УТВЕРЖДАЮ Главный государственный санитарный врач Российской Федерации, Руководитель Федеральной службы по game прав потребителей и
итшолучия человека
*_л_»
Дата введения:
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТ АТ ОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ КЛОМАЗОНА В СЕМЕНАХ И МАСЛЕ РАПСА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определен1» в семенах и масле рапса массовой концентрации Кломазона в диапазоне 0,02 - 0,2 иг/кг.
Кг.омазон - действующее вещество препарата Комманд; КЭ, 480 г/д» фирма - производитель- ФМС Евро НВ;
Название дейстгующего вещества по ИЮ ПАК: 2-(2-хлорбензил)-4,4-днмстил-1,2-оксазолидин-3-он, или 2-(2-хлорбснзил)-4,4-диметил-1 Д-оксазолндик-З-он; структурная формула:
CI
Эмпирическая формула: CqHmCINOj;
молекулярная масса: 239,7;
удельная масса: 1,192 (при 20°С);
агрегатное состояние- жидкость;
цвет, запах: светло-коричневый, запах рыбы;
температура кипения: 275,4 °С;
летучесть (давление паров): 19,2 мПа (при 25 °С);
S9
растворимость в воде при 25 °С: 1,1 г/л; в органических растворителях - хорошо растворим: в хлороформе, ацетоне, циклогексаноне, гексане, метаноле, ацетонитриле, хлористом метилене, толуоле, гептане;
коэффициент распределения в системе октанол/вода при 25 °С: Kow logP~2,5.
Устойчив при хранении; при комнатной температуре может храниться без изменений в течение года, при 50 °С - в течение 3 мес.
Период полуразложения в водном растворе на свету более 30 сут, в почве - 30-135 сут (в зависимости от почвенно-климатических условий).
Краткая гигиеническая характеристика:
Кломазон относится к умеренно опасным веществам: острая оральная токсичность - ЛД5о(крысы) - 1369-2077 мг/кг, накожная токсичность - ЛД5о(кролики) > 2000 мг/кг, ингаляционная токсичность ЛК5о(крысы, 4 часа) - 4,8 мг/л воздуха. Препарат слабо раздражает кожу н конъюнктиву, опасен при вдыхании паров. В опытах по изучению тератоген-ности и мутагенности отрицательного действия на подопытных животных не наблюдается. В России установлены следующие гигиенические нормативы для Кломазона:
ВМДУ (мг/кг): соя (семена и масло) - 0,01; рис - 0,2; рис (солома) - 0,1; рапс (семена, масло) - 0,1 мг/кг.
Область применения:
Кломазон - системный гербицид из группы изоксазолндянонов, ингибирующий биосинтез каратиноидс в в растениях. Препарат Команд, КЭ, 480 г/л, рекомендуется для борьбы с однолетними двудольными н злаковыми сорняками в посевах рапса с максимальной нормой расхо/а 0,2 л/га.
1. Метрологическая характеристика метода.
