УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
Главный санитарный врач
Дата введения: £,
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ДИКВАТА В СЕМЕНАХ И МАСЛЕ ПОДСОЛНЕЧНИКА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
I. Вводная часть
Фирмы - регистранты: Август, АгроЭкспертГруп. Агрусхим. Торговое наименование: Суховей. Голден ринг. Дикватерр.
Действующее вещество: ликват.
Структурная формула:
\_/
I. I '-этилен-2.2’-дипиридилдиилиум дибромид;
Брутто формула: CuHijBrjNj.
Мол. масса: 344.1.
Дикват дикагиок:9,10-дигидро-8а. 1 Оа-диазониафенантрен: 6.7-дягидродипиридо-[ 1.2-в:2\I *• с]пиразин-5.8-ди-иум (IUPAC); 6.7-дигидродипиридо-[1.2-сг:2М *-с]пиразиндииум (С.А.). Брутто формула: C12H12N2.
Мол. масса: 184.2.
Днкват дибромид - кристаллы от белых до желтых. Температура плавления: .1254.’ (моногидрат).
Давление паров: <0.01мПа(моногидрат).Коэффициент распределения н-октанол/вода: Ко* log Р * -4.60(20*0. Растворимость (г/л) при 20°С: вода - 700 г/л. Заметно растворим в спиртах и гидрохсилсодержащих растворителях (25 г/л). Нерастворим в неполярных органических растворителях (<0.1 г/л).
Вещество стабильно в нейтральных и кислых растворах, легко гидролизуется в щелочных средах. ОТ*, - 74 дня (pH 7. воздействие солнечного света). Фотохимическое разложение под воздействием УФ света (DT*> < 1 недели).
Краткая токсикологическая характеристика. Острая оральная токсичность (LD*,) для крыс -408 мг/кг. мышей - 234 мг/кг: острая токсичность при воздействии на порез (LD*>) для крыс
- более 793 мг/кг, ирритант для глаз и кожи кроликов. Проникновение через неповрежденную человеческую кожу минимально; воздействие может вызывать раздражение и задержку заживления порезов и ран; может вызывать временное повреждение ногтей. Чрезвычайно острая ингаляционная токсичность. Аэрозоль может вызывать кровотечение из носа. Острая оральная токсичность (LD50) для уток - 155 мг/кг; куропаток -295 мг/кг. Токсичен для пчел, LD50 (орально, 120 часов) 22 мкг/особь. LC50 для рыб (96 часов): радужная форель - 39 мг/л; зеркальный карп - 125 мг/л.
Гигиенические нормативы для диквата в России:
МДУ для гороха - 0,05 мг/кг; МДУ для семян подсолнечника - 0,5 мг/кг; МДУ для масла подсолнечника-0,1 мг/кг.
Область применения препарата: Дикват - неселективкый контактный гербицид и десикант. Используется для прсдурожайного осушения хлопка, люцерны, клевера, люпина, подсолнечника, бобовых, зерновых и др. культур.
2. Методика определения диквата в семенах и масле подсолнечника
методом ВЭЖХ
2.1. Основные положения
2.1.1. Принцип метода
Методика основана на определении диквата методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов органическим растворителем и очистке путем перераспределения между двумя жидкими фазами, а также на патронах Диапак С-16.
2.1.2. Метрологическая характеристика метода
Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.
