УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный врач Российскойлбедерации,

Первый заместитель миш(стра здравоохранения Росси йязд^Р^едер

. Онищенко

|>

мук

Дата введения:

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

по определению остаточных количеств Ивермектина в печени, почках, мышцах и жире сельскохозяйственных животных методом высокоэффективной жидкостной

хроматографии

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в печени, почках, мышцах и жире сельскохозяйственных животных массовой концентрации ивермектина в диапазонах 0,001 -0.02 мг/кг (печень, почки, мышцы); 0,002 - 0,04 мг/кг (жир).

Ивермектин - действующее вещество ветеринарного препарата БАЙМЕК 1% и.-р..

фирма производитель Байер АГ (Германия).

Ивермектин - смесь компонентов НгВ|_а и Н₂В|ь. Содержание компонента Н₂В|, не менее 80%.

Компонент Н₂В„ - (2а£4£.8Е)-(5'£6£ 'Л.7&11Л,13/г,155,17аЛ,20/?,20аЛ.20Ь5)-2О.2ОЬ-дигидрокси-5\6,8.19-тетраметил-7-[[(3-О-метил-4-0-(3-О-метил-2,6-дидеокси-а-Ь-арабино-гексапиранозил)-2.6-дидеокси-а-1--арабино-гексапиранозил]-оксиJ-6'-((IS)-1 -метилпропил]-3 '.4 .5'.6.6 .7.10.11.14,15.17а.20.20а-.20Ь-тетрадека-гидроспиро(11,15-метано-2Н,13Н,17Н-фуро[4,3,2ря][2,6)бензодиокса-циклоокта-децен-13.2'-[2Н]пиран]-17-он (или 5-0-деметил-22,23-дигидроавермектин А|,)

Компонент Н₂В, _ь - (2aEAE,ZE)-(S '5,65. '£.75,11 Я.13Я. 15S,17a/?,20/?,20a/?.20bS)-20.20b-дигидроксн-5 .6,8.19-тетраметил-б Ч1 -метилэтил)-7-[[(3-0-метил-4-0-(3-О-метил-2.6-дидеокси-а-Б-арабино-гексапиранозил)-2.6-дидеокси-а-Ь-арабино-гексапиранозил)-окси]-3 ',4 '.5 *.6.6\7.10.11,14.15.17а,20.20а-,20Ь-тетрадека-гидроспиро[ 11,15-метано-2Н,-1ЗН, 17Н-фуро[4,3,2ря][2,6]бензодиокса-циклоокта-децен-13,2'-[2Н]пиран]-17-он (или 25-(1 -метилэтил)-5-0-деметил)-25-де( 1 -метнлпропил)-22,23-дигидроавермектин Ац).

метилпропил)-22,23-дигидроавермектин Ai«).

о-

Компонент    R    Эмпирическая    формула Молекуляная масса

Н₂В„    СН₂-СН₃    С41Н74О14    875

Н₂В„    СН₃    С47Н72О14    861

Ивермектин - кристаллический порошок, без запаха, цвет от белого до желтовато - белого. Насыпная плотность от 1,1 до 1,3 г/см³. Практически нерастворим в воде (около 10 мкг/дм³ при 21°С), плохо растворим в алифатических углеводородах и циклогексане. Растворим в этиловом спирте, хорошо растворим в метиленхлориде, метилэтилкетоне, пропиленгликоле, полиэтиленгликоле. Ивермектин получают путем селективного каталитического восстановления абамектина, который в свою очередь является продуктом жизнедеятельности почвенных организмов Streptomyces avermitilis.

Температура плавления 150- 155°С.

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая пероральная токсичность (LD jo) для крыс: 42,8 - 52,8 мг/кг, для мышей: 11.6 - 87.2 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD 50) для крыс > 660 мг/кг, для кроликов - 406 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (ЪК₅о) для крыс > 5110 мг/м³.

Область применения препарата

Баймек 1% ИР используется в качестве антипаразитарного и антигельминтного средства (против нематод, вшей, кровососок, возбудителей саркоптоидозов, личинок овода и других членистоногих) для крупного рогатого скота, овец, свиней путем подкожного введения.

Гигиенические нормативы:

ДСД - 0,001 мг/кг массы тела

Я

9.2.    Дериватизация

К ацетонитрильному раствору прибавляют 0,1 см³ l-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0-5°С, помещая колбу в ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 см³ реактива для дериватизации (п.7.4), перемешивают и выдерживают 1 час при комнатной температуре.

