УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Главный    "    нитарный    врач

ции,

МУК 4.ЬIvJltfn

«-Л_»

Дата введения:^J    у^Сгр**у<си.*Л.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ но определению остаточных количеств Фенаримола в воде, почве, ягодах винограда и виноградном соке методом газожидкостной хроматографии

Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в воде, почве, ягодах винограда и виноградном соке массовых концентраций фенаримола в диапазонах 0,00002 - 0,0002 мг/дм³ (вода): 0,02 - 0,2 мг/кг (почва, виноград, виноградный сок).

Фенаримол - действующее вещество препарата РУБИГАН, КЭ (120 г/л), фирма

производитель «Кромптон» (Англия). (±)*2,4’-дихлор-а-(пиримидин)бензгидриловый спирт (IUPAC)

CI7H12CI2N20 Мол. масса 331.2

Кристаллическое вещество беловатого цвета со слабым ароматическим запахом. Плотность 1,4 (при 25°С). Температура плавления кипения 117 - 119°С. Давление пиров при 25°С:    0,065    мПа.    Хорошо    растворим    в    большинстве    органических

растворителей, за исключением гексана. Растворимость в ацетоне - 151; метаноле - 98: ксилоле - 33,3 г/дм³ (при 20°С); в воде - 13,7 мг/дм³ (при 20°С).

Фенаримол быстро разрушается в водных растворах на свету: DT» - 12 часов. Гидролитически стабилен при нагревании до 52°С (pH 3-9).

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая пероральная токсичность (LD «) для крыс - 2500 мг/кг; для кроликов - 4500 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD 50) для кроликов > 2000 мг/кг.

Область применения препарата

Фенаримол - фунгицид класса пиримидина, рекомендуемый для борьбы с паршой и мучнистой росой на яблоне, груше, ягодниках; для обработки виноградной лозы от оидиума.

Гигиенические нормативы: ПДК в воде водоемов - 0,00002 мг/дм³; ПДК в почве - 0,04 мг/кг; МДУ в винограде - 0,1 мг/кг.

1. Метрологические характеристики метода

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1 Метрологические параметры

Анализируемый объект Метрологические параметры, Р - 0,95. п = ‘20 Предел обнару жения, мг/кг(дм3) Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (дм3) Среднее значение определения % Стандартное отклонение, S,% Доверительный интервал среднего результата. +,°/о Вода 0,00002 0,00002 - 0,0002 94,72 3.77 5.2 Почва 0,02 0,02 - 0,2 90,73 5,78 8.0 Ягоды винограда 0,02 0,02 - 0,2 89,91 4,91 6.8 Виноградный сок 0,02 0,02 - 0,2 86,97 5,77 8.0

Я

9.2.2.    Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихен растворителей

Водный остаток, полученный по п. 9.2.1., переносят в делительную воронку •мостимостью 250 см³. Колбу ополаскивают 50 см³ 5%-ного раствора хлористого Натрия, который также переносят в делительную воронку. Вносят в делительную •ороику 20 см³ хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отделяют, фильтруют через СЛОЙ безводного сульфата натрия, помешенный на бумажном фильтре в конусной коронке, в круглодонную колбу вместимостью 150 см³. Операцию экстракции Повторяют еще дважды, используя по 20 см³ хлористого метилена. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха и Подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.2.3.

9.2.3.    Очистка экстракта на колонке с оксидом алюминия

Остаток в круглодонной колбе, полученный после упаривания (п. 9.2.2.) растворяют в 2 см³ этилацетата (помещая колбу в ультразвуковую баню на 30 сек), добавляют 2 см³ гексана, перемешивают (вновь помещая колбу в ультразвуковую баню На )0 сек) и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают трижды ПОриИйМИ смеси гексан-этилацетат (1;1) по 3 см³, которые также наносят на колонку. Промывают колонку последовательно порциями по 30 см³ вначале смесью состава гексаи-этилацетат (1:1, по объему), затем этой же смесью в соотношении 2:8 (по объему) и этилацетатом, элюат отбрасывают.

Фснаримол элюируют с колонки 60 см³ смеси этилацетат-метанол (9:1. по объему) СО скоростью 1-2 капли в сек, собирая элюат в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35°С, остаток в колбе растворяют в 2 см'* ацетона при исследовании почвы, винограда и виноградного сока и 1 см³ ацетона -при исследовании воды, анализируют содержание фенаримола по п. 9.5.

