«УТВЕРЖДАЮ»

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека,

Главвый'Гб^гарстеенный санитарный врач РФ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ХИЗАЛОФОП-П-ЭТИЛА И ПРОПАКВИЗАФОПА В СЕМЕНАХ И МАСЛЕ РАПСА И ПРОПАКВИЗАФОПА В КОЧАНАХ КАПУСТЫ ПО ОСНОВНОМУ МЕТАБОЛИТУ ХИЗАЛОФОП-П КИСЛОТЕ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1. Вводная часть.

1.1.    Краткая характеристика препаратов.

1.1.1.    Краткая характеристика препаратов Леопард, КЭ.

Фирма-производитель: "Аган Кемикал Мэньюфекчерэз Лимитед Лтд.".

Действующее вещество (д.в.): хизалофоп-П-этил.

Название д.в. по номенклатуре ИЮПАК: (Я)-2-[4-[(6-хлорхиноксалин-2-илокси)-фенокси] пропионовой кислоты этиловый эфир.

Структурная формула д.в.:

С1

Эмпирическая формула д.в.: C19H17CIN2O4.

Молекулярная масса д.в.: 372,8.

Химически чистое вещество: светло-коричневые кристаллы.

Температура плавления д.в.: 76-77°С.

Давление пара д.в. при 20°С: 0,011 мПа.

Растворимость д.в. (г/л) при 20°С: в воде - 0,0004, в гексане - 5,0 , этаноле - 22, ксилоле - 360, ацетоне - 650.

Стабильность д.в.: устойчив к действию света, разлагается до хизалофоп-П кислоты под действием разбавленных кислот и щелочей.

Острая пероральная токсичность препаратов (LD50) для крыс - 1180-1210 мг/кг, для мышей - 1750-1800 мг/кг. Не оказывает раздражающего действия на кожу.

Гигиенические нормативы: МДУ для рапса в России не установлен.

1.1.2. Краткая характеристика препарата Шогуи, КЭ.

Фирма производитель: "Аган Кемикал Мэньюфекчерэз Лимитед Лтд.".

Действующее вещество (д.в.): пропаквизафоп.

Название д.в. по номенклатуре ИЮПАК: (Я)-2-[4-((6-хлорхиноксалин-2-илокси)-фснокси] пропионовой кислоты 2-изопропилиденаминооксиэтиловый эфир.

Структурная формула д.в.:

Эмпирическая формула д.в.: C22H22CIN3O5.

Молекулярная масса д.в.: 443,9.

Химически чистое вещество: кристаллическое вещество без запаха.

Температура плавления д.в.: 62-64,5°С.

Давление пара д.в. при 20°С: 1,3'Ю*⁹ Па.

Растворимость д.в. (г/л) при 25°С: в воде - 0,0019, в ацетоне, ацетонитриле и толуо-не >250, в хлороформе и метаноле >100.

Стабильность д.в.: разлагается до хизалофоп-П кислоты под действием разбавлен-

пых кислот и щелочей.

/*¥■

пробирку со шлифом емкостью 5,0 мл и упаривают растворители досуха в токе азота при температуре +50°С.

2.6.2.2. Метилирование.

После охлаждения до комнатной температуры в пробирку с сухим остатком добав-пяют 2,0 мл свежеприготовленного эфирного раствора диазометана (по п.2.4.4.). Пробирку закрывают притертой пробкой и ставят на 12-14 часов (на ночь) в холодильник с температурой +4-6°С. После этого этиловый эфир в пробирке упаривают досуха в токе азота при комнатной температуре. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл изооктана и проводят количественное определение хизалофоп-П кислоты по п.2.6.3.

2.6.3. Условия хроматографирования.

Газовый хроматограф с ТИД.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая длиной 15 м, внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой SE -52, толщина слоя - 0,45 мкм.

Температура колонки: программирование от 180°С (1 мин) до 280°С (15 мин) со скоростью 10°С/мин. Температура испарителя: 250°С. Температура детектора: 290°С.

Расход газов: газа-носителя (гелий марки "А") - 2,5 см³/мин, водорода и воздуха к ТИД - 30 и 250 см³/мин соответственно, дополнительного газа (гелий марки "А") к ТИД -30 см³/мин. Объем вводимой пробы: 2 мкл.

Время удерживания хизалофоп-П кислоты (в виде производного): 13,7±0,1мин.

