищенко 2005 г.

Методические указания по определению остаточных количеств карбосульфана и его основных метаболитов - карбофурана и 3-гидроксикарбофурана в плодах яблони методом газожидкостной

хроматографии

I. Вводная часть

Фирма производитель: ФМС Европа НВ Торговое наименование: Маршал, КЭ Действующее вещество: карбосульфан Структурная формула:

IUPAC: 2,3-дигидро-2,2-диметилбензофуран-7-ил (дибутиламинотио) метилкарбамат Брутто формула: C20H32N2O3S Мол. масса: 380.5

Химически чистый препарат - вязкая жидкость от светло-желтого до бурого цвета со слабым фенольным запахом.

Температура кипения: 124-128°С при 0.1 Па. Препарат разлагается при температуре выше 150°С. Давление паров ОЛбхЮ^мм.рт.ст . при 20°С.

Растворимость при 25 °С в воде 0.3 мг/л; хорошо смешивается с большинством органических растворителей - растворимость при 20 °С - более 50% в ксилоле, хлороформе, хлористом метилене, н-гексане, метаноле и ацетоне. Стабилен в этилацетате при 60 °С, нестабилен при

№

метилене, н-гексане, метаноле и ацетоне. Стабилен в зтилацетате при 60 °С, нестабилен при pH ниже 7. Период полураспада в водных растворах (при 25 ⁰ С): менее 1 часа (рН4), 22 часа (pH 6), 184 часа (pH 7), 340 часов (pH 8), более 1400 часов (pH 9).

Краткая токсикологическая характеристика;

Острая пероральная токсичность (LD ») для крыс - 250 мг/кг (самцы), 185 мг/кг (самки).

Гигиенические нормативы: МДУ для яблок в России не установлен.

В растениях идентифицированы 8 метаболитов, среди которых преобладают карбофуран и 3-гидрокси карбофуран.

Область применения: Карбосульфан - инсектицид и нематоцид системного и контактного действия, рекомендуемый для борьбы с листогрызущими и почвообитающими насекомыми-вредителями цитрусовых, люцерны, кукурузы, сорго, сои, овощных, картофеля и т.д.

Карбофуран

IUPAC: 2,3-дигидро-2,2-диметилбензофуран-7-ил N-метилкарбамат Брутто формула C12H13NO j Мол. масса: 221.3

OCONHCHj

ci

Oo<_cl

Белое кристаллическое вещество со слабым запахом фенола. Температура плавления 150-152 °С . Давление паров при 33 °С - 2.7 мПа. Растворимость в воде при 25 °С 700 мг/л. Расворимость в органических растворителях при 25 "С (г/кг): диметилформамид - 270, диметилсульфоксид - 250, ацетон -150, ацетонитрил -140, хлористый метилен -120, этанол -40.

Карбофуран стабилен в водных растворах при pH 3; с увеличением pH стабильность карбофурана уменьшается : период полураспада при pH 5 - 28 дней, при pH 7 - 21 день, при pH 9 - 0.9 дня.

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая оральная токсичность (LD 50) для крыс - 9.17 мг/кг, острая дермальная токсичность для крыс более 10700 мг/кг, острая ингаляционная токсичность для крыс - 75 мг/м ³ Гигиенические нормативы: МДУ карбофурана для яблок в России не установлен.

3-гидроксикарбофуран

IUPAC 2,3-дигидро-2,2-диметил-3-гидроксибензофуран-7-ил N- метилкабамат

пгпкыгы

Структурная формула С12Н 15NO4 Мол.масса :235.3

Острая оральная токсичность (LD 50) для крыс - 18 мг/кг

№

2. Методика определения карбосульфана, карбофурана и 3-гидрокснкарбофурана в плодах яблони методом газожидкостной хроматографии

2.1.    Основные положения

2.1.1.    Принцип метода

Определение карбосульфана, карбофурана основано на извлечении смесью органических растворителей, для 3-гидроксикарбофурана 0.25 н НС1, очистке экстракта путем перераспределения между несмсшивающимися жидкими фазами и на колонке с дезактивированным флорисилом. Количественное определение карбосульфана, карбофурана и 3-гидроксикарбофурана проводится методом газожидкостной хроматографии с использованием термоионного детектора.

