Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав
потребителей и благополучия человека
4.1. МЕТОДЫ
КОНТРОЛЯ ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Спектрофотометрическое определение
субтилизина (протеазы) в атмосферном воздухе
Методические
указания
МУК 4.1.1959-03
Спектрофотометрическое
определение субтилизина (протеазы) в
атмосферном воздухе: Методические указания.- М.: Федеральный центр гигиены и
эпидемиологии Роспотребнадзора, 2006.
1. Разработаны ГУ НИИ
экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н Сысина
РАМН (к. х. н. А.А. Беззубовым) и НИЦ «ЭКОС» (В.А.
Смирновым).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в
сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 21 апреля 2005 г.
3. Введены в действие с 1 июля 2005 г.
4. Введены впервые
|
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г. Онищенко
21
апреля 2005 г.
Дата введения:
1 июля 2005 г.
|
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Спектрофотометрическое
определение субтилизина
(протеазы) в атмосферном воздухе
Методические указания
МУК 4.1.1959-05
1.
Область применения
Настоящие методические
указания устанавливают количественный спектрофотометрический анализ
атмосферного воздуха для определения в нем субтилизина
(протеазы) в диапазоне концентраций 0,005 - 0,05 мг/м3.
Методические
указания предназначены для использования лабораториями центров гигиены и
эпидемиологии при осуществлении аналитического контроля химического загрязнения
атмосферного воздуха в районе расположения производства субтилизина
(протеазы), производственными лабораториями предприятий,
научно-исследовательскими институтами, работающими в области гигиены окружающей
среды.
Методические
указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 «Методика выполнения измерений», ГОСТ
17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам
определения загрязняющих веществ».
Методические
указания одобрены и рекомендованы к практическому применению на бюро секции по
физико-химическим методам исследования объектов окружающей среды Проблемной
комиссии «Научные основы экологии человека и гигиены окружающей среды» и бюро
Комиссии по государственному санитарно-эпидемиологическом нормированию
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия
человека.
2.
Физико-химические и токсикологические свойства
Субтилизин (протеаза) является ферментом класса гидролаз и
катализирует гидролиз белков и пептидов, а также сложных эфиров и амидов N-защищенных аминокислот. Продуцируется Bacillus subtilis и родственными бактериями. Молекулярная масса более 27000.
Выпускается в виде гранул кремового цвета со слабым запахом. Растворим в воде и
растворах щелочей. Применяется в химической промышленности, в частности, как
добавка к синтетическим моющим средствам.
Субтилизин (протеаза) обладает раздражающим действием на кожу и
слизистые оболочки глаз, является аллергеном. В атмосферном воздухе находится в
виде аэрозоля. ОБУВ протеазы щелочной - 0,01 мг/м3.
3.
Погрешность измерений
Методика
обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не превышающей ± 21 %. При
доверительной вероятности 0,95.
4. Метод
измерений
Измерение
концентраций субтилизина (протеазы) основано на улавливании
его из воздуха и концентрировании на фильтре с последующей
десорбцией 2Н раствором гидрооксида
натрия, реакции образования окрашенного комплекса с солью меди (метод Лоури) и последующем спектрофотометрировании
при длине волны 650 нм.
Нижний предел измерения
содержания субтилизина (протеазы) в анализируемом
объеме пробы - 10 мкг.
Измерению мешают
фенол, тимол, сульфосалицил, а также белки.
5.
Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы
При выполнении
измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства,
материалы и реактивы.
5.1. Средства
измерений
Спектрофотометр
СФ-46 или
аналогичный
прибор
Весы
аналитические ВЛА-200 ГОСТ
24104-01
Меры
массы ГОСТ 7328-01
Колбы
мерные, вместимостью 25, 100 и 1000 см3 ГОСТ
1770-74Е
Пипетки,
вместимостью 1, 2, 5 и 10 см3 ГОСТ
29196-91
Бюксы,
вместимостью 25 см3 ГОСТ
25336-83Е
Пробирки
колориметрические с притертыми
пробками,
вместимостью 20 см3 ГОСТ
25336-82Е
Барометр-анероид
М-67 ТУ
2504-1797-75
Термометр
лабораторный шкальный ТЛ-2 ГОСТ
215-73Е
Секундомер ГОСТ 5072-79
Электроаспиратор марки 822 ГОСТ 2.6.01-86
5.2. Вспомогательные
устройства
Фильтродержатель с металлической
сеткой ТУ 6-09-1706-77
Баня
водяная ТУ
64-1-2850-76
Дистиллятор ТУ
61-1-721
-79
5.3. Материалы
Фильтр
АФА-ХА-20 ТУ
95-743-80
5.4. Реактивы
Протеаза с
содержанием основного вещества
не
менее 95 % СП
23701-81
Гидрооксид натрия, х.ч. ГОСТ 4328-77
Кислота
соляная, х.ч. ГОСТ 4461-77
Натрий
углекислый, х.ч. ГОСТ
84-76
Калий-натрий
тартрат, х.ч. ГОСТ
5845-70
Медь
серно-кислая, х.ч. ГОСТ
4165-78
Натрий
вольфрамово-кислый, х.ч. ГОСТ
18289-76
Натрий
молибденово-кислый, х.ч. ГОСТ
10931-74
Литий
серно-кислый, х.ч. ГОСТ 10563-76
Кислота
ортофосфорная, х.ч. ГОСТ
10678-76
Бром
Фенолфталеин
6.
Требования безопасности
6.1. При работе с реактивами соблюдают требования
безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и
легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.
6.2. При выполнении измерений концентраций субтилизина
(протеазы) с использованием спектрофотометра СФ-46 и электроаспиратора следует соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.
7.
Требования к квалификации оператора
К выполнению
измерений и обработке их результатов на спектрофотометре и электроаспираторе
допускаются лица, знающие устройство и правила эксплуатации приборов.
8.
Условия измерений
При выполнении
измерений соблюдают следующие условия:
8.1. Процессы приготовления растворов и подготовки проб к
анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5) °С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.
8.2. Выполнение измерений на спектрофотометре СФ-46 проводят в условиях, рекомендованных технической документацией
к прибору и настоящими методическими указаниями.
9.
Подготовка к выполнению измерений и проведение измерений
Перед
выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление реактивов, подготовка
спектрофотометра к работе, установление градуировочной
характеристики, отбор проб
9.1. Приготовление
растворов
Исходный раствор протеазы для градуировки (с
= 1 мг/см3). В мерную колбу емкостью 25 см3
вносят 26,3 мг (95 % основного вещества), доводят 2Н
раствором гидроокиси натрия до метки и тщательно перемешивают. Срок хранения
исходного раствора 6 часов.
Рабочий раствор протеазы для градуировки (с
= 100 мкг/см3). В мерную колбу емкостью 25 см3 помещают 2,5 см3
исходного раствора, доводят 2Н раствором гидрооксида натрия до метки и тщательно перемешивают. Срок
хранения рабочего раствора 6 часов.
0,1 Н раствор гидрооксида
натрия. В колбу емкостью
1000 см3 помещают 4,0 г гидрооксида
натрия, приливают дистиллированную воду до метки и тщательно перемешивают до
полного растворения.
2 Н раствор гидрооксида натрия.
В колбу емкостью 1000 см3
помещают 80,0 г гидроокиси натрия, приливают дистиллированную воду до метки и
тщательно перемешивают до полного растворения.
Рабочий раствор № 1. В колбу емкостью 100 см3
помещают 10,0 г углекислого натрия, 0,2 г калий-натрий тартрата,
0,05 г серно-кислой меди, приливают дистиллированную
воду до метки и тщательно перемешивают.
Исходный раствор реактива Фолина.
В
кругло донную колбу емкостью 1000 см3 помещают 50,0 г
натрия вольфрамово-кислого, 12,5 г натрия молибденово-кислого, добавляют 360 см3
дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения реактивов. К
полученному раствору добавляют 25 см3 85 % раствора ортофосфорной
кислоты, 50 см3 концентрированной соляной кислоты и смесь кипятят в
течение 10 ч с обратным холодильником. Затем добавляют 76 г лития сернокислого,
25 см3 дистиллированной воды и 3 капли брома. Кипятят под тягой без
обратного холодильника для удаления остатка брома. Охлаждают до комнатной
температуры и доводят дистиллированной водой до объема 500 см3,
перемешивают и фильтруют. Из фильтрата отбирают 1 см3, добавляют 9
см3 дистиллированной воды и титруют 0,1 н
раствором гидрооксида натрия по фенолфталеину.
Реактив Фолина с установленным титром доводят
дистиллированной водой до 1 н концентрации. Раствор
хранят в темной склянке с притертой пробкой в холодильнике Срок хранения
реактива - 1 месяц.
Рабочий раствор реактива Фолина
готовят
перед употреблением путем разбавления 1 см3 исходного раствора
реактива Фолина дистиллированной водой до объема 8 см3
в расчете на одну пробу.
9.2. Подготовка
спектрофотометра к работе
Подготовку
спектрофотометра к работе проводят в соответствии с инструкцией по
эксплуатации.
9.3. Установление
градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику устанавливают на градуировочных растворах. Она выражает зависимость
оптической плотности растворов от массы субтилизина
(протеазы) и устанавливается по 5 сериям растворов для градуировки.
