УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Главный    “    итарный    врач

ии,

/7

МУК 4A.lvoihtf

« . Z1, » -.Atefe

Дата введения: ^с i    2л;>-*

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ по определению остаточных количеств Кломазона в зерне, зеленой массе и масле кукурузы методом газожидкостной хроматографии

Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в зерне, зеленой массе и масле кукурузы массовых концентраций кломазона в диапазонах 0,005 - 0,05; 0,01 - 0,10 и 005 -0,05 мг/кг. соответственно.

Кломазон - действующее вещество препарата КЛОЦЕТ, КЭ (720 г/л ацетохлора

+ 60 г/л кломазона), фирма производитель «ФМРус». 2-(2-хлорбензил)-4,4-диметил-1,2-оксазолидин-З-он (IUPAC)

Cl

Вязкая светло-коричневая жидкость с рыбным запахом. Плотность 1,192 (при 20°С). Температура плавления 25°С. Температура кипения 275°С. Давление паров при 25°С:    19,2    мПа.    Хорошо    растворим    в ацетоне, ацетонитриле, хлороформе,

циклогексане, дихлормстане, метаноле, толуоле, гептане, диметилформамиде. Растворимость в воде - 1,1 г/дм³.

Кломазон стабилен при комнатной температуре не менее 2-х лет. при 50°С - не менее 3-х месяцев. В водном растворе, на свету, DT50 * более 30-ти дней.

£2

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая пероральная токсичность (LD 50) для крыс - 2077 мг/кг (самцы). 1369 мг/кг (самки); острая дермальная токсичность (LD «>) Для кроликов > 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LK*o) для крыс > 4.8 мг/дм³.

Область применения препарата

Кломазон - селективный системный гербицид, используемый для борьбы со злаковыми и некоторыми двудольными сорными растениями.

Препарат Клоцет. КЗ (720 г/л ацетохлора + 60 г /л кломазон а) рекомендуется к применению на посевах сои. рапса, кукурузы, свеклы и моркови при однократном наземном опрысквании почвы после посева (перед прикалыванием при недостатке влаги) до всходов культуры.

Гигиенические нормативы: ПДК в воде водоемов - 0.02 мг/дм³: ОДК в почве -

0.04 мг/кг; ВМДУ в сое (семена, масло) - 0.01 мг/кг.

1. Метрологические характеристики метода

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1 Метрологические параметры

Анализируемый объект Метрологические параметры. Р = 0.95, п = 20 Предел обнару жения. мг/кг Диапазон определяемых концентраций, мг/кг Среднее значение определения % Стандартное отклонение. S.% Доверитель- j ный интервал среднего результата. ±. % Зерно 0.005 0.005-0.05 89.93 4.71 5.0 Зеленая масса 0,01 0.01-0.1 87.76 7,47 7.9 Масло 0.005 0.005 - 0.05 89.61 5.85 6.2 _1

63

9.1.3. Очистка экстракта на колонке с оксидом алюминия

Остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.1.2. растворяют в 3-х см³ гексана и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.5. Колбу обмывают трижды порциями гексана по 3 см'. которые также наносят на колонку. Промывают колонку последовательно 50 см³ гексана. 25 см³ смеси гексан-этилацетат (95:5. по объему) и 25 см' смеси гексан-этилацетат (9:1. по объему), элюат отбрасывают. Кломазон элюируют с колонки 30 см³ смеси гексан-этилацетат (3:2. по объему) со скоростью 1-2 капли в сек. собирая элюат в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35°С. остаток в колбе растворяют 2-х см³ гексана и анализируют содержание кломазона по п. 9.4.

9.2. Масло

9.2.    /. Экстракция

Образец масла массой 20 г помешают в коническую колбу вместимостью 200 -250 см³, вносят 50 см³ ацетонитрила и помешают на магнитную мешалку на 15 мин. После полного разделения фаз верхний ацетонитрильный слой осторожно декантируют в круглодонную колбу вместимостью 150-200 см'. Экстракцию повторяют еше дважды порциями ацетонитрила по 30 см³. Объединенный экстракт, помешенный в круглодонную колбу, упаривают досуха при температуре не выше 35°С и подвергают очистке по п. 9.2.2.

9.2.2.    Очистка экстракта на колонке с оксидом алюминия

Остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2.1 растворяют в 3-х см³ гексана и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.5. Колбу обмывают трижды порциями гексана по 3 см³, которые также наносят на колонку. Промывают колонку последовательно 50 см³ гексана и 25 см³ смеси гексан-эти лацетат (95:5. по объему), элюат отбрасывают. Кломазон элюируют с колонки 30 см' смеси гексан-этил auerai (3:2. по объему) со скоростью 1-2 капли в сек. собирая элюат в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре нс выше 35°С. остаток в колбе растворяют 1 см³ гексана и анализируют содержание кломазона по п. 9.4.

