УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия населения Главный Государственный санитарный врач Рлггийской Федерации
1ДГ.Г. ОНИЩЕНКО П___ 2005 г.
ГХ.&П-ОЪ
Дата введения: 1
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Методические указания по определению остаточных количеств Диазинона в мышечной ткани, печени, почках и жире овец.
Фирма производитель: ООО «Ариста Восток».
Торговое название: Диазинон.
Название действующего вещества по ИСО: Диазинон.
Название по ИЮПАК: О-О-диэтил 0-[6-мегил-2Ч1-метилэтил)-4-пиридилил] фосфоротиоат. Эмпирическая формула: C12H21N2O3PS.
С'труктурная формула:
(СН3)2СН
Молекулярная масса: 304,3.
Химически чистый Диазинон представляет собой бесцветную жидкость.
Температура кипения 89°С при давлении 13 Па.
Давление паров: 1,2 мПа х 101 при 25°С.
Растворимость в воде 60 ыг/л при 20°С.
Хорошо растворим в большинстве органических растворителе?:: ацетоне, эфире, спиртах, бензоле, толуоле, гексане, циклогексане, дихлорметане.
Кдо logP - 3,3.
Константа диссоциации р’Са ■ 2.6.
31
Разлагается под действием кислот и щелочей, в воде гидролизуется с ДТ^ при 20°С - 11,77 часов (pH 3,1), 185 дней (pH 7,4), 6 дней (pH 10,4).
При нагревании до 120°С разрушается.
Краткая токсикологическая характеристика: Диазинон относится к веществам опасным по острой оральной (ДД50 Для крыс 1250, для мышей 80-135 мг/кг) и ингаляционной токсичности (CKso, 4 часа, для крыс >2330 мг/м3) и мало опасным веществам по дермальной токсичности (ЛД50 для крыс >2150 мг/кг). Кумулятивные свойства выражены слабо.
В России установлены следующие гигиенические нормативы ДСД для человека - 0,002 мг/кг/сут.
ПДК в воздухе рабочей зоны - 0,2 мг/мЗ.
ПДК в атмосферном воздухе - 0,0001 мг/мЗ (с.-с.).
ПДК в воде водоема - 0,004 мг/дмЗ (с.-т.).
ПДК в почве - 0,1 мг/кг (тр.).
МДУ (мг/кг):
зерно хлебных злаков, кукуруза, картофель, капуста,
хлопчатник (семена и масло), лук, брюква, турнепс,
сахарная н столовая свекла - 0,1;
табак, томаты, огурцы, мак масличный - 0,5;
хмель сухой - 1,0;
мясо (в пересчете на жир) - 0,01;
морковь, молоко, молочные продукты, мясо птицы, яйца - не допускается.
Область применения препарата: Диазинон - инсектицид широкого спектра действия из группы эфиров тиофосфорной кислоты, ингибиторов ацетилхоливэстеразы, с хорошо выраженной контактной и кишечной активностью. Высокоэффективен против сосущих, минирующих и грызущих насекомых, повреждающих растения, а также подвижных стадий растительноядных клещей. Препараты на основе Диазинона широко применяются для борьбы с эндопаразитами животных.
2, Методика рнределстая остащчных количеств Дцаздаща вмыщЕфцй ткандь печеш^почках и жир? о.вещ
2.1. Рсдрвньге положения.
2,1 Л,.Прщщип мутуд^.
Методика основана на определении Диазинона методом газожидкостной хроматографии с использованием термоионного детектора после его экстракции из проб ацетонитрилом, переэкстракции в метпленхдорид и очистки на колонках с Флоризидом.
ж
Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки. 2d р/ичехк^ ка ^етрдг
Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1-2.
Таблица 1. |
Анализируемый
объект |
Метрологические параметры, р “ 0,95; п ■ 20 |
Предел обнаружения, мг/кг |
Диапазон определяемых концентраций, мг/кг |
Среднее
значение
определе
ния,
% |
Стандартное отклонение S, % |
Доверительный интервал среднего результата %, + |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
мышцы |
0,01 |
0,01-0,1 |
88,14 |
0,80 |
1,47 |
печень |
0,01 |
0,01-0,1 |
87,89 |
0,59 |
1,08 |
жир |
0.01 |
0,01-0,2 |
86,73 |
0,75 |
U6 |
|
Таблица 2.
Доверительный интервал и полнота определения Диазинона в мышечной ткани, печени, точках и жире овцы.
Среда |
Добгвлено
Диазинона,
мг/кг |
Обнаружено
Диазинона,
мг/кг |
Доверительный интервал,
+ |
Полнота
определе
ния,
% |
мышцы |
0,01 |
0,0087 |
0,0004 |
87,4 |
|
0,02 |
0,018 |
0,001 |
88,6 |
|
0,05 |
0,044 |
0,002 |
87,9 |
|
0,10 |
0,089 |
0,002 |
88,6 |
печень |
0,01 |
0,0089 |
0,0002 |
88,7 |
|
0,02 |
0,018 |
0,0003 |
89,4 |
|
0,05 |
0,044 |
0,001 |
88,6 |
|
0,10 |
0,085 |
0,002 |
84,9 |
жир |
0,01 |
0,0089 |
0,0005 |
88,7 |
|
0,02 |
0,017 |
0,0008 |
85,2 |
|
0,10 |
0,088 |
0,001 |
88,0 |
|
0,20 |
0,017 |
0,003 |
85,0 |
2.2. Реактивы, растворы, материалы и оборудование. 2.2.1. Реактивы, материалы и_вастворы.
Азот особой чистоты, ГОСТ 9293-74.
Ацетон, ГОСТ 2603-79.
Ацетонитрил, ТУ 6-09-3534-87.
Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72. н-Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78.
Натрий сернокислый, безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.
Метилен хлористый (метиленхлорид), х.ч., ГОСТ 19433-88 Флоризил для колоночной хроматографии, зернение 60/100 меш, фирмы Флюка 2.?.2J?PHfopbi, аппаратура, посуда.
Аппарат для встряхивания, ТУ 64-1-1081 - 73 или аналогичный.
Баня водяная, ТУ 46-22-603-75.
Банки с крышками для экстракции на 250 мл, полипропилен, кат.№3120-0250, NALGENE. Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е или аналогичные Воронки делительные на 250 мл, ГОСТ 23336-82.
Воронки для фильтрования, стеклянные, ГОСТ 8613-75.
Испаритель ротационный, вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74 или аналогичный.
Колбы мерные на 10,25,50,100 мл, ГОСТ 1770-74.
Колонки пластиковые для адсорбционной хроматографии длиной 15 см, диаметр 1,5 см. Колонка газохроматографическая капиллярная кварцевая НР-5 длиной 15 м, с внутренним диаметром 0,32 мм, толщт на пленки 0,25 мкм.
Концентраторы грушевидпые на 100 и 250 мл НШ29 КГУ-100 (250), ГОСТ 10394-72. Микрошприц на 10 мкл, ТУ Е-2.833.0.24.
Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.
Пипетки мерные на 1,0,2,9 и 5,0 мл, ГОСТ 20292-74.
Стаканы химические на 100 мл, ГОСТ 25336-82 Е.
Фильтры бумажные "Красная лента" ТУ 6-09-1678-86.
Хроматограф газовый "Кристалл 2000 М" с термоионным детектором с пределом детектирования по азоту в азобензоле - 5х10'13.
Цилиндры мерные емкостью 25,50 и 100 мл, ГОСТ 1770-74.
2.3, ЩДГ9Т9.ВЕ4У. ФДрсд^ншр.
2.3,1 • ПожШрв.ка и_крдднШ9Щ^вадйе.колднок для!^ожидк(ДгшоВ_хромат9п^ФчН-Колонку устанавливают в термостате хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе гелия при температуре на 20°С ниже предельного значения для выбранной неподвижной фазы в течение 8-10 часов.
2.3.2. Приготовление стандартных растворов.
Взвешивают 50 мг Диазинона в мерной колбе на 50 мл, растворяют навеску в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном (стандартный раствор № 1, концентрация 1 мг/мл). Стандартный раствор № 1 можно хранить в холодильнике в течение 6 месяцев.
Методом последовательного разбавления готовят стандартные растворы Диазинона в ацетоне с концентрацией 0,025; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 мкг/мл для построения калибровочного графика и внесения в котрольный образец.
Подобным образом готовят раствор Диазинона в гексане с концентрацией 1,0 мкг/мл для проверки хроматографического поведения аналитического стандарта на колонке с Флори зил ом.
23X Подготовка,колонки с Флрризидрм,
В пластмассовую колонку длиной 15 см, диаметром 1,5 см помещают на дно чистую стекловату и заполняют г.олонку 5 г Флоризила 60/100 меш, уплотняя его путем вибрации колонки. На слой Флоризила наносят слой безводного сернокислого натрия толщиной 1 см. За день до определения Флоризил в колонке промывают последовательно 20 мл ацетона и 10 мл гексана.
2.3.4. Проверка хроматографического поведенияЛиазинона на колонке,
В подготовленную солонку вносят 1 мл стандартного раствора Диазинона в гексане с концентрацией 1,0 мкг/мл (раздел 2.3.2) и 9 мл гексана. Колонку промывают последовательно 10 мл гексана и 10 мл смеси гексан: ацетон - 9:1. Смывы отбрасывают. После этого пропускают через колонку 3-4 порции смеси гексан:ацетон (1:1) по 5 мл каждая, собирая их в отдельные концентраторы. Собранные фракции выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетона и вводят в хроматограф 1 мхл пробы. Фракции, содержащие Диазинон, объединяют, выпаривают Досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетона и вводят в хроматограф 1 мкл пробы. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смыва с колонки и необходимый для очистки объем элюата.
2.4. Отбор проб.
Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (№ 2051-79 от 21.08.79). Пробы биологического материала хранят в запаянных пластиковых пакетах в замороженном виде в холодильнике. Перед анализом пробы размораживают и измельчают на мясорубке.
эг
2.5. Описание определения.
2 S.j; М ыщсчная ткань, печен^почки.
Навеску измельченного материала - 10 г помещают в пластиковую банку с крышкой емкостью 250 мл и заливают 50 мл ацетонитрила. Встряхивают 10 минут. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в делительную воронку емкостью 250 мл. Экстракцию повторяют еще раз, заливая пробу 50 мл ацетонитрила, и, встряхивая 10 минут. Экстракт отфильтровывают в ту же делительную воронку.
К фильтрату в воронке добавляют 20 мл гексана* и встряхивают содержимое воронки в течение 1 минуты. После разделения фаз нижнюю ацетонитрильную фазу сливают в стаканчик, гексан отбрасывают. Переносят экстракт из стаканчика в делительную воронку и промывают его еще раз 20 мл гексана Ацетонитрильную фазу сливают в концентратор емкостью 250 мл через безводный сульфат натрия и упаривают до объема 5-10 мл при температуре не выше 35°С.
Остаток в концентраторе разводят 80 мл 2,5% водного раствора Na2S04, обмывают стенки концентратора еще 20 мл этого же раствора и переносят его содержимое в делительную воронку емкостью 250 мл. Добавляют в делительную воронку 30 мл метиленхлорида и экстрагируют Диазинон, встряхивая воронку 1-2 минуты. После разделения слоев нижний слой метиленхлорида собирают в чистый концентратор, пропуская через безводный сульфат натрия. Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз 30 мл метиленхлорида, и собирая его в тот же концентратор. Объединенные экстракты выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре нс выше 35°С. Сухой остаток в концентраторе растворяют в 10 мл гексана н проводят очистку пробы на колонке с Флоризилом.
2.5.1.1. Очистка на колонках с Флоризилом,
В подготовленную (как указано в разделе 23.3) колонку с Флоризилом переносят содержимое концентратора. Концентратор ополаскивают 10 мл гексана и пропускают гексан через колонку. Колонку промывают 10 мт шеей гексан: ацетон - 9:1. Смывы отбрасывают. Диазинон элюируют 15 мт смеси гексан-.ацетон - 1:1, смыв собирают в чистый концентратор и выпаривают его содержимое досуха на ротационном вакуумном испарителе. Сухой остаток разводят в 2 мл ацетона (Пробы печени - в 4 мл) и вводят в хроматограф 1 мкл пробы.
23:2,ЖйР:
Навеску жира 5 г помещают в пластиковую банку с крышкой емкостью 250 мл и заливают 50 мл гексана*. Встряхивают 10 минут. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в концентратор емкостью 250 мл. Экстракцию повторяют еще раз, заливая пробу 50 мл гексана, и, встряхивая 10 минут. Экстракт отфильтровывают в тот же концентратор. Объединенный фильтрат упаривают до объема 5-10 мл пре температуре не выше 35°С.
Остаток пробы из концентратора помещают в делительную воронку емкостью 250 мл. Концентратор ополаскивают 50 мл ацетонитрила* и переносят ацетонитрил в делительную воронку. Проводят переэхетракцию Диазинона из гексана в ацетонитрил, встряхивая делительную воронку в течение 2 минут. После разделения слоев нижний слой ацетонитрила сливают в концентратор через безводный сульфат натрия. Повторяют экстракцию еще два раза, используя каждый раз по 50 мл ацетонитрила Экстракты собирают в тот же концентратор. Объединенный экстракт упаривают до объема 5-10 мл при температуре не выше 35°С.
Остаток в концентраторе разводят 100 мл 2,5% раствора Na2S04, обмывают стенки концентратора и переносят его содержимое в делительную воронку емкостью 250 мл. Добавляют в делительную воронку 30 мл метиленхлорида, экстрагируют Диазинон, как указано в разделе 2.5.1 .и очищают пробу на колонке с Флоризилом, как указано в разделе 2.5.1.1.
Очищенную пробу растворяют в 2 мл ацетона и вводят в хроматограф 1 мкл пробы.
*В анализе используют гексан, насыщенный ацетонитрилом, н ацетонитрил, насыщенный гексаном.
2 6.. У сл^в^шфщашрафирования и .обработка результатов
2Ь6Х.У£ДОЗИОРР>^
Хроматограф «Кристалл 2000 м» с термоионным детектором (ТИД) с пределом детектирования по азоту в азобензоле 510'13 г/см3.
Колонка капиллярная кварцевая НР-5; длиной 15 м с внутренним диаметром 0,32 мм; толщина пленки 0,25 мхм.
Реяшм_раб0ТЧ.
Температура термостата колонки программированная. Начальная температура — 150°С, выдержка 2 минуты; нагрев колонки по 25 фадусов в минуту до температуры 230°С, выдержка 5 минут, нагрев колонки по 25 градусов в минуту до температуры 260°С.
Газовый режим - Splitless.
Газ-носитель - гелий (Г1). Тип регулятора расхода гелия - РРГ 11, линейная скорость - 20 см/сек, давление на входе 27,29 кПа.
Газ 2 (Г2) - гелий (продувка испарителя), расход 1,0 мл/мин, сброс 1:50, начало сброса-5 сек, длительность сброса - 2 мин.
Газ 3 (ГЗ) - азот (поддув в детектор), расход во время анализа - 20 мл/мин.
Продувка детектора азотом после анализа при температуре 260°С в течение 2 минут -65 мл/мин.
Абсолютное время удерживания Диазинона - 4 мин 45 сек.- 4 мин. 47 сек.
Температура испарителя - 250°С, детектора - 350°С.
Расход водорода - 16 мл/мин; расход воздуха - 180 мл/мин.
Объем вводимой пробы - 1 мкл.
Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,025-0,5 нг.
2.6.2. Обработка результатов анализов.
Содержание Диаз и нона в пробах рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:
Sj-A-V
Х=--Р
So*m-100
X - содержание Диазинона в пробе, мг/кг.
Si - площадь пика образца, мВ;
So - площадь пика стандарта, мВ;
А - концентрация стандартного раствора, мкг/мл;
V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования (мл); m - масса или объем анализируемого образца, г или мл.
Р - содержание Диазинона в аналитическом стандарте.
3. Требования теунщдг ^опасности..
Необходимо соблюдать требования безопасности при работе в химических лабораториях в соответствии с “Правилами устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемиологического режима и личной гигиены при работе в лечебных и санитарно-эпидемиологических учреждениях системы М3 СССР” (№ 2455-81 от 20.10.81 г.), а также требования, изложенные в документации на приборы.
Калинин В.А., профессор, канд. с-х. наук, Калинина Т.С., ст.н. сотр., канд. с-х. наук, Фролова Н.С., ст. инж.
Московская сельскохозяйственная академия имени К.А. Тимирязева.
Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов». 127550, Москва, Тимирязевская ул., д. 53/1. Телефон: (095) 976-37-68, факс: (095) 976- 43-26.