|
Метрологическая характеристика метода
Таблица 1 |
|
Объект
анализа |
Предел
обнаруже
ния
мг/кг |
Диапазон
определяемых
концентраций
мг/кг |
Среднее значение определения, % (для каждого объекта п-24) |
Относитель
ное
стандартное
отклонение
S,% |
Доверительный интервал среднего, п-24, Р-0.95 |
|
Семена |
0.05 |
0.05-0.5 |
86,0 |
5,26 |
5,01 |
|
Масло |
0.05 |
0.05-0.2 |
89,6 |
5,84 |
5,12 |
|
Полнота определения диквата в семенах и масле подсолнечника (N- S для каждой концентрации)
|
Таблица 2 |
|
Среда |
Внесено,
мг/кг |
Найдено,
мг/кг |
Стандартное отклонение, S± |
Полнота определения, % |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
6 |
|
Семена |
0,05 |
0,0420 |
1,23-10J |
84,1 |
|
0,1 |
0,0853 |
2.79-10*^ |
85,3 |
|
0,2 |
0,1722 |
3.94-10^ |
86.1 |
|
0,5 |
0,4430 |
5,04-10" |
88.6 |
|
Среднее |
|
|
|
86,0 |
|
Масло |
0,05 |
0,0046 |
5,1210J |
91,0 |
|
0,10 |
0,0890 |
~ 1,3710"* |
89,0 |
|
0,15 |
0,1344 |
3,13-М" |
89,6 |
|
0.2 |
0,1772 |
5.14-10* |
88,6 |
|
Среднее |
|
|
|
89,6 |
|
2.1.3. Избирательность метода.
Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.
2.2. Реактивы и материалы.
Ацетонитрил для ВЭЖХ, НВ-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.
Бикарбонат натрия, х.ч., ГОСТ 4201-79.
Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.
Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 6709-79.
Дикват дибромид моногидрат, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,2% (Sigma-Aldrich).
Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.
Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.
Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.
Кислота ортофосфорная, имп. (Ferak, Германия) или х.ч., ГОСТ 6552-80.
Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.
Натрия гидроксид, хч., ГОСТ 4328-77.
н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.
Подвижная фаза для ВЭЖХ (п. 2.5.3.).
Соляная кислота, конц., ГОСТ 857-88.
Соляная кислота, 0.1М водный раствор.
Стекловата.
Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.
Этиловый спирт, о.с.ч., ТУ 6-09-4512-77
Этиловый эфир уксусной кислоты, чл.а., ГОСТ 22300-76.
2.3. Приборы и посуда.
Жидкостный хроматограф "Альянс” фирмы «Waters» с УФ детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или другой с аналогичными техническими характеристиками.
Колонка Symmetry - Cl 8 (250x4.6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная. Предколонка Waters Symmetry С-18.
Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е или аналогичные.
Установка ультразвуковая «Серьга», ТУ 3.836.008.
Мельница лабораторная зерновая ЛМЗ, ТУ 1-01-0593-79..
Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74 или аналогичный. Бидистиллятор.
Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.
Колбы плоскодонные на шлифах КШ100 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.
Колбы круглодонные на шлифах КПП 00 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.
Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.
Воронки делительные ВД-3-250, ГОСТ 8613-75.
Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 см3, ГОСТ 1774-74.
Колбы мерные на 25, 50,100 и 1000 см3, ГОСТ 1770-74.
Пипетки на 1, 2, 5, 10 см3, ГОСТ 22292-74.
Патроны Диапак С-16
2.4. Отбор проб.
Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 10852-86 «Семена масличных. Правила приемки и методы отбора проб».
2.5. Подготовка к определению.
2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей.
Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. Для этого 100 мл растворителя испаряют при помощи вакуумного ротационного испарителя при температуре 40 °С до объема I мл и хроматографируют. При обнаружении примесей, которые могут мешать определению, растворители очищают общепринятыми методами. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют, отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием. Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.
2.5.2. Кондиционирование колонки.
Перед началом анализа колонку Symmetry-Cl 8 кондиционируют в потоке подвижной фазы (0.8 мл/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1-2 часов.
Внимание! После каждых 5-10 вводов в хроматограф анализируемых экстрактов
необходимо промывать колонку раствором ацетонитрил : вода (30:70 по объему) в течение 5-10 мин со скоростью 3 мл/мин для предотвращения сдвигов пиков коэкстрактивных веществ, которые могут мешать определению диквата.
2.53. Приготовление растворов.
Для приготовления 2М раствора ортофосфорной кислоты 200 г 98% кристаллической Н3РО4 (или 225 г 87% водного раствора) помещают в мерную колбу объемом 1 л, растворяют в 600 мл дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой.