2.1.2.    Избирательность метода

Избирательность метода обеспечивается очисткой экстрактов анализируемых проб и сочетанием условий хроматографирования. Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

Метрологическая характеристика метода

Таблица 1

Объект анализа Предел обнаружения мг/кг Диапазон измеряемых концентраций, мг/кг Среднее значение определения, % (для каждого объекта п=24) >гносительное стандартное отклонение S, % Доверительный интервал среднего, п=24, Р=0.95 карбосульфан 0.05 0.05-0.50 83.50 6.55 5.0 5 карбофуран 0.05 0.05-0.50 82.50 6.65 5.15 3-гидрокси- карбофуран 0.05 0.05-0.50 88.75 7.75 5.20

Полнота определения карбосульфана в плодах яблони

ик/

Полнота определения карбофуранав плодах яблони

Среда Внесено, мг/кг Найдено, мг/кг Стандартное отклонение, ± Полнота определения, % плоды яблони 0.05 0.038 0.0024 76.5 0.10 0.084 0.0082 84.2 0.20 0.169 0.0140 84.4 0.50 0.425 0.0240 85.0 Среднее 82.5

Полнота определения 3-гидроксикарбофурана в плодах яблони

Среда Внесено, мг/кг Найдено, мг/кг Стандартное отклонение, ± Полнота определения, % плоды яблони 0.05 0.038 0.0024 76.7 0.10 0.093 0.0082 92.5 0.20 0.185 0.0140 92.8 0.50 0.465 0.0240 93.0 Среднее 88.75

2.2.    Реактивы, материалы

Карбосульфан, аналитический стандарт с массовой долей основного вещества 90.1% Карбофуран, аналитический стандарт с массовой долей основного вещества не менее 99.5% 3-гидроксикарбофуран, аналитический стандарт с массовой долей основного вещества 98.2% Азот газообразный высокой чистоты, ТУ 301-07-25 .

Ацетон, о.с.ч. 9-5, ТУ 2633-039-4493179-00 или ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-76. н-Гексан, х.ч., ТУ 6-09-3375-78.

Натрий сернокислый безводный, ч.д.а., ГОСТ 4166-76.

Натрия хлорид, х.ч., ГОСТ 4233-77.

Пропанол ТУ 6-09-4344-77.

Флорисил для колоночной хроматографии с размером частиц 100-200 меш, фирма Мерк или аналогичный.

Соляная кислота, х.ч., 0.25 н ГОСТ 3118-78.

Стекловата.

Хлористый метилен, х.ч. ГОСТ 4233-77.

Фильтры бумажные "синяя лента", диаметр 50 мм, ТУ 6-09-1181-76.

Фильтры бумажные "красная лента", диаметр 100 мм, ТУ 2642-001-42624157-98.

Этиловый эфир уксусной кислоты, х.ч., ГОСТ 22300-76

2.3.    Приборы и посуда.

Газовый хроматограф серии "Кристалл 2000М" с ТИД.

Колонка кварцевая капиллярная длиной 20 м, внутренним диаметром 0.53 мм с неподвижной фазой НР-1 (толщина слоя 1.5 мкм).

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е или аналогичные.

Весы технические ВЛКТ-500, ГОСТ 24104-80.

/SO

Установка ультразвуковая «Серьга», ТУ 3.836.008.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74 или аналогичный. Микрошприц МШ-10, МШ- ЮМ, ТУ 2-833-106.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25 336-82.