Каждую серию,
состоящую из 6 растворов, готовят в пробирках с притертыми пробками. Для этого
в них вносят рабочий раствор протеазы и 2 Н раствор гидрооксида
натрия в соответствии с таблицей. После этого в каждую пробирку приливают 2,0
см3 рабочего раствора № 1, тщательно перемешивают и выдерживают в
течение 10 мин. Затем добавляют 8 см3 рабочего
раствора реактива Фолина, перемешивают и нагревают на
водяной бане при температуре 50 °С
в течение 5 мин. После быстрого охлаждения замеряют оптическую плотность
растворов в кювете с толщиной оптического слоя 2,0 мм при длине волны 650 нм по отношению к раствору № 1 в таблице.
Строят градуировочную характеристику, нанося на ось ординат значения
оптических плотностей градуировочных растворов, а на
ось абсцисс - соответствующие им величины содержания протеазы. Градуировку
проверяют 1 раз в 3 месяца или в случае использования новой партии
реактивов.
Таблица
Растворы для установления градуировочной
характеристики при определении концентрации субтилизина
(протеазы)
Номер раствора
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
Объем рабочего раствора
протеазы, см3
|
0
|
0,1
|
0,2
|
0,5
|
0,8
|
1,0
|
Объем раствора 2 Н гидроокиси
натрия, см3
|
1,0
|
0,9
|
0,8
|
0,5
|
0,2
|
-
|
Содержание протеазы, мкг
|
0
|
10,0
|
20,0
|
50,0
|
80,0
|
100,0
|
9.4. Отбор
проб
Отбор проб
воздуха, содержащего субтилизин (протеазу), проводят
согласно ГОСТ
17.2.3.01-86. Воздух аспирируют с помощью электроаспиратора через фильтр со скоростью 200 дм3/мин в течение 30
мин. Отобранные пробы помещают в пробирки с притертыми пробками Срок хранения -
3 дня.
10.
Выполнение измерений
Фильтр с
отобранной пробой помещают в бюкс,
заливают 3 см3 2 Н раствора гидрооксида
натрия и оставляют на 10 - 15 мин,
периодически помешивая стеклянной палочкой. Степень десорбции протеазы с
фильтра 98 %. Фильтр отжимают и отбрасывают. Для анализа отбирают 1,0 см
полученного раствора и далее проводят анализ в условиях, описанных в п. 9.3.
Расчет содержания
субтилизина (протеазы) проводят по градуировочной характеристике.
11.
Вычисление результатов измерений
Концентрацию субтилизина (протеазы) в атмосферном воздухе (мг/м3) вычисляют по формуле
где
т - содержание субтилизина (протеазы) в
анализируемом объеме пробы, мкг;
V1 - общий объем
пробы, см3;
V1 - объем пробы,
взятой для анализа,
см3;
V0 - объем воздуха,
взятого для анализа и приведенного к нормальным условиям, дм3;
где
V - объем воздуха, взятого для анализа, дм;
Р - атмосферное
давление, мм рт. ст.;
Т - температура
воздуха в месте отбора пробы, °С.
12.
Оформление результатов измерений
Результаты
измерений концентраций субтилизина (протеазы)
оформляют протоколом в виде: С,
мг/м3; ∆ ± 21 % с указанием
даты проведения анализа, места отбора пробы, названия лаборатории, юридического
адреса организации, ответственного исполнителя и руководителя лаборатории.
13.
Контроль погрешности измерений
Контроль погрешности
измерений содержания субтилизина (протеазы) проводят
на градуировочных растворах в соответствии с пп. 10 и 11. Рассчитывают среднее
значение результатов измерения содержания протеазы в градуировочных
растворах:
где
n - число измерений в градуировочной
смеси;
Cni
- результат измерения содержания вещества в i-ой пробе
градуировочного раствора, мг/дм3.
Рассчитывают
среднее квадратичное отклонение измерений концентрации:
Рассчитывают
доверительный интервал:
где
t - коэффициент нормированных отклонений, определяемый по табл. Стьюдента,
при доверительной вероятности 0,95, и затем относительную
погрешность определения концентраций:
Если δ ≤ 21 %, то
погрешность измерения удовлетворительная. Если данное условие не выполняется,
то выясняют причину и повторяют измерения.
СОДЕРЖАНИЕ
1. Область применения. 1
2.
Физико-химические и токсикологические свойства. 2
3. Погрешность
измерений. 2
4. Метод измерений. 2
5. Средства
измерений, вспомогательные устройства, реактивы.. 2
5.1. Средства
измерений. 2
5.2.
Вспомогательные устройства. 2
5.3. Материалы.. 3
5.4. Реактивы.. 3
6. Требования
безопасности. 3
7. Требования к
квалификации оператора. 3
8. Условия
измерений. 3
9. Подготовка к
выполнению измерений и проведение измерений. 3
9.1. Приготовление
растворов. 3
9.2. Подготовка
спектрофотометра к работе. 4
9.3. Установление
градуировочной характеристики. 4
9.4. Отбор проб. 5
10. Выполнение
измерений. 5
11. Вычисление
результатов измерений. 5
12. Оформление
результатов измерений. 5
13. Контроль погрешности измерений. 5
|