Предел детектирования: 0,25 нг.

Линейный диапазон детектирования: 0,5-4,0 нг.

2.6.4. Обработка результатов анализа.

Содержание хизалофоп-П кислоты рассчитывают методом внешнего стандарта по формуле:

НхАхУ

X» - ,    где:

Н_стхт

X - содержание хизалофоп-П кислоты в пробе, мг/кг,'

Я - высота (площадь) пика анализируемого вещества, мм (мм²),

Н_Сш - высота (площадь) пика стандартного вещества, мм (мм²),

А - концентрация стандартного рабочего раствора хизалофоп-П кислоты, мкг/мл,

V- количество экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл.

m - масса (г) аналитической пробы.

Пересчет на содержание хизалофоп-П-этила (X/) проводят по формуле: X/ = 1ЩХ Пересчет на содержание пропаквизафопа {Xj) проводят по формуле: Хт= 1,2% Х

3.    Требования техники безопасности.

При работе с реактивами соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005-88).

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

4.    Контроль погрешности измерений.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соогветствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6. 2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

5.    Разработчики.

П.А.Тарарин, Т.А. Маханькова, Л.В. Григорьева, Е.И.Кожемякова (ВНИИ защиты растений, Санкт-Петербург).

Острая пероральная токсичность препарата (LD50) для крыс > 5000 мг/кг. Не оказывает раздражающего действия на кожу, умеренно раздражает глаза кроликов.

Гигиенические нормативы: МДУ для капусты, семян и масла рапса нс установлены. 1.1.3. Краткая характеристика хизалофоп-П кислоты.

Название по номенклатуре ИЮПАК: (Я>2-[4-[(6-хлорхиноксалин-2-илокси)фен-окси] пропионовая кислота.

Структурная формула:

Эмпирическая формула д.в.: C17H13CIN2O4. Молекулярная масса д.в.: 344,8.

2. Метод определения хизалофоп-П-этила и пропаквизафопа в семенах и масле рапса и пропаквизафопа в кочанах капусты по основному метаболиту хизалофоп-П кислоте с применением капиллярной газожидкостной хроматографии.

2.1.    Основные положения.

2.1.1.    Принцип метода.

Метод основан на количественном определении хизалофоп-П кислоты, основного метаболита хизалофоп-П-этила и пропаквизафопа, и включает извлечение остаточных количеств хизалофоп-П кислоты из анализируемого объекта органическими растворителями, очистку экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и метилирование хизалофоп-П кислоты диазометаном. Количественное определение проводят методом внешнего стандарта с применением капиллярной газожидкостной хроматографии и использованием термоионного детектора (ТИД).

2.1.2.    Избирательность метода.

Метод специфичен в присутствии других применяемых в сельском хозяйстве пестицидов. Способы очистки экстрактов, а также применение селективного детектора и ка-

пиллярной колонки позволяет устранять влияние коэкстрактивных веществ на результаты анализа.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода.

Диапазоны измеряемых концентраций, пределы обнаружения и другие метрологические параметры метода представлены в таблицах 1 и 2.

Метрологические параметры метода.

Таблица 1.

Метрологические параметры Анализируемые объекты: Кочаны капусты Семена рапса Масло рапса Предел обнаружения, мг/кг 0,01 0,01 0,025 Диапазон определяемых концентраций, мг/кг 0,01-0,08 0,01-0,08 0,025-0,2 Среднее значение определения, % 82,1 79,0 8U Стандартное отклонение, % 4,9 5,5 6,5 Относительное стандартное отклонение, % 2,6 3,1 3,4

Таблица 2. Полнота определения хизалофоп-П кислоты в модельных пробах (п=6).

Анализируемые объекты Внесено, мг/кг Извлечено, % Доверительный интервал среднего результата, % Кочаны капусты 0,01 78,3 ±5,7 0,02 80,1 ±5,1 0,04 83,6 ±4,8 0,08 86,4 ±4,3 Семена рапса 0,01 70,5 ±6,5 0,02 76,1 ±5,8 0,04 81,8 ±5,1 0,08 87,5 ±4,7

Масло рапса	0,025	76,7	±7,3
	0,05	79,3	±6,8
	0,1	82,6	±6,1
	0,2	85,8	±5,7

2.2.    Реактивы, растворы, материалы.

Аналитический стандарт хизалофоп-П кислоты.

Азот газообразный высокой чистоты, ТУ 301 >07-25-89.