9.4. Условия хроматографирования

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

Газовый хроматограф «Кристалл-2000М». снабженный    детектором

электронного захвата ионов

Колонка капиллярная НР-50. длиной 30 м. внутренним диаметром 0.25 мм. толщина пленки сорбента 0.25 мкм Температура детектора: 320°С испарителя: 220°С

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура -100°С. нагрев колонки со скоростью 20 градусов в минуту до температуры 185°С. далее со скоростью 1 градус в минуту до 195°С и со скоростью 30 градусов в минуту до 255°С выдержка - 3 минуты.

Скорость raja 3 (азот) 60 см'/мин

Скорость газа 1 (азот): 30 см/сек, давление 102,46 кПа, поток 1.2867 cmVmhh. деление потока 1 : 10.9; сброс 14.02 см³/мин Хроматографируемый объем: 1 мм'^>

Ориентировочное время выхода кломазона: 13 мин.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор кломазона с концентрацией 1.0 мкг/см³. разбавляют гексаном.

10. Обработка результатов анализа Содержание кломазона в пробе (X. мг/кг) рассчитывают по формуле:

Ах V

X*------------ .где

m

А - концентрация кломазона. найденная по градуировочному графику, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³; m - масса анализируемого образца, г;

11. Контроль погрешности измерений Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1*6. 2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

12. Разработчики.

Юдина Т.В.. Федорова Н.Е.. Рогачева С.К. - Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (ФНЦГ им. Ф.Ф.Эрисмана)

73

Рис. 1 Градуировочная характеристика, выражающая зависимость плошали хроматографического пика от концентрации кломазона в растворе

S = 1.74 + 374.426 х С (г* 0.99982).

где S - площадь хроматографического пика, mV х сек; С - концентрация кломазона в растворе, мкг/см³ г - коэффициент корреляции.

Хроматограф газовый «Кристалл-2000М» с детектором электронного захвата ионов, колонка капиллярная НР-50, длиной 30 м. внутренним диаметром 0.25 мм. толщина пленки сорбента 0,25 мкм, объем вводимой пробы 1 мм³.

Таблица 2

Полнота извлечения кломазона из зерна, зеленой массы и масла кукурузы (5 повторностей для каждой концентрации)

Среда	Внесено кломазона мг/кг	Обнаружено кломазона мг/кг	Полнота извлечения. %
Зерно	0.005	4,5302*10'5 + 0.41639* 10'3	90.60
	0,010	8,8579*10° + 1,3425*1 О*3	88.58
	0.025	0.0228195 ± 3.3551 МО*3	91.28
	0,050	0.044623 ± 9,1747*1 О*3	89.25
Зеленая масса	0.01	9.0520* 10'3 + 2.2602* 10 *	90.52
	0,02	0,183104 + 4,6026*10'3	91.55
	0.05	0.0414708 + 8.2226*10'3	82.94
	0.1	0.0860146+ 16.1498*10°	86.01
Масло	0.005	4.7334*10'3 + 0.7116*1 О*3	94.67
	0,010	8.45014*10° + 2,3479*10°	84.50
	0,025	0.022760 + 3,3551* 10°	91.04
	0.050	0.043914 + 2.6688*10'3	87.83

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с детектором электронного захвата ионов (ДЭЗ) после экстракции из анализируемой пробы растительного материала смесью ацетон-вода, масла-ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами (образцы зерна и зеленой массы) н на колонке с оксидом алюминия.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Нижний предел измерения в хроматографируемом объеме пробы - 0.1 нг.

В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в технологии выращивания кукурузы, в том числе ацетохора.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений Газовый хроматограф, снабженный детектором электронного захвата с пределом детектирования по по линдану 5 х 10 ’^м г/с. предназначенный для работы с капиллярной колонкой Весы аналитические ВЛА-200

Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0.038 г Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2 и 2-1000-2 Меры массы

Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0. 2.0. 5.0.10 см³ Пробирки градуированные вместимостью 10 см³ Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25. 50. 100.200 и 1000 см³ Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы Кломаюн с содержанием действующего вещества 99.6% (фирма ФМС)

Алюминий оксид, активированный, нейтральный, для колоночной хроматографии. 50-200 мкм («Акрос

Органике». Бельгия)

Ацетон, чда    ГОСТ 2603

Ацетонитрил для хроматографии, хч    ТУ-6-09-4326-76

Вода бидистиллированная, деионизованная или перегнанная над КМпО<

н-Гексан. хч    ТУ-6-09-3375

Изопропиловый спирт (пропанол-2). хч    ТУ 6-09-402-75

Метилен хлористый (дихлорметан). хч    ГОСТ 12794

8-10 мм

Стеклянные палочки

Установка для перегонки растворителей

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1.    При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007. требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019. а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2.    Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя. с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

•    процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20±5)°С и относительной влажности не более 80%.

•    выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции:    очистка

органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с оксидом

алюминия для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества

на колонке.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1.    Очистка ацетона

Ацетон перегоняют над небольшими количеством КМпОа и прокаленным карбонатом калия.