Се¥£Ца радса
Предел обнаружения: 0,02 мг/кг
Диапазон определяемых концентраций: 0,02- 0,20 мг/кг
Среднее значение извлечения: 75%
Стандартное отклонение: 6,5%
Доверительный интервал среднего результата: + 3,3%
М-а£Д9. шсаПредел обнаружения: 0,005 мг/кг
Диапазон определяемых концентраций: 0,005- 0,100 мг/кг Среднее значение извлечения: 80%
■/РО
Стандартное отклонение: 4,2%
Доверительный интервал среднего результата: + 2,1%
Таблица
Полнота извлечения Кломазона из семян и масла рапса (6 повторностей для каждой концентрации, Р " 0,95) |
Предел обнаружения,
мг / кг (л) |
Среднее значение
определения, мкг / кг (л) |
Полнота
определения,
% |
Стандартное
отклонение
SD, % |
Доверительный интервал
среднего результата
± SE, % |
Семена рапса |
0,020 |
0,015 |
75 |
6,5 |
3.3 |
0,040 |
0,030 |
75 |
3.1 |
1.9 |
0,100 |
0,798 |
78 |
4,7 |
2а |
0,200 |
0,159 |
79 |
4,2 |
2,1 |
Масло рапса |
0,005 |
0,004 |
80 |
4,2 |
2,1 |
0,010 |
0,008 |
82 |
2.6 |
U |
0,020 |
0,015 |
78 |
2,1 |
1,1 |
0,100 |
0,077 |
77 |
3,7 |
1.8 |
|
2. Метод измерений
Метод основан на извлечешш Кломазона из масла рапса подкисленным водным ацетонитрилом, переэкстракцли в н-гексан, очистке полученного экстракта от мешающих г зализу веществ на колонке, заполненной оксидом алюминия; а из семян рапса - экстракцией н-гексаном с последующей очисткой экстракта от мешающих анализу веществ и с окончательным определением Кломазона методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора при длине волны 240 нм.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен и может применяться для определения остатков Кломазона в семенах и масле рапса в присутствии других пестицидов.
3. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА,
РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ.
3.1. Средства измерений Высокоэффективный жидкостный хроматограф «Beckman System Gold» с ультрафиолетовым детектором “Spectroflow 757”;
/Р/
Весы аналитические FX-40 A &D Company, АД-20, ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е Весы лабораторные технические ВЛТК-500 ГОСТ 7328;
Мономер модель И-135, ТЗАП;
Колбы мерные вместимостью 50 и 100 мл, ГОСТ 1770-74;
Микро пинетки (для нанесения растворов), вместимостью 0,1-0,2 мл, ГОСТ 20-292-74; Микрошприцы Гамильтон, вместимостью 100 мкл;
Пипетка цифровая автоматическая с максимальной вместимостью 5 мл, Aldrich, Wheaton. Допускается использование средств измерения с аналогичными ила лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
Кломазон аналитический стандарт (FMC 57020) с содержанием 99,7% д.в. (фирма ФМСи); Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72;
Ацетонитрил, х.ч., ТУ 6-09-06-1092-83;
Ацетон, ч.да., ГОСТ 2603-79;
H-гексАН, ч., ТУ 6-09-3375-78;
Соляная кислота, х.ч,, ГОСТ 3118-77;
Ортофосфориая кислота, х.ч., ГОСТ 61-75;
Метанол, х.ч., ТУ 6-09-11-1643-82;
Натр едкий, ч.д.а, ГОСТ 4328-77,20%-ный раствор;
Натрия сульфат безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76;
Алюминия оксид (АЬОэ (нейтр.), L40/2S0, М-Ю1,96), Chemopol;
Стандартный раствор Кломазоыа в метаноле - 100 мкг/мл (хранить в холодильнике, срок годности 120 сут).
Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.
3.3. Вспомогательные устройства, материалы Самописец, модель ВД40 Kipp & Zonen;
Стальная колонка для ВЭЖХ Ultrasphere ODS (4,6x250 мм), 5 мкм;
Аппарат для встряхивали* проб АВУ-1, ТУ 64-1-1081-7;
Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi или ИР-1М, ТУ 25-11-917-74 с водяной баней;
Воронки химические, ГОСТ 25ЭЭ6-82Е;
Воронки делительные иа 250 мл, ГОСТ 10054-75;
/At
Воронки Бюхнера, ГОСТ 9147-81;
Колбы конические плоскодонные вместимостью 250 и 500 мл, ГОСТ 10394-72;
Колбы Бунзена, ГОСТ 6514-74;
Колбы грушевидные (концентраторы), ГОСТ 10394-74;
Бумажные фильтры «синяя лента» диаметром 11,0 см, обсэзоленные, ТУ 6-09-1678-86; Универсальная индикаторная бумага, Merck;
Стекловата, Serva, 22367;
Палочки стеклянные.