Ацетон, осч, ТУ 2633-004-11291058-94.

Ацетонигрил для хроматографии, хч, ТУ 6-09-4326-76.

Вата медицинская, ТУ 9393-001-00302238-97.

Вода дистиллированная и перегнанная над КМпОд и щелочью. н-Гексан, хч, ТУ 6-09-3375-78.

Дихлорметан, хч, ТУ 6-09-2662-77.

Изооктан эталонный, ГОСТ 12433-83.

Калия гидроокись, чда, ГОСТ 24363-80.

Натрий сернокислый б/в (сульфат), чда, ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, чда, ГОСТ 4233-77.

N-Нитрозометилмочевина, хч, ТУ 6-09-11-1643-82.

Серная кислота, осч, ГОСТ 14262-78.

Спирт этиловый ректификат (этанол), ГОСТ 17299-78.

Фильтры бумажные, красная лента, ТУ 2642-001-42624157-98.

Фильтры бумажные, белая лента, ТУ 2642-001-42624157-98.

Фильтры бумажные, синяя лента, ТУ 2642-001-42624157-98.

Эфир этиловый (серный), ОСТ 84-2006-88.

2.3.    Приборы, аппаратура, посуда.

Хроматограф газовый с ТИД.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая длиной 15 м, внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой SE-52, толщина слоя - 0,45 мкм.

Аппарат для встряхивания, ТУ 64-1-1081-73 или аналогичный.

Весы аналитические типа ВЛА-200, ГОСТ 34104-80.

Весы лабораторные типа ВЛКТ-500, ГОСТ 24104-80.

Воронки делительные емкостью 250 и 500 мл, ГОСТ 25336-82.

Воронки химические конусные, ГОСТ 25336-32.

Индикаторная бумага универсальная, ТУ 6-09-1181-76.

Колбы-концентраторы емкостью 100 и 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы плоскодонные емкостью 100 и 300 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные со шлифом емкостью 25, 50, 100 мл, ГОСТ 1770-74.

Колпачки алюминиевые для герметизации флаконов, ГОСТ Р.51314-99.

Мельница электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236-79 или аналогичная.

Микрошприц Mill-10, ТУ 2-833-106.

Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.

Ротационный вакуумный испаритель типа ИР-1 или аналогичный.

Пипетки мерные емкостью 1,2,5 и 10 мл, ГОСТ 20292-74.

Приспособление для обжима колпачков на флаконах, ТУ 42-2-2442-73.

Пробирки мерные со шлифом емкостью 5,0 мл, ГОСТ 1770-74.

Стаканы химические на 100, 200 и 500 мл, ГОСТ 25336-82.

Установка для перегонки растворителей при атмосферном давлении.

Установка для упаривания растворителей в токе азота.

Установка ультразвуковая "Серьга" УЗМ002 или аналогичная.

Флаконы стеклянные (типа пенициллиновых) емкостью 5,0 мл, ТУ 64-2-10-87.

Электроплитка, ГОСТ 14919-83.

2.4. Подготовка к определению.

2.4.1.    Подготовка и очистка растворителей.

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40°С до объема 1,0 мл и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в coin ветствии с общепринятыми методиками.

2.4.2.    Приготовление стандартных растворов.

Основной раствор хизалофоп-П кислоты с содержанием 100 мкг/мл готовят раство-рснием в смеси ацетон : этанол (80:20) 0,01 г аналитического стандарта в мерной колбе гм костью 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре +4-6°С не более трех месяцев.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 4,0,2,0,1,0 и 0,5 мкг/мл готовят in основного стандартного раствора хизалофоп-П кислоты соответствующим последова-гсльным разбавлением ацетоном.

Для приготовления калибровочных растворов в мерные пробирки со шлифом емкостью 5,0 мл вносят по 1,0 мл рабочих растворов хизалофоп-П кислоты с концентрациями 0,5 , 1,0,2,0 и 4,0 мкг/мл. Растворители в пробирках упаривают в токе азота досуха и проводят метилирование хизалофоп-П кислоты.

В пробирки добавляют по 2,0 мл свежеприготовленного эфирного раствора диазометана (п.2.4.4.), закрывают притертыми пробками и ставят на 12-14 часов (на ночь) в холодильник с температурой +4-6°С. После этого этиловый эфир в пробирках упаривают досуха в токе азота при комнатной температуре. Сухой остаток растворяют в 1,0 мл изооктана и хроматографируют по п.2.6.3.