9.3 Виноград

9 3.1. Экстракция

Образец измельченных ягод винограда массой 20 г помещают в коническую КОЛбу вместимостью 250 см³, вносят 75 см³ ацетонитрила, гомогенизируют в течение Ун минут, затем помещают на встряхиватель на 30 мин. Экстракт фильтруют через ИКЛЯДЧАТЫЙ бумажный фильтр в мерный цилиндр вместимостью 100 см³ с

Я

пришлифованной пробкой. Осадок на фильтре промывают 25 ем³ ацетонитрила, промывку также фильтруют в мерный цилиндр, объединяя с экстрактом. Содержимое цилиндра перемешивают, измеряют его объем; 1/2 часть раствора (соответствующую 10 г анализируемого образца) переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³ и подвергают очистке по п. 9.3.2.

9.3.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К экстракту в делительной воронке добавляют 30 см³ гексана, интенсивно встряхивают ее в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой отделяют, перенося в мерный цилиндр вместимостью 100 см³ с пришлифованной пробкой. К оставшемуся в делительной воронке верхнему гексановому слою добавляют 20 см³ ацетонитрила, интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. Нижний ацетонитрильный слой объединяют с первым экстрактом в мерном цилиндре. Гексановый слой отбрасывают. Содержимое цилиндра перемешивают, измеряют его объем; 1/5 его часть (соответствующую 2 г анализируемого образца) переносят в новую делительную воронку вместимостью 250 см³; добавляют в нее 50 см³ 5%-ного раствора хлористого натрия, перемешивают. Вносят в делительную воронку 30 см³ хлористого метилена, интенсивно ее встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помешенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 150 см³. Операцию экстракции повторяют еще дважды, используя по 20 см³ хлористого метилена. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.2.3.

9.4. Виноградный сок

9.4.1. Экстракция

К образцу сока массой 20 г в конической колбе вместимостью 250 см³ добавляют 75 см³ ацетонитрила, помещают в холодильник (4°С) на 1 час. Затем раствор переносят в мерный цилиндр вместимостью 100 см³, измеряют объем верхней органической фазы, 'А ее часть с помощью пипетки переносят в делительную воронку, добавляют 50 см³ 5%-ного раствора хлористого натрия, перемешивают. Вносят в делительную воронку 30 см³ хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отделяют, фильтруют через

ЗЛ

влой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусной •оромке, в мерный цилиндр вместимостью 100 см³. Операцию экстракции повторяют «Ш« дважды, используя по 20 см³ хлористого метилена. Органическую фазу. Пропущенную через слой сульфата натрия, объединяют в мерном цилиндре. Перемешивают, измеряют объем раствора, 1/5 его часть (соответствующую 2 г сока) упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.2.3.

9.5. Условия хроматографирования Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

Газовый хроматограф «Кристалл-2000М», снабженный    детектором

Электронного захвата ионов

Колонка капиллярная НР-50, длиной 30 м, внутренним диаметром 0.25 мм. толщина пленки сорбента 0,25 мкм Температура детектора: 320°С испарителя: 300°С

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура -230*С, нагрев колонки со скоростью 14 градусов в минуту до температуры 300°С. выдержка • 10 минут.

Скорость газа 1 (азот): 40 см/сек, давление 191,53 кПа, поток 2,2171 см³/мин.

Газ 2: деление потока 1 : 3,608; сброс 8 см³/мин Хроматографируемый объем: 1 мм³ Ориентировочное время выхода фенаримола: 5 мин. 30 сек Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор фенаримола « концентрацией 0,2 мкг/см³, разбавляют ацетоном.

Содержание фенаримола в пробе сопоставительно оценивают по плошали (высоте) хроматографического пика градуировочного раствора аналитического етвндарта (введенного в испаритель непосредственно после хроматографирования исследуемого образца).

10. Обработка результатов анализа

Содержание фенаримола в пробе (X, мг/кг, дм³) рассчитывают по формуле:

А х Snp.x W х V_CT.

X --------------.где

Sct.X V„p. X Р

A • концентрация фенаримола в градуировочном растворе, мкг/см³;

33

Snp. - плошадь (высота) пика исследуемой пробы. тУЧек, (mV );

Scr. - плошадь (высота) пика аналитического стандарта, тУЧек, (mV );

Vnp - объем раствора пробы, введенного в испаритель хроматографа, мм³;

V_CT - объем градуировочного раствора, введенного в испаритель хроматографа, мм³;

W - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

Р - масса (объем) анализируемого образца, г (см³);

11. Контроль погрешности измерений Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6. 2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

12. Разработчики.

Юдина Т.В., Федорова Н.Е., Рогачева С.К. - Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (ФНЦГ им. Ф.Ф.Эрисмана)

Таблица 2

Полнота извлечения фенаримола из воды, почвы, ягод винограда и виноградного сока (5 повторностей для каждой концентрации)

Среда	Внесено фенаримола мг/кг, мг/дм3	Обнаружено фенаримола мг/кг, мг/дм3	Полнота извлечения. %
	0,00002	0,18712* 1 O'* + 0,02503* 10^	93,56
Мола	0,00004	0,39065* 1 O'4 + 0,03151# 10"4	97,66
	0,0001	0,92712*1 O'4 + 0,10652*10-4	92,71
	0,0002	1,90026*10^ + 0,14451Ч04	95,01
	0,02	0,016976 ± 0,001718	84,88
Почва	0,04	0,038498 + 0,003359	96.25
	0,1	0,093357 + 0,014871	93.36
	0.2	0,17688 ± 0,021720	88.44
	0,02	0,016835 + 0,002543	84,17
	0,04	0,037355 + 0,002934	93,39
Виноград (ягоды)	0,1	0,091938 + 0,012240	91,94
	0,2	0,180302 ± 0,013376	90,15
	0,02	0,016275 + 0,001721	81,38
Виноградный сок	0,04	0,037291 + 0,003404	93.23
	0,1	0,088990 ± 0,010185	88,99
	0,2	0,170168 + 0,016654	85,08

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с детектором электронного захвата ионов (ДЭЗ) после экстракции из анализируемой пробы воды хлористым метиленом, почвы - смесью ацетон-вода. ягод винограда и виноградного сока - ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами (почва, растительный материал) и на колонке с оксидом алюминия.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки

Нижний предел измерения в хроматографируемом объеме пробы: 0,02 нг.

лз

В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в технологии выращивания винограда.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений Газовый хроматограф «Кристалл-2000М», снабженный детектором электронного захвата ионов с пределом детектирования по линдану 5x10 *^и г/с, предназначенный для работы с капиллярной колонкой.

Весы аналитические ВЛА-200

Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2,2-500-2,2-1000-2 Меры массы Микрошприц МШ-1

Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 0,1; 0,2; 1,0; 2,0; 5,0 и 10 см³ Пробирки градуированные вместимостью 10 см³ Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25.50, 100. 200 и 1000 см³

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы Фенаримол с содержанием действующего вещества 99.0% (фирма «Кромптон»)

Алюминий оксид, активированный, нейтральный, для колоночной хроматографии, 50-200 мкм («Акрос Органике», Бельгия)

Ацетон, чда    ГОСТ    2603

Ацетонитрил для хроматографии, хч    ТУ-6-09-4326-76

Вода бидистиллированная, деионизованная или

перегнанная над КМп04

н«Гексан, хч    ТУ-6-09-3375

Метиловый спирт (метанол), хч    ГОСТ 6995

Метилен хлористый (дихлорметан), хч    ГОСТ 12794

Натрий сернокислый, безводный,    хч    ГОСТ 4166

Натрий хлористый, хч    ГОСТ 4233

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч    ГОСТ 22300

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы Азот газообразный из баллона, о.с.ч.

Аквадистиллятор

Аппарат для встряхивания типа АВУ-бс Ьаня водяная

Ваня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария) бумажные фильтры "красная лента”, обеззоленные Воронки делительные вместимостью 250,500 и 1500 см³ Воронки конусные диаметром 30-37 и 60-70 мм Гомогенизатор Груша резиновая

Колбы плоскодонные вместимостью 100, 150 и 250 см³ ГОСТ 9737 Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 100 и ГОСТ 9737

230 см³

Колонка капиллярная НР-50, длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщина пленки сорбента 0,25 мкм Насос водоструйный    ГОСТ 10696

Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок не менее 50

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или ТУ 25-11-917-74 ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi,

Швейцария

/г

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции:    очистка

органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с оксидом алюминия для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения МШвстпв на колонке.

7.1. Подготовка органических растворителей

7. У. 1. Очистка ацетона

Ацетон перегоняют над небольшими количеством КМпО« и прокаленным карбонатом калия.

7.1.2.    Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.3.    Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.1.4.    Очистка н-гексана и хлористого метилена

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, полой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.2. Приготовление смеси растворителей для экстракции

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помешают 800 см³ ацетона и 200 см³ листиллированной воды, тщательно перемешивают.

7.3. Приготовление 5%-ного раствора хлористого натрия

В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 25 г хлористого натрия, растворяют в 300-350 см³ дистиллированной воды,- доводя водой до метки, тщательно

перемешивают.

7.4. Приготовление градуировочных растворов и раствора внесения

7.4.1.    Исходный раствор фенаримола (концентрация 100 мкг/см³) В мерную колбу вместимостью 100 см³ помешают 0,01 г фенаримола. растворяют в 50-70 см³ ацетона, доводят ацетоном до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Растворы № 1-5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.4.2.    Раствор Me 1 фенаримола (концентрация 10 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10,0 см³ исходного раствора с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.4.1.), доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения фенаримола из исследуемых образцов

7.3.3.    Рабочие растворы MsNs 2-5 фенаримола для градуировки (концентрация 0.02 - 0.2мкг/см¹).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают по 0.2. 0.4. 1.0 и 2.0 см³ раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 7.4.2.), доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы №№ 2 - 5 с концентрацией фенаримола 0.02, 0.04, 0.1 и 0.2 мкг/см³, соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике не более 2-х недель.

7.5. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость плошали (высоты) пика от концентрации фенаримола в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки №№ 2-5.

В испаритель хроматографа вводят по 1 мм³ каждого градуировочного раствора 2-5 и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

7.6. Подготовка колонки с оксидом алюминия для очистки экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8-10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при

№

открытом кране) суспензию 5 г оксида алюминия в 15-20 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помешают НА него слой безводного сульфата натрия высотой 1,5 см. После этого колонка готова к работе

7.7. Проверка хроматографического поведения фенаримопа на колонке с оксидом алюминия

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помешают 2 см³ раствора № 5 для Градуировки с концентрацией фенаримола 0,2 мкг/см³ (п. 7.4.3.), растворитель упаривают досуха. Остаток растворяют в 2 см³ этиацетата (помещая колбу в ультразвуковую баню на 30 сек), добавляют 2 см³ гексана, перемешивают (вновь помещая колбу в ультразвуковую баню на 30 сек) и наносят    на колонку,

подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают трижды порциями    смеси гексан-

этилаиетат (1:1) по 3 см³, которые также наносят на колонку. Промывают колонку последовательно порциями по 30 см³ вначале смесью состава гексан-этилацетат (1:1. по объему), затем этой же смесью в соотношении 2:8 (по объему) и этилацетатом. злювт отбрасывают.

Затем колонку промывают 100 см³ смеси этилацетат-метанол (9:1, по объему) со скоростью 1-2 капли в сек. Фракционно (по 10 см³) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 см³ ацетона, анализируют по п. 9.5.

Фракции, содержащие фенаримол, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.

ПРИМЕЧАНИЕ: Проверку хроматографического поведения фенаримола следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

8. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами Р 51592-2000, 1743.01-83, 26950-89, 25896-83. 26318-84 и 28472-90.

Отобранные пробы воды анализируют в день отбора или хранят при 4°С в «емение 30-ти дней.

Отобранные пробы ягод винограда и виноградного сока хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 10-ти дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18°С.

Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образны могут храниться в течение 3-х месяцев.

Перед анализом образцы ягод винограда измельчают, воду фильтруют через неплотный бумажный фильтр, сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром I мм.

9. Выполнение определения

9.1. Вода

Образец анализируемой воды объемом 1000 см³ помешают в делительную воронку вместимостью 1500 см³, вносят 20 г хлористого натрия, перемешивают до полного растворения соли, добавляют 100 см³ хлористого метилена, интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний органический слой переносят в круглодонную колбу вместимостью 500 см*, фильтруя его через 2-х см слой безводного сульфата натрия, помешенный в конусную химическую воронку диаметром 60 мм, снабженную бумажным фильтром «красная лента». Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды порциями хлористого метилена по 70 см³. Отстоявшийся слой хлористого метилена (нижняя фаза) фильтруют в колбу с ранее полученным экстрактом.

Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40°С, подвергают очистке в соответствии с п. 9.2.3.

9.2. Почва

9.2.1. Экстракция

Образец суховоздушной почвы массой 20 г помещают в круглодонную колбу вместимостью 250 см\ вносят 100 см³ смеси ацетон-вода (8:2. по объему), подсоединяют обратный холодильник и помешают на 30 мин на водяную баню, нагретую до 80°С. После охлаждения раствор переносят в мерный цилиндр вместимостью 250 см³, фильтруя его через складчатый фильтр «красная лента» Осадок промывают дважды смесью ацетон-вода (8:2, по объему), порциями по 30 см³. Промывки также фильтруют в мерный цилиндр, объединяя с экстрактом. Содержимое цилиндра перемешивают, измеряют его объем; 1/10 часть раствора (соответствующую 2 г анализируемого образца) переносят в круглодонную колбу, упаривают до водного остатка 4 см³) и подвергают очистке по п. 9.2.2.

30