Допускается применение хроматографических колонок н другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4. Требования безонасностн
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.
К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.
6. Условия измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20±5)°С и относительной влажности не более 80%.
• выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
/Pi
7. Подготовка к выполнению измерений
7.1. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ
В колбу на 1000 мл вносят 600 мл метанола, добавляют 390 мл б иди стиллиро ванной воды и 10 мл ортофосфорной кислоты. Полученный раствор метанол : вода: орто фосфорная кислота (60:39:1 по объему) фильтруют и дегазируют.
7.2. Кондиционировалие колонки
Промывают колонку для ВЭЖХ системой метанол:вода:ортофосфорная кислота (60:39:1 по объему) в течение 30 мин при скорости подачи подвижной фазы 1,5 мл/мин. Включают детектор и ожидают стабилизацию базовой линии (10-20 мин).
7.3. Подготовка набивной колонки, заполненной оксидом алюминия, для очистки экстракта масла рапса
На дно пластиковой хроматографической колонки (высота 60 мм, диаметр 10 мм) помещают пробочку из стекловаты. В колонку осторожно вносят, аккуратно постукивая по ее стенке стеклянной палочкой для равномерного уплотнения (распределения) фазы,
1 г оксида алюминия Активацию готовой колонки проводят порционно пропуская н-гексан по 2 мл х 3 раза. Смывы отбрасывают. Хроматографическую колонку плотно закрывают пробкой хранят до использования.
7.4. Приготовление рабочих растворов
2«1кДШЗШаДИЦ£ Раствора соляной киелрты
2 мл концентрированной соляной кислоты переносят в мерную колбу на 1л. добавляют 600-700 мл бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения кислоты и доводят водой до метки.
7.4.2. Приготрр/книЕ РР9ТР9Р» «А»
50 мл метанола вносят в мерную кодбу вместимостью 1л, добавляют 600-700 мл 0,024н. раствора соляной кислоты, перемешивают до полного растворения вещества и доводят 0,024н. раствором содяиой кислоты до метки.
7.5. Приготовление стандартных растворов
10 мг Кломазоыа (аналитического стандарта) вносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют навеску в метаноле и доводят объем до метки метанолом (стандартный раствор №1, концентрация 100 мкг/мл). Раствор хранится в холодильнике около 120 суг.
Методом последовательного разбавления исходного раствора №1 раствором «А», готовят рабочие растворы Кломазоыа с концентрацией 0,05; 0.1; ОД; 0.5; 1,0 мкг/мл, которые могут храниться в холодильнике ые более 30 сут.
•/#
7.6. Построение градуировочного графика
Для построения градуировочного графика в инжектор хроматографа вводят по 100 мкл рабочего раствора Кломазона с концентрацией 0,05; 0,1; ОД; 0,5; 1,0 мкг/мл. Проводят не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации.
По полученным данным строят градуировочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации Кломазона в растворе в мкг/мл (рисунок).
8. Отбор н хранение проб
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», №2051-79 утв. 21.08.79 г.
Пробы семян и масла рапса в стеклянной или инертной полиэтиленовой таре хранят при температуре 0-4 °С в течение не более 7 сут, для длительного хранения используется более низкая температура - -18°С.
9. Выполнение определения
9.1. Экстракция гербицида из анализируемой пробы
Сецеда.вапса
Растительную пробу - семена рапса грубого помола (массой 10 г) помещают в коническую колбу на 250 мл. Приливают 50 мл н-гексана и экстрагируют при встряхивании 1 ч. Экстракт фильтруют в колбу на 250 мл через безводный сульфат натрия, помещенный на двойной складчатый фильтр (синяя лента). Экстракцию повторяют с 50 мл н-гексана в течение 30 мин. Фильтр с осадком промывают дважды 5 мл н-гексана. Объединенный фильтрат переносят в концентратор и при температуре 40°С выпаривают н-гексан, используя вакуумный роторный испаритель. Сухой остаток растворяют в 1 мл раствора «А» и хроматографируют.
