УТВЕРЖДАЮ Главный государственный
|
,2004 г. Дата введения: l I |
санитарный врач Российской Федерации-Первый заместитель Министра здравоохранения Российской /Федерации
.Онищенко
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение массовой концентрации клозантела в органах и тканях животных, плазме и молоке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Методические указания МУК4.1.//ЯГ -04
1. Область применения
Методические указания по определению массовой концентрации клозантела в продуктах питания животного происхождения предназначены для проведения лабораторных исследований безопасности пищевой продукции органами и учреждениями государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации/ а также могут быть использованы организациями, осуществляющими контроль качества пищевых продуктов в соответствии с санитарными правилами и нормами «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. СанПиН
2.3.2.560-96», аккредитованными в установленном порядке.
2. Общие положения
Клозантел - противопаразитарный препарат обладает широким спектром активности против экто- и эндопаразитов. Действует на зрелые и личиночные стадии развития паразитов.
Проявляет ярко выраженную активность против трематод, желудочно-кишечного тракта нематод, личинок оводов, чесоточных клещей у крупного и мелкого рогатого скота. Клозантел обладает также высокой эффективностью при фасииолезе.
На основе клазантела и его натриевой соли производится ряд ветеринарных препаратов.
Настоящие методические указания устанавливают
хроматографическую методику количественного анализа продуктов питания животного происхождения на содержание клозантела с нижним пределом измерения 0,1 мг/кг.
3. Физико-химические свойства, токсикологическая характеристика и гигиенические нормативы
C22H14CI2J2N2O Мол. масса: 663,08
Клозантел, относящийся к классу производных
салициланилидов, представляет собой порошок белого или
желтоватого цвета, не растворяется в воде, слабо растворяется в низших спиртах.
МУК 4.X
хлороформе, растворяется в демитилсульфоксиде, диметилформали-де, диметилацетамиде, пропиленгликоле, полиэтиленгликоле. Натриевая соль клозактела - клозантела натрий дигидрат растворяется в низших спиртах.
Температура плавления (Тп.т) - 217,8®С.
Клозантел относится к умеренно опасным веществам 3 класса опасности: ЛД50 при пероральном введении Оелым крысам составляет 2300 мг/кг. В терапевтической (10 мг/кг) и повышенных дозах препарат не обладает эмбриотоксическими, тератогенными, мутагенными и аллергенным свойствами.
4. Погрешность измерения
Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью не превышающей 22% при доверительной вероятности -0, 95.
5. Метод измерений
Измерения массовой концентрации клозантела основаны на использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением УФ-детектора на колонке с обращенной фазой после экстракции его органическими растворителями из органов и тканей животных, плазмы с последующей очисткой экстрактов. Детектирование ведут при длине волны 237 нм.
Чувствительность метода составляет 0,1 мкг в пробе, нанесенной на колонку.
Л 90
МУК 4.1
6. Средства измерения, вспомогательные устройства, натариади,
реактивы, растворы
6.1. Средства измерения
• аналитический хроматограф. Waters или аналогичный с УФ-детектором, инжектором с объемом дозирующей петли - 0,05 см*, с компьютерной системой обработки хроматографических данных (или с интегратором);
• весы аналитические 2-го класса точности, ГОСТ 24104-88;
• весы микроаналитические, точность взвешивания до 4-го десятичного знака, Chan (США) или аналогичные;
• автоматические пипетки, ТУ 64-1-3329-81;
• колбы мерные, вместимость» 100 мл, ГОСТ 1770-74;
• цилиндры градуированные, вместимостью 100 мл, ГОСТ 1770-74;
• шприц Гамильтона (Швейцария).
6.2 Вспомогательные устройства
• центрифуга, центрифужные полиэтиленовые пробирки, вместимостью 50 и 15 мл;
• ультразвуковой диспергатор УЗДН-1М или аналогичный;
• миксер или гомогенизатор;
• холодильник;
• колонка аналитическая Диасорб-130-С16Т 250x4 мм, с размером частиц 6 мкм (фирма «БиоХимМак», Россия) или аналогичная;
• аппарат для упаривания - Vortex, Evaporater и др.;
• роторный испаритель с колбами;
• сушильный шкаф;
• патроны Cil (фирма «БиоХимМак», Россия);
• сцинтиляционные флаконы («Сигма», каталог 2001-2002 гг.
» .)
МУК 4.1
6.3. Реактивы
• ацетонитрил, хроматографически чистый ТУ ИРЕА 22-66 или импортный;
• гексан;
• спирт бутиловый третичный;
• спирт этиловый, ГОСТ 5964-84;
• спирт метиловый, ГОСТ 6995-67;
• хлороформ;
• стандартный образец - клозантела натрия дигидрат, поставляемый НБЦ «Фармбиомед», содержание действующего вещества указано на этикетке.
7. Требования безопасности
7.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.
7.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-76.
7.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
8. Требования к квалификации оператора
К выполнению измерений и обработке результатов допускают лиц с высшим и средним специальным образованием, имеющих навыки работы на жидкостном хроматографе.