7.1.2.    Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.3 Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок нс менее 50.

7.1.4. Очистка н-гексана и хлористого метилена

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор. пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод. перегоняют над поташом.

7.2. Приготовление смеси растворителей Оля экстракции

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помешают 800 см³ ацетона и 200 см^ дистиллированной воды, тщательно перемешивают.

7.3. Приготовление градуировочных растворов

7.3.1. Исходный раствор кломазона для градуировки (концентрация ИЮ мкг см ')

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,01 г кломазона, растворяют в 50-70 см’* гексана, доводят гексаном до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 4-х месяцев.

Растворы № 1-5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.3.2.    Раствор № I кюмазона для градуировки (концентрация 10 мкг/см¹).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помешают 10.0 см³ исходного раствора с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.3.1.), доводят до метки гексаном, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

7.3.3.    Рабочие растворы №№ 2-5 кюмазона для градуировки (концентрация 0.1

- !.0 мкг/см³).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают по 1.0. 2.0. 5.0 и 10.0 см ^; раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 7.3.2.). доводят до метки гексаном, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы №№ 2 • 5 с концентрацией кломазона 0.1. 0.2. 0.5 и 1.0 мкг/см³. соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике не более 2-х недель.

7.4. Приготовление растворов внесения для оценки полноты извлечения кломазона из исследуемых образцов

7.4.1.    Исходный раствор кюмазона (концентрация 100 мкг/см³) В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0.01 г кломазона. растворяют в 50-70 см³ изопропилового спирта, доводят им же до метки, тщательно перемешивают.

7.4.2.    Основной раствор кюмазона для внесения (концентрация 10 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10.0 см³ исходного раствора с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.4.1.), доводят до метки изопропанолом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике не более 2-х недель.

7.5. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации кломазона в растворе (мкг/см³). устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки 2 - 5.

В испаритель хроматографа вводят по I мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

£9

7.6. Подготовка колонки с оксидом алюминия для очистки экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см. внутренним диаметром 8-10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г оксида алюминия в 15-20 см³ гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1.5 см. После этого колонка готова к работе.

7.7. Проверка хроматографического поведения кломазона на колонке с оксидом алюминия

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают I см³ раствора Jfe 4 для градуировки с концентрацией кломазона 5 мкг/см³ (п. 7.3.3.). добавляют 2 см³ гексана, перемешивают и наносят на колонку, подготовленную по л. 7.5. Промывают колонку последовательно 50 см³ гексана. 25 см³смеси гексан- этилацетат (95:5. по объему), затем 25 см³ смеси гексан- этилацетат (90:10, по объему), элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 50 см³ смеси гексан-этилацетат (3:2. по объему) со скоростью 1-2 капли в сек. Фракционно (по 10 см³) отбирают элюат. упаривают, остатки растворяют в 1 см³ гексана, анализируют содержание кломазона по п. 9.4.

Фракции, содержащие кломазон. объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате. определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

ПРИМЕЧАНИЕ: Проверку хроматографического поведения кломазона следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

8. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами 13586.3-83 и 10852-86.

Отобранные пробы зерна и зеленой массы кукурузы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 10-ти дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18°С.

Пробы масла (помещенные в стеклянные флаконы) хранят в холодильнике в течение месяца.

Перед анализом образцы зерна и зеленой массы измельчают.

9. Выполнение определения 9.1. Зерно и зеленая масса кукурузы

У 1.2.1. 'Экстракция

Образец измельченного зерна массой 40 г или зеленой массы кукурузы массы 20 г помещают в коническую колбу (или химический стакан) вместимостью 400 см\ вносят 20 см³ смеси ацетон-вода (80:20. по объему), гомогенизируют в течение 1 мин, затем добавляют 80 см³ смеси ацетон-вода (80:20. по объему) и помещают на встряхиватель на 30 мин.

Раствор фильтруют на воронке Бюхнера через двойной бумажный фильтр «красная лента» под вакуумом. Осадок на фильтре промывают 50 см³ смеси ацетон-вода (80:20. по объему). Экстракт и промывку переносят в круглодонную колбу. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.2.

9.1.2 Очистка экстракта перераспределением а системе песмешинатщихся растворителей

Экстракт, полученный по п. 9.1.1. и помещенный в круглодонную колбу, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (-30 см³) при температуре не выше 35°С. внимательно следя за процессом и не допуская переброса жидкости при вспенивании. Водный остаток переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³. Колбу ополаскивают 50 см³ дистиллированной воды, которую также переносят в делительную воронку. Вносят в делительную воронку 10 г хлористого натрия, перемешивают для растворения соли, добавляют 50 cm^j смеси гексан-хлористый метилен (65:35. по объему), интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2-х мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 250 см³.

Водную фазу вновь переносят в делительную воронку. Операцию экстракции повторяют еще дважды, используя по 25 см³ смеси гексан-хлористый метилен (65:35. по объему). Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п.

9.1.3.