Воронки делительные на 1000 мл ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100 см³ ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 100 см³, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1,2,5, 10см3, ГОСТ 22292-74 I (робирки градуировочные на 5,10 мл Стаканы химические, ГОСТ 25336-82Е.

Колонка стеклянная хроматографическая длиной 30 см, диаметром 10 мм.

Допускается применение другого оборудования и хроматографических колонок с аналогичными техническими характеристиками, обеспечивающими аналогичное разделение.

2.4.    Отбор проб.

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 16270-70 «Яблоки свежие ранних сортов созревания» или ГОСТ 21122-75 «Яблоки свежие поздних сортов созревания».

2.5.    Подготовка к определению.

2.5.1.    Подготовка и очистка реактивов и растворителей.

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40°С до объема 1,0 мл и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции, затем промывают водой, после чего сушат над щелочью и перегоняют.

2.5.2.    Кондиционирование колонки.

Перед началом анализа кварцевую капиллярную колонку, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе инертного газа (азот) при температуре термостата 280°С в течение 6-8 часов.

2.5.3.    Приготовление градуировочных растворов:

Основные растворы карбосульфана, карбофурана и 3-гидроксикарбофурана готовят, количественно перенося 100 мг соответствующего аналитического стандарта в мерную колбу на 100 мл, растворяют навеску в ацетоне. Из полученного раствора с концентрацией 1 мг/мл готовят рабочие растворы с концентрациями 0.001 мг/мл, 0.002 мг/мл, 0.004 мг/мл, 0.010 мг/мл последовательным разбавлением гексаном.

При определении полноты извлечения смеси карбосульфана и карбофурана и 3-гидроксикарбофурана в анализируемую матрицу вносят градуировочные растворы смеси карбосульфана и карбофурана и 3-гидроксикарбофурана в ацетоне. В 100 г измельченной на терке пробы яблок вносят 1 мл градуировочного раствора соответствующей концентрации

SS7

так, чтобы конечная концентрация анализируемого вещества ( или веществ в случае совместного определения) соответствовала 0.05, 0.1, 0.2 и 0.5 мг/кг и в течение 30 минут перемешивают на качалке. Затем ацетон удаляют в токе сухого воздуха.

2.5.4.    Построение градуировочного графика.

Для построения градуировочного графика зависимости высоты (площади) пика от концентрации карбосульфана, карбофурана и 3-гидроксикарбофурана в растворе в хроматограф вводят по 1 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют высоты (площади) пиков и строят график зависимости среднего значения высоты, мм (площади, мв/сек) пика от концентрации соответствующего компонента в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.5.    Подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта.

Флорисил прогревают в термостате при 200°С в течение 16 часов и охлаждают до комнатной температуры, добавляют по весу 3% дистиллированной воды и протряхивают на качалке 1 час. 10 г деактивированного флорисила приготавливают в 50 мл смеси гексан-этилацетат (7:3 по объему). На дно стеклянной колонки помещают стекловату, слой 0.5 см безводного сульфата натрия и заполняют через воронку суспензией подготовленного флорисила при открытом кране колонки и закрывают кран, когда уровень растворителя достигнет верхнего края сорбента. Колонка готова к работе.

2.5.6.    Проверка хроматографического поведения карбосульфана и карбофурана на колонке с флорисилом

Для проверки хроматографического поведения на колонке готовят исходный раствор карбофурана и карбосульфана в смеси гексан:эгилацетат (7:3, по объему). Для этого в мерную колбу на 50 мл количественно переносят навески по 10 мг каждого компонента и доводят до метки раствором гексан: эти л ацетат. Рабочим раствор с концентрацией 1 мкг/мл готовят последовательным разбавлением раствором гексан:этилацетат (7:3, по объему).

В подготовленную по п. 2.5.5. колонку пипеткой вносят 2 мл рабочего раствора и дают впитаться. После этого элюируют карбосульфан и карбофуран, внося в колонку 100 мл смеси гексан:этилацетат (7:3) и отбирая фракции по 10 мл. Каждую фракцию упаривают до объема 0.5 мл в роторном испарителе при температуре не более 30° С и переносят в градуированную пробирку, используя 1-2 мл гексана. Пробу в пробирке упаривают в токе азота на водяной бане при температуре не более 30°С до объема 1 мл и определяют содержание компонентов в каждой фракции газохроматографическим методом. Рассчитывают количество элюирующей смеси, необходимое для вымывания карбосульфана и карбофурана из колонки.

Примечание: профиль вымывания карбосульфана, карбофурана и 3-гидроксикарбофурана может изменяться при использовании флорисила новой партии или другой марки.

2.5.7.    Проверка хроматографического поведения 3-гидроксикарбофурана на колонке с флорисилом

Для проверки хроматографического поведения на колонке готовят исходный раствор 3-гидроксикарбофурана в смеси гексан:этилацетат (9:1, по объему). Для этого в мерную колбу на 50 мл количественно переносят навеску 10 мг 3-гидроксикарбофурана и доводят до метки

■/SJL

раствором гексан:этилацетат. Рабочий раствор с концентрацией 1 мкг/мл готовят последовательным разбавлением раствором гексан:этилацетат (9:1, по объему).

В подготовленную по п.2.5.5, колонку вносят 2 мл рабочего раствора 3-гидроксикарбофурана и дают впитаться. Компонент элюируют 100 мл той же смеси, отбирая фракции по 10 мл.

Далее поступают так же, как в п. 2.5.6.

2.6. Проведение определения

2.6.1.    Экстракция и очистка экстрактов при определении карбосульфана и карбофурана

Плоды яблони размораживают настолько, чтобы можно было вырезать 3-4 сегмента из каждого плода. Сегменты быстро натереть на крупной терке, отобрать среднюю пробу 20 г и поместить ее в коническую колбу на 250 мл, добавить 100 мл смеси гексан:пропанол (2:1 ) и поместить на ультразвуковую установку на 15 мин . Экстракт осторожно слить через промытый фильтр "красная лента" в делительную воронку на 1 л , а пробу снова залить 100 мл экстрагирующей смеси и повторить процедуру. Во второй раз пробу на фильтре промыть 10-20 мл смеси гексан:пропанол (2:1 ). К экстракту в делительной воронке добавить 100 мл насыщенного раствора хлористого натрия и встряхивать в течение 2-х минут. После полного разделения слоев нижний слой отбросить, а верхний гексановый слой отобрать в концентратор через складчатый фильтр "синяя лента" с безводным сульфатом натрия. Фильтр промыть гексаном . Объединенную гексановую пробу упарить, сухой остаток количественно перенести с помощью гексана на фильтр "синяя лента" и отфильтровать в градуированную пробирку. Пробу упарить в токе азота досуха и растворить в смеси гексан.этилацетат (7:3, по объему). При необходимости очистить на колонке с флорисилом, как в п.2.5.6.

2.6.2.    Экстракция и очистка экстрактов при определении 3-гидроксикарбофурана

Отобрать среднюю пробу 20 г, как в п.2.6.1, поместить в колбу на 500 мл, залить 200 мл 0.25 к НС1, поместить на ультразвуковую установку на 15 мин. Экстракт отфильтровать в чистую колбу через промытую стекловату, повторить процедуру со 100 мл 0.5 н НС1. Осадок на фильтре промыть 10-15 мл 0.25 н НС1. В объединенную солянокислую фракцию добавить 15 г хлористого натрия и растворить его сколько возможно на ультразвуковой установке в течение 3-5 минут. Содержимое колбы перенести в делительную воронку на 1 л и добавить 75 мл хлористого метилена, осторожно перемешать и после полного разделения фаз нижний хлорметиленовый слой отобрать в чистую колбу на 250 мл, пропуская его через безводный сульфат натрия. Повторить процедуру дважды с 50 мл хлористого метилена. Собранный экстракт поместить в морозильную камеру при -18°С на 4-5 часов, после чего отфильтровать его через фильтр " синяя лента" с безводным сульфатом натрия в чистую колбу, выпарить при температуре не выше 30°С. Остаток количественно перенести на фильтр "синяя лента" с помощью гексана и отфильтровать в градуированную пробирку . Упарить пробу в токе азота при температуре не выше 30°С до объема 1 мл. Практика показывает, что подготовленная таким образом проба, обычно не требует дальнейшей очистки. Однако, при необходимости , пробу чистят на колонке с флорисилом по п.2.5.7. В этом случае упарить пробу в токе азота досуха и растворить в смеси гексан.этилацетат (9:1, по объему).