Дериватизированные экстракты подвергают очистке по п. 9.3.

9.3.    Очистка экстракта

Аликвоту раствора после дериватизации объемом 0,7 см³ переносят в градуированную пробирку вместимостью 5 см³, добавляют 5 см³ гексана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин, верхний гексановый слой отбирают с помощью пипетки, перенося в стакан вместимостью 50 см³, операцию экстракции повторяют новой порцией гексана объемом 5 см³. Верхний гексановый слой также переносят в химический стакан, объединяя с первым экстрактом. Объединенный гексановый экстракт вносят на патрон для твердофазной экстракции Florisil Sep Рак, подготовленный по п. 7.7. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1-2 капли в сек. Элюат собирают непосредственно в круглодонную колбу.

Флуорогенное производное ивермектина дополнительно элюируют с патрона 5 см³ гексана, также объединяя элюат с первой порцией в круглодонной колбе. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35°С. Остаток в колбе растворяют в 1,4 см³ ацетонитрила и анализируют на содержание ивермектина по п. 9.4.

9.4.    Условия хроматографирования

Колонка стальная, длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая Zorbax ODS, зернением 5 мкм

Температура колонки: комнатная

Подвижная фаза: метанол-вода (98:2, по объему)

Скорость потока элюента: 2 см³/мин

Длина волны: возбуждение 364 нм эмиссия 470 нм

Показание аттенюатора: 64

Объем вводимой пробы: 20 мм³

Ориентировочное время выхода флуорогенного производного ивермектина:

около 10 мин.

а

Образцы, дающие пики, большие, чем стандартный раствор ивермектина с концентрацией 0.1 мкг/см³. разбавляют ацетонитрилом.

10. Обработка результатов анализа

Содержание ивермектина в пробе рассчитывают по формуле:

(Ах К)

X *----------- ,    где

m

X - содержание ивермектина в пробе, мг/кг;

А - концентрация ивермектина, найденная по градуировочному графику,

мкг/см³;

m - масса анализируемого образца, г;

К - коэффициент пересчета, учитывающий объем реакционной смеси после дериватизации, используемый для анализа, равный 2.

11. Контроль погрешности измерений Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

12. Разработчики.

Юдина Т.В., д.б.н., проф. зав. лаб., Федорова Н.Е., д.б.н., вед. научн. сотр., Волкова В.Н. к.х.н., научн. сотр.

Федеральный научный центр гигиены им Ф.Ф. Эрисмана (ФНЦГ им.Ф.Ф.Эрисмана)

141000, г. Мытищи Московской обл., ул. Семашко, д. 2, лаборатория аналитических методов контроля.

Телефон: (095) 586-1276

МДУ:

-    для крупного рогатого скота: печень - 0,1 мг/кг, жир • 0,04 мг/кг; мясо - не требуется;

-    для овей и свиней: печень - 0,015 мг/кг, жир - 0,02 мг/кг; мясо - не требуется.

1. Метрологические характеристики метода

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1 Метрологические параметры

Анализируемый объект Метрологические параметры, Р = 0,95. п = 24 Предел обнару-' жения. мг/кг Диапазон определяемых концентраций. мг/кг Среднее значение определения % Стандартное отклонение, S.% Доверитель- 1 ный интервал среднего результата, % \ Печень 0,001 0.001 - 0.02 83.48 6,21 6,5 ! Почки 0,001 0,001 -0,02 82,89 5,15 5.4 Мышцы (мясо) 0,001 0,001-0.02 82,93 5,45 5,7 Жир 0.002 0.002 - 0.04 84,00 5.69 5.9 1

Таблица 2 Полнота извлечения ивермектина из проб печени, почек, мышц и жира сельскохозяйственных животных _(6    повторностей    для    каждой    концентрации) _

Среда Внесено ивермектина мг/кг Обнаружено ивермектина мг/кг Полнота извлечения.% 1 2 3 4 0,001 0,000804 + 0,000078 80,44 0.002 0,001691 +0,000205 84,54 Печень (свиная) 82,92 0,01 0,008292 + 0,000692 0,02 0,017209 + 0,002747 86,04 0.001 0,0008066 + 0,000076 80,58 Почки (свиные) 0.001624 + 0,000136 81,19 0.002 0,01 0.008514 + 0,000244 85 J 4 0.02 0,016932 + 0,002236 84,66