2.4.3.    Построение калибровочного графика.

Для построения калибровочною графика в инжектор хроматографа вводят по 2 мкл приготовленных по п.2.4.2, растворов, содержащих хизалофоп-П кислоту (в виде хиза-лофоп-П-метила) в концентрациях 0,5,1,0, 2,0 и 4,0 мкг/мл. Осуществляют не менее трех параллельных измерений и находят среднее значение высоты (площади) хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты (площади) хроматографического пика в мм (мм²) от концентрации хизалофоп-П кислоты в рабочем растворе в мкг/мл.

2.4.4.    Приготовление эфирного раствора диазометана (из расчета метилирования хизалофоп-П кислоты в экстрактах 2-х проб).

W-Нитрозометилмочевину массой 0,5 г помещают во флакон емкостью 2,0-3,0 мл и герметизируют резиновой пробкой и колпачком с помощью приспособления для обжима колпачков на флаконах. Этиловый эфир объемом 4,0 мл вносят в другой флакон емкостью 5,0 мл, герметизируют резиповой пробкой и колпачком и охлаждают в морозильной камере холодильника в течение 30 минут.

После этого флаконы через предварительно проколотые пробки соединяют гибкой тефлоновой трубкой (внутр.диам. ~ 1,5-2,0 мм), одним концом погружая ее в этиловый эфир на всю глубину (флакон с охлажденным этиловым эфиром обязательно должен еще иметь свободный выход в атмосферу). Во флакон с нитрозометилмочевиной, используя шприц с топкой иглой и прокалывая пробку, добавляют по каплям по стенке 50% водный раствор гидроокиси калия (~ 0,3 мл) до прекращения реакции. Этиловый эфир при насыщении диазометаиом окрашивается в ярко желтый цвет.

Внимание ! Приготовление эфирного раствора диазометана и процедуру метилирования необходимо обязательно проводить в работающем вытяжном шкафу.

2.5. Отбор и хранение проб.

S3&

Отбор проб рапса для анализа проводят в соответствии с ГОСТ 10852-36 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб», отбор проб капусты проводят в соответствии с ГОСТ 1724-85 «Капуста белокочанная свежая. Заготовка и поставка» или ГОСТ 7967-87 «Капуста краснокочанная свежая. Заготовка и поставка».

Для длительного хранения аналитические пробы кочанов капусты помещают в морозильную камеру с температурой -18°С и хранят в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре.

Пробы семян рапса просушивают до стандартной влажности и хранят в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре. Перед анализом пробы семян рапса рассыпают на бумаге или кальке и пинцетом удаляют включения. Семена измельчают на лабораторной мельнице и после перемешивания измельченной массы отбирают усредненную аналитическую пробу.

Пробы масла рапса хранят при +4-6°С в закрытой стеклянной таре.

2.6. Проведение определения.

2.6.1.    Кочаны капусты и семена рапса.

2.6.1.1.    Экстрагирование и очистка экстракта.

Аналитическую пробу массой 25,0±0,1 г помещают в плоскодонную колбу емкостью 300 мл и добавляют к пробе кочанов капусты 150 мл смеси ацетон : этанол (80:20), а к пробе семян рапса 150 мл смеси ацетон : этанол : бидистилированная вода (70:20:10). Содержимое колбы слегка встряхивают и подвергают обработке ультразвуком в УЗ-бане в течение 10 минут. После этого экстракт фильтруют через бумажный фильтр белая лента п колбу-концентратор емкостью 250 мл. Содержимое колбы с пробой промывают 50 мл ацетона, который также фильтруют в колбу-концентратор.

При использовании аппарата для встряхивания в колбу с аналитической пробой кочанов капусты вносят 150 мл смеси ацетон : этанол (80:20), а к пробе семян рапса добавляют 150 мл смеси ацетон : этанол : бидистилированная вода (70:20:10). Содержимое колбы встряхивают в течение 60 минут. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр белая лента в колбу-концентратор емкостью 250 мл. Содержимое колбы с пробой промывают 50 мл ацетона, который также фильтруют в колбу-концентратор.