2.6.3.    Условия хроматографирования

2.6.3.1. Условия хроматографирования для определения карбосульфана и карбофурана

Газовый хроматограф "Кристалл 2000М" с ТИД. Колонка кварцевая капиллярная длиной 20 м, внутренним диаметром 0.53 мм с неподвижной фазой НР-1 (толщина слоя 1.5 мкм).

/S3

Температура термостата колонки программируется от 120 С°(30 сек) до 180°С со скоростью 10 С °/мин, от 180 С°(10 сек) до 260°С со скоростью 20°С/мин.Температура термостатов испарителя 250°С, детектора 350°С.

Скорость газа-носителя 1(азот) через колонку 10 см ¹/мин, газа-носителя 3 (азот) 30 см¹/мин. Сброс газа-носителя 2 (азот) закрыт в течение 10 сек, далее расход 30 см¹/мин.

Расход водорода 15.5 см¹/мин.

Расход воздуха 220 см¹/мин.

Объем вводимой пробы 1 мкл. Время удерживания карбосульфана -11 мин 27 сек, карбофурана- 6 мин 59 сек.

2.6.3.2. Условия хроматографирования для определения 3-гидроксикарбофурана

Газовый хроматограф "Кристалл 2000М " с ТИД. Колонка кварцевая капиллярная длиной 20 м, внутренним диаметром 0.53 мм с неподвижной фазой НР-1 (толщина слоя 1.5 мкм ). Температура термостата колонки программируется от 120°С (30 сек) до 200°С со скоростью 15°С/мин. Температура термостатов детектора 350°С, испарителя 250°С.

Скорость газа-носителя (азот) через колонку 10 см¹/мнн, газа-носителя З(азот) 25 см¹/мин. Сброс газа-носителя 2 (азот) закрыт в течение 10 сек, далее расход 30 см¹/мин.

Расход водорода 15.5 см¹/мин.

Расход воздуха 220 см¹/мин.

Объем вводимой пробы 1 мкл. Время удерживания 3-гидроксикарбофурана 6 мин 39-41с.

2.6.4. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание карбосульфана в пробе с учетом его основных метаболитов (карбофурана и 3-гидроксикарбофурана) в эквиваленте действующего вещества (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

(X, + X₂*K,+ X₃*K₂)V Р

где Xi, Х₂, Xj- концентрации карбосульфана, карбофурана и З-гидроксикарбофурана, найденные по градуировочным графикам, мкг/мл;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см¹;

Р - навеска анализируемого образца, г;

Kj и К₂ - коэффициенты пересчета содержания карбофурана и 3-гидроксикарбофурана на эквивалент карбосульфана (К| * 1.72, К₂ - 1.6).

Содержание остаточных количеств определяемого компонента в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочные растворы с концентрацией 0.5 мг/мл, разбавляют гексаном.

При выполнении измерений с использованием газового и жидкостного хроматографов соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

4.    Контроль погрешности измерений.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6. 2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

5.    Разработчики.

Довженко В.И., Цибульская И.А., Карпова Л.М.

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.

1

Требования техники безопасности.

При работе с реактивами соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005-88).