Для приготовления 0Д5М раствора перхлората натрия 30,6 г безводного NaCIO< помещают в мерную колбу объемом 1 л, растворяют в 600 мл дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой.
Для приготовления 0,1 М раствора бикарбоната натрия 8,4 г кристаллического NaHCOj помещают в мерную колбу объемом 1 л, растворяют в 600 мл дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой.
Раствор для экстракции диквата из семян готовят путем смешивания 800мл этанола и 200мл 0,1 М раствора соляной кислоты в мерной колбе на 1000 мл.
Для приготовления раствора Jftl в мерной колбе на 1000мл смешивают 950мл 0,25М раствора NaCI04 и 50мл 2М раствора ортофосфорной кислоты.
Для получения 50%-го водного этанола в колбе емкостью 1л смешивают 500 мл этанола с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.
Для приготовления подвижной фазы в колбе на 1000 мл смешивают 50 мл ацетонитрила и 950 мл раствора №1, смесь фильтруют, при необходимости дегазируют.
2.5.4. Приготовление градуировочных растворов
Берут точную навеску диквата дибромида (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 мл, растворяют навеску в бидистиллированной воде и доводят до метки (исходный раствор с концентрацией 0.5 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0.1,0.2, 0.5,1.0 и 2.0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы - ацетонитрил: раствор №1 (5:95, по объему).
Растворы для внесения в семена при определении полноты извлечения диквата с концентрациями 0.1 и 1.0 мкг/мл готовят из исходного раствора с концентрацией 0.5 мг/мл методом последовательного разбавления по объему изопропиловым спиртом. Образец для внесения помещается во фторопластовый стакан, после внесения пробу выдерживают в течение часа при комнатной температуре.
Внесение в масло проводят следующим образом: 20 мг аналитического стандарта вносят в мерную колбу на 100 мл, растворяют его в 10 мл изопропилового спирта, доводят до метки подсолнечным маслом и хорошо перемешивают. Затем колбу нагревают на водяной бане для удаления растворителя и отстаивают до получения однородного прозрачного раствора. Этот раствор разбавляют подсолнечным маслом до получения требуемой концентрации диквата в масле.
Исходный раствор аналитического стандарта можно хранить в холодильнике при температуре 0-4°С в полиэтиленовом флаконе в течение 1 месяца, градуировочные растворы готовят перед проведением градуировки прибора.
2.S.5. Построение градуировочного графика.
Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация диквата в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации диквата в градуировочном растворе (мкг/мл).
2.5.6. Подготовка патрона Днапак С-16 для очистки экстракта.
Концентрирующий патрон Диалак С-16 промывают последовательно с помощью шприца 20 мл смеси этанол-вода 50:50 и 20 мл этанола со скоростью 5 мл/мин. После чего он готов к работе.
2.5.7. Проверка хроматографического поведения диквата на патроне Днапак С16
В мерную колбу емкостью 100 мл отбирают 0,4 мл раствора диквата дибромида с концентрацией 0,5 мг/мл и доводят объем до метки этанолом. К 1 мл полученного раствора добавляют еще 4 мл этанола и наносят на приготовленный по п. 2.5.6. патрон. Как только уровень жидкости достигнет верхнего края патрона, его промывают еще 50 мл этанола (Нельзя допускать высыхания твердой фазы в патроне). Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3.) и анализируют на содержание диквата по п. 2.6.5. Суммируя результаты, рассчитывают содержание диквата в элюате, определяя полноту вымывания вещества из патрона и необходимый для очистки экстракта объем элюента.
Примечание: профиль вымывания диквата может меняться при использовании новой партии патронов Диапак С-16.
2.5.8. Подготовка приборов и средств измерения.
Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.
2.6. Проведение определения.
2.6.1. Экстракция диквата из семян подсолнечника.