Колбу-концентратор с объединенным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители до объема 10-20 мл при температуре <40°С. В колбу-концентратор добавляют 200 мл бидистиллированной воды, 5,0 мл 10% полного раствора гидроокиси калия, перемешивают встряхиванием и помещают в холо-

/33

днлъник с температурой +4-6°С на 2 часа. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр красная лента в делительную воренку емкостью 500 мл. К содержимому воронки добавляют 10 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия, 75 мл дихлорметана и воронку встряхивают в течение 2-х минут. После 5-ти минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Эту процедуру очистки экстракта повторяют с использованием 50 мл дихлорметана. Далее в воронку добавляют 40 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия, приливают 75 мл н-гексана и встряхивают содержимое воронки в течение 2-х минут. После 5-ти минутного отстаивания нижний водный слой собирают в химический стакан емкостью 300 мл, а верхний гексановый слой сливают и отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до pH 2,0 и переносят в чистую делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 75 мл смеси гексан : этиловый эфир (80:20) и встряхивают в течение 2-х минут. После полного разделения слоев нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний гексано-эфирный слой фильтруют через фильтр синяя лента со слоем безводного сульфата натрия (толщина слоя - 1,0-1,5 см) в колбу-концентратор емкостью 150 мл. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 мл смеси гексан : этиловый эфир (80:20). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители до объема 3-5 мл при температуре +40°С. Остаток экстракта количественно переносят из колбы-концентратора в мерную пробирку со шлифом емкостью 5,0 мл и упаривают растворители досуха в токе азота при температуре +50°С.

2.6.1.2.    Метилирование.

После охлаждения до комнатной температуры в пробирку с сухим остатком добавляют 2,0 мл свежеприготовленного эфирного раствора диазометана (но п.2.4.4.). Пробирку закрывают притертой пробкой и ставят на 12-14 часов (на ночь) в холодильник с температурой +4-6°С. После этого этиловый эфир в пробирке упаривают досуха в токе азота при комнатной температуре. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл изоокгана и проводят количественное определение хизалофоп-П кислоты по п.2.6.3.

2.6.2.    Масло рапса.

2.6.2.1. Экстрагирование и очистка экстракта.

Аналитическую пробу масла массой 10,0±0,1 г растворяют в 50 мл гексана (насыщенного ацетонитрилом) в плоскодонной колбе емкостью 100 мл и после этого гексано-

rs?

вый раствор масла переносят в делительную- воронку емкостью 250 мл. Колбу промывают 50 мл ацетонитрила (насыщенного гексаном) и также переносят его в воронку. Содержимое воронки встряхивают в течение 2-х минут. После 5-ти минутного отстаивания нижний ацетонитрильный слой сливают в колбу-концентраггор емкостью 250 мл. В делительную воронку добавляют еще 50 мл ацетонитрила (насыщенного гексаном). Содержимое воронки встряхивают в течение 2-х минут, отстаивают и нижний ацетонитрильный слой объединяют в колбе-концентраторе с предыдущим. Верхний гексановый слой отбрасывают.

Колбу-концентрагор с объединенным ацетонитрильным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворитель до объема 10-20 мл при температуре +50°С. В колбу-концентратор добавляют 200 мл дистиллированной воды, 5,0 мл 10% водного раствора гидроокиси калия, раствор перемешивают встряхиванием и выдерживают 2 часа в холодильнике с температурой +4-6°С. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр белая лента в делительную воронку емкостью 500 мл. К содержимому воронки добавляют 10 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия, 75 мл дихлормстана и воронку встряхивают в течение 2-х минут. После 5-ти минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Эту процедуру очистки экстракта повторяют два раза с использованием каждый раз по 50 мл дихлорметана. Далее в воронку добавляют 40 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия, приливают 75 мл н-гексана и встряхивают содержимое воронки в течение 2-х минут. После 5-ти минутного отстаивания нижний водный слой собирают в химический стакан емкостью 300 мл, а верхний гексановый слой сливают и отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до pH 2,0 и переносят в чистую делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 75 мл смеси гексан : этиловый эфир (80:20) и встряхивают в течение 2-х минут. После полного разделения слоев нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний гексано-эфирный слой фильтруют через фильтр синяя лента со слоем безводного сульфата натрия (толщина слоя ~ 1,0-1,5 см) в колбу-концентратор емкостью 150 мл. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 мл смеси гексан : этиловый эфир (80:20). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители до объема 3-5 мл при температуре +40°С. Остаток экстракта количественно переносят из колбы-концентратора в мерную

■/JS'