Продолжение таблицы 2

1 2 3 4 0,001 0,0007940 + 0,000077 79,40 0,002 0,001722 + 0,000241 86,09 Мышцы (мясо. 0,01 0,008387 + 0,000701 82,87 свинина) 0,02 0,016676 ±0,001632 83,38 0,002 0,001678 + 0,000211 83,89 0,004 0,003302 + 0,000290 82,56 Жир свиной 0,02 0,017031 +0,002494 85,16 0,04 0,033761 + 0,003936 84,40

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуориметрическим детектором после экстракции из анализируемой пробы органов и тканей сельскохозяйственных животных этил ацетатом, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, превращения ивермектина во флуорогенное производное и последующей очистки на патроне для твердофазной экстракции Florisil Sep Рак.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки. ¹

Пипетки градуированные 2-го класса точности ГОСТ 29227 вместимостью 1,0, 2,0; 5,0,10 см¹

Пробирки градуированные вместимостью 5 или 10 см¹ ГОСТ 1770 Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью ГОСТ 1770 10,25, 50. 100, 200, 500 и 1000 см¹ Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Ивсрмекгин с содержанием компонента HjBu- 83,9%; Н₂В|_Ь-

5,9% (Байер АГ, Германия)

Ацетонитрил для хроматографии, хч    ТУ-6-09-4326-76

Вода бидистиллированная, деионизованная или перегнанная ГОСТ 6709 над КМпО«

н-Гексан, хч    ТУ-6-09-3375

Метиловый спирт (метанол), хч    ГОСТ 6995

l-N-метилимидазол, puriss for DNA synthesis, £99%, Fluka

Натрий хлористый, хч    ГОСТ 4233

Трифторуксусный ангидрид, ригшп; >98.0% (GC), Fluka

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч    ГОСТ 22300

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами)

Аппарат для встряхивания типа АВУ-бс Баня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария)

Воронки делительные вместимостью 150 и 250 см¹ Воронки конусные диаметром 30-37 и 60 мм Гомогенизатор Груша резиновая

Колбы плоскодонные вместимостью 200 - 250 см¹    ГОСТ    9737

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 50, 100 и ГОСТ 9737

&

250 см³

Мембранные фильтра капроновые, диаметром 47 мм Насос водоструйный    ГОСТ    10696

Патроны для твердофазной экстракции Fiorisil Sep Рак (Waters, США)

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или ТУ 25-11-917-74 ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi,

Швейцария

Стаканы химические, вместимостью 100 и 400 см³    ГОСТ    25336

Стекловата

Стеклянные палочки

Установка для перегонки растворителей

Набор для фильтрации растворителей через мембрану

Хроматографическая колонка стальная, длиной 25 см,

внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая Zorbax ODS,

зернением 5 мкм

Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50-100 мм³

Шприц медицинский с разъемом Льюера    ГОСТ    22090

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками

4. Требования безопасности

4.1.    При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1005.

4.2.    При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.

S. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

Cf

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

•    процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20±5)°С и относительной влажности не более 80%.

•    выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции:    очистка

органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка патронов для очистки экстрактов, проверка хроматографического поведения вещества на патронах для твердофазной экстракции.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2.    Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, далее водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.3.    Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 980 см³ метанола, добавляют 20 см³ бидистиллированной или деионизированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.3. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 2 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.4. Приготовление реактива для дериватизации

Смешивают трифторуксусный ангидрид и свежеперегнанный ацетонитрил в объеме 1 : 2. Реактив годен к употреблению в течение рабочего дня.

7.5. Приготовление градуировочных растворов

7.5.1. Исходный раствор ивермектина для градуировки (концентрация 100 мкг/см³)    В мерную колбу вместимостью 100 см³ помешают 0,0100 г ивермектина,

растворяют в 50-70 см³ ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в морозильной камере в течение месяца.

Растворы № 1-5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.5.2 Раствор Ni 1 ивермектина для градуировки (концентрация 1 мкг/см³)

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1 см³ исходного градуировочного раствора ивермектина с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.5.1.), разбавляют ацетонитрилом до метки. Раствор хранится в морозильной камере в течение 10-ти дней.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения ивермектина из исследуемых образцов.

7.5.3. Рабочие растворы № 2-5 ивермектина для градуировки (концентрация 0.005 - 0.1 мкг/см*)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают по 0.5, 1.0, 5.0 и 10,0 см³ стандартного раствора №1 с концентрацией I мкг/см³ (п. 7.5.2.), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы 2 - 5 с концентрацией ивермектина 0.005,0.01,0.05 и 0.10 мкг/см³, соответственно.

Растворы хранятся в морозильной камере не более недели.

7.6. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (mV х сек) от концентрации ивермектина в растворе (мкг/см³), устанавливают методом

&

абсолютной калибровки по 4-м растворам флуорогснного производного ивермектина для градуировки.

Для построения градуировочной харатеристики в градуированные пробирки вместимостью 5 см³ вносят по 1 см³ каждого из 4-х рабочих растворов ивермектина №№ 2-5, прибавляют по 0,1 см³ 1-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0-5°С, помещая пробирки с ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 см³ реактива для дериватизации (п.7.4), перемешивают и выдерживают час при комнатной температуре.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

7.7. Подготовка патрона для очистки экстрактов

Патрон для твердофазной экстракции устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума*, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом Льюера объемом не менее 10 см³. используемый в качестве емкости для элюента.

Концентрирующий патрон промывают 5 см³ метанола, высушивают пропусканием воздуха (с использованием вакуума) в течение 5 мин. Затем через патрон пропускают 5 см³ гексана. Процедуру проводят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин. при этом нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

* Примечание: В отсутствии специального аллонжа, жидкость продавливают через патрон с помощью шприца, скорость прохождения раствора не должна превышать 1-2 капли в сек.

8. Отбор проб

Отбор проб осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТов на исследуемые продукты: ГОСТ 7269-79 «Мясо».

Обобранные образцы продуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки, стеклянные банки с притертыми крышками. Образцы анализируют непосредственно после отбора проб или хранят в морозильной камере при -20°С (допускается хранение до 2-х месяцев).

Непосредственно перед анализом образцы разморажизают, пробы органов и тканей массой 200 - 300 г тщательно измельчают с использованием гомогенизатора. Пробу гомогенизированного образца печени, почек и мяса массой 10 г. жира массой 5 г взвешивают на аналитических весах в плоскодонных колбах вместимостью 250 см³.

9. Выполнение определения

9.J. Экстракция

К пробе гомогенизированного образца (10 г печени, почек, мяса. 5 г жира), помешенной в колбу вместимостью 250 см³, приливают 100 см³ этилацстата, тщательно перемешивают путем встряхивания, выдерживают на ультразвуковой бане 5 мин. помещают на встряхиватель на 30 мин, дополнительно выдерживают на ультразвуковой бане 5 мин и снова помещают на встряхиватель на 30 мин.

Надосадочную жидкость переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 см³, фильтруя ее через тампон из стекловаты, помешенный в конусную химическую воронку. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 40°С. Остаток растворяют в 30 см³ гексана, перекосят в делительную воронку' вместимостью 150 см⁵, добавляют 20 см⁵ ацетонитрила, интенсивно встряхивают в течение 1 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой сливают в круглодонную колбу. В воронку добавляют новую порцию ацетонитрила объемом 20 см³, вновь интенсивно встряхивают в течение 1 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой сливают в круглодонную колбу, объединяя его с первым экстрактом, и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 40°С. Сухой остаток растворяют в 30 см³ смеси зцетонитрил-вода (1:1), помешал на ультразвуковую баню на 1 мин. Раствор переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³, добавляют 10 см³ насыщенного раствора хлористого натрия, 70 см³ гексана, интенсивно встряхивают воронку в течение 1 мин. Верхний органический слой собирают в круглодонную колбу вместимостью 250 см³. Водно-аиетонитрильную фазу вновь переносят в делительную воронку и повторяют операцию экстракции, используя 70 см³ гексана.

Объединенную органическую фазу упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 40°С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетонитрила и подвергают дериватизации по п. 9.2.

1

Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений Жидкостной хроматограф с    флуориметрическим Номер Госреестра 15945-97

детектором с переменной длиной волны (фирмы Perkin-Elmer, США)

Весы аналитические ВЛА-200    ГОСТ    24104

Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим ГОСТ 7328 пределом взвешивания до 500    г и пределом

допустимой погрешности +/- 0,038 г Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2 и 2-1000-2 Меры массы