Навеску, массой 20г измельченных на лабораторной зерновой мельнице семян подсолнечника помещают в коническую колбу емкостью 100 мл и экстрагируют дикват 50 мл смеси этанол - 0,1М HCI (80:20, по объему) на ультразвуковой установке в течение 15 мин (или нагревают в круглодонной колбе с обратным холодильником в течение 50 мин при 100°С). Суспензию фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют. Объединенный экстракт упаривают на роторном испарителе до водного остатка при температуре не выше 50°С, нейтрализуют 0,1 М раствором бикарбоната натрия до pH 7. Объем экстракта доводят до 50 мл дистиллированной водой. Дальнейшую очистку проводят по п.2.6.3.
2.6.2. Экстракция дяквата из масла подсолнечника.
Навеску масла, массой 20г растворяют в 100 мл гексана. Раствор фильтруют через фильтр красная лента, помещают в делительную воронку ёмкостью 250 мл и переэкстрагируют дикват дистиллированной водой трижды порциями по 20 мл, встряхивая воронку каждый раз в течение 2-3 мин.* Дальнейшую очистку проводят по п.2.6.3.
*В случае образования стойких эмульсий на стадии переэкстракции диквата из гексана для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку небольшое количество (до 5 мл) этилового спирта.
2.6.3. Очистка экстрактов.
Полученные по п.п. 2.6.1 и 2.6.2 экстракты помещают в делительную воронку на 250 мл и промывают дважды этил ацетатом и дважды гексаном порциями по 25 мл, встряхивая воронку в течение 2-3 минут (при всех промывках верхний органический слой отбрасывают). Водный раствор упаривают на роторном испарителе при температуре нс выше 50°С. Сухой остаток растворяют в 50 мл этанола, выдерживая колбу в ультразвуковой ванне в течение 5 мин. Раствор фильтруют через фильтр красная лента и упаривают на роторном испарителе до объёма -5 мл при температуре не выше 50°С и сразу же проводят дальнейшую очистку экстракта по пункту 2.6.4.
2.6.4. Очистка экстрактов на патроне Диапак С-16
Полученный по п. 2.6.2. раствор количественно переносят в подготовленный по п. 2.5.6. патрон Диапак С-16. Колбу обмывают ещё 5 мл этанола и также переносят на патрон (Не допускать пересыхания патрона!). Патрон промывают 40 мл этанола. Элюат собирают, упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 50°С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.
2.6.S. Условия хроматографирования
Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы «Waters» с УФ детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.
Рабочая длина волны: 310 нм.
Колонка Symmetry С-18, (250x4.6) мм, 5 мкм (Waters).
Предколонка Waters Symmetry С-18. Температура колонки 30±1°С.
Подвижная фаза: ацетонитрил - раствор №1 в соотношении 5:95 (по объему).
Скорость потока элюента: 0,8 мл/мин. Объем вводимой пробы 50 мкл.
Время удерживания диквата 5.05 ± 0.05 мин.
Линейный диапазон детектирования 0.1 - 2.0 мкг/мл.
2.6.4. Обработка результатов анализа
Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание диквата (в пересчете на дикатион) в образце воды, почвы или растений (X, мг/кг) вычисляют
S0
по формуле:
X---к
S,*p
где S|— площадь пика диквата в стандартном растворе, мм2;
S2 - площадь пика диквата в анализируемой пробе, мм2;
V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;
Р - навеска анализируемого образца, г, (для воды - объем, мл);
С - концентрация стандартного раствора диквата, мкг/мл.
К - коэффициент, учитывающий соотношение молекулярных масс диквата и диквата дибромида моногидрата (184.2: 362.1) = 0.5
Содержание остаточных количеств диквата в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор диквата 2 мкг/мл разбавляют.
3. Требования техники безопасности.
При работе с реактивами соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005-88).
При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.
4. Контроль погрешности измерений.
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6. 2002 ’Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений”.
5. Разработчики.
Цибульская И.А., Долженко В.И., Юзихин О.С. (ВНИИ защиты растений, Санкт-Петербург).
Si