9. Условия измерений
9.1. Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20±10) °С, атмосферном давлении 84-106 кПа и влажности воздуха не более 80%.
9.2. Измерения на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
272
МУК 4.1
9.2. Измерения на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
10. Подготовка к выполнению измерения
10.1. Приготовление растворов
10.1.1. Стандартный раствор дигидрата клозантела натрия
Готовят основной раствор клозантела натрия дигидрата в метиловом спирте таким образом, чтобы в 100 см3 раствора содержалось 4 мг клозантела. Раствор хранению не подлежит.
Из основного раствора следующие разведения градуировочных растворов: в стеклянные пробирки объемом 5 см3 вносят 1,0; 0,5; 0,1; 0,02 и 0,01 см3 основного раствора и доводят объем до 1 см3 метиловым спиртом.
10.1.2. Раствор элюента готовят путем смешивания метилового спирта с ортофосфорной кислотой 0,01М в соотношении 9:1.
10.2. Подготовка прибора
Общую подготовку прибора осуществляют согласно инструкции по эксплуатации.
10.3. Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, включающую взаимосвязь величины хроматографического сигнала от массы анализируемого вещества в хроматографируемом объеме пробы, устанавливают по методу абсолютной калибровки с использованием серии подготовленных градуировочных растворов, содержащих 40; 20; 10; 4; 0,8 и 0,4 мкг клозантела/см3. На аналитическую колонку наносят по 0,05 см3 подготовленных растворов.
Условия детектирования:
Подвижная фаза - метиловый спирт: ортофосфорная кислота
0,01 М в соотношении 9:1.
Скорости потока - 1 см3/мин; давление 120-160 бар. Чувствительности детектора - 0,05.
Длина водны - 237 им.
МУК 4.1
На хроматограмме отмечают пик со временем удерживания 7
мин.
По результатам анализа калибровочных образцов строят калибровочный график - на оси абсцисс откладывают количество клозантела, нанесенного колонку, на оси ординат - площадь пика .
10.4. Отбор проб
Отбор проб, для анализа ведут в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения количеств пестицидов», № 2051 от 21.09.79 (Москва).
В день забоя животных пробы органов и тканей берут по 200-500 г, помещают в целлофановые пакеты (для каждого органа -свой пакет). Пакеты снабжают этикетками, на которых указывают: дату забоя животного, название органа.
Пробы для анализа хранят в морозильнике при температуре от -18®С до -20°С (допускается хранение до 2-х месяцев).
Кровь отбирают в пробирки с гепарином и центрифугируют. Супернатант хранят в морозильнике при температуре -20вС.
10.5 Подготовка проб к определению
10.5.1 Экстракция и очистка экстрактов
Плазма
1 см3 плазмы помещают в сцинтиляционный флакон, туда же добавляют 2 см3 ацетонитрила и 4 см3 хлороформа. Пробы встряхивают на вортексе 10 мин., затем центрифугируют при 1000 g в течение 15 мин. Органическую фазу переносят в сцинтиляционный флакон объемом 20 см3 и упаривают досуха в вакуумном сушильном шкафу при температуре 50°С. Экстракцию плазмы проводят дважды. Сухой остаток растворяют в 1 см3 ацетонитрила. Ацетонитрильный раствор трижды промывают 0,5 см3 гексана. Гексановые экстракты отбрасывают, а ацетонитрильный раствор упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 см3 метанола и обрабатывают ультразвуком в течение 1 минуты.
МУК 4.1
Раствор используют для хроматографии.
Мышцы, почки и печень
Полученные пробы ткани выдерживают в морозильной камере при Т “ -18°С в течение 1 суток. Затем медленно оттаивают при Т » 4 “С 8 течение 12 часов. Пробы вновь замораживают при Т - -18°С на 1-2 часа, оттаивают при комнатной температуре.
Навеску 5,0 г измельчают в гомогенизаторе (или острыми ножницами) и помешают в сиинтилляционный флакон, добавляют б см3 ацетонитрила, пробы обрабатывают на ультразвуковой бане в течение 5 минут. Затем встряхивают на вортексе 10 минут и центрифугируют 1000*д в течение 15 минут. Экстракт переносят в сцинтиляционный флакон объемом 20 см3, остаток повторно экстрагируют 4 смэ ацетонитрила и упаривают досуха в вакуумном сушильном шкафу при температуре 45"С (при упаривании добавляют небольшое количество третичного бутилового спирта для избежания вскипания, для удаления остатков воды добавляют небольшое количество ацетонитрила). Сухой остаток растворяют в 4 см3 ацетонитрила. Ацетонитрильный раствор трижды промывают 3 см3 гексана. Гексановые экстракты отбрасывают, а ацетонитрильный раствор упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 см3 ацетонитрила. Обрабатывают ультразвуком в течение 1 минуты. Раствор используют для хроматографии.
Экстракты из печени перед хроматографированием подвергают очистке на патронах С1 следующим