9.1.2. Масло рапса
Навеску масла рапса (10 мл) помещают в колбу вместимостью 250 мл, приливают 20 мл смеси ацетонитрил : 0,024н. соляной кислоты (1:1) и в течение 5 мин на аппарате для встряхивания содержимое колбы перемешивают. После расслаивания прозрачный слой отфильтровывают через бумажный фильтр “синяя лента” в концентратор вместимостью 100 мл. Операцию повторяют дважды с 30 мл подкисленного водного раствора аце-
/йГ
тонитрнла (1:1). Водно-ацетонитрильную фазу объединяют в концентраторе, масляный слой отбрасывают. Из объединенных экстрактов, используя роторный вакуумный испаритель, при 55 °С выпаривают ацетонитрил. Водный остаток переносят в делительную воронку, добавляют 10 мл дистиллированной воды и реэкстрагируют Кломазон трижды н-гексаном, добавляя каждый раз 15 мл растворителя и встряхивая 1 мин. Гексановые экстракты объединяют в концентраторе, пропуская через безводный сернокислый натрий, и упаривают до 1 мл при 40°С. Водную фазу отбрасывают.
9.1_.3. Очистка экстракта на набирндй кол^шее^аполвеыной окисью алюминия
Объединенный экстракт уиаривают до 1,0 мл на роторном вакуумном испарителе при температуре водяной бани 40 °С. Затем остаток переносят на хроматографическую колонку с окисью алюминия, и после впитывания растворенного в н-гексане образца проводят последовательное элюирование: №1 - 6 мл н-гексана (элюат отбрасывают); Х«2 - 2 мл смеси гексан:ацетои (1:1) (элюат отбрасывают); №3 - 6 мл смеси гексан.ацетон (1:1) (элюат собирают). Собранный элюат №3 помещают в концентратор и выпаривают досуха при температуре 45 °С.
Сухой остаток после очистки растворяют в 1-5 мл раствора «А» н хроматографируют.
9.2. Условия хроматографирования
Высокоэффективный жидкостный хроматограф "Beckman System Gold” с УФ-детектором:
стальная колонка .для ВЭЖХ Ultrasphere ODS (4,6x250 мм), 5 мкм; температура колонки - комнатная;
- подвижная фаза - метанол + вода + ортофосфорная кислота (60:39:1 по объему); расход подвижной фазы - 1,0 мл/мин (для образцов семян рапса) и 1,5 мл/мин (для образцов масла);
длина волны УФ-детектора - 240 нм;
- аггеньюация - 0,01 -0,02 ед. абсорбции на шкалу;
• вводимый объем пробы- 100мкл;
- абсолютное время удержания Кломазона - 9 мин;
- минимально детектируемое количество Кломазона в анализируемом объеме - 1 нг,
- линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2-20 нг.
/оь
Количественное определение Кломазона проводят по методу абсолютной калибровки посредством сравнения с хроматограммами стандартных растворов Кломазона с концентрацией 0,005 - 1,0 мкг/мд.
10. Обработка результатов анализа
Для определения содержания Кломазона в пробах методом ВЭЖХ используют следующую формулу:
Г , h«'C~'V.
06 h^tm,
где С об - содержание вещества в пробе, мг/кг (л); Сш - количество стандарта вещества, введенного в хроматограф, мкг/мл; ham - высота хроматографического пика стандарта вещества, мм; h„c - высота хроматографического пика вещества в пробе, мм; V0~ конечный объем анализируемого образца, мл; т„ - объем анализируемого образца, г (мл).
11. Контроль погрешности измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6. 2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов н результатов измерений».
12. Разработчики.
Калинки В.А. (Московская сельскохозяйственная академия имени К.А. Тимирязева. Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов»), Спиридонов ЮЛ., Ларина Г.Е., Лахова Л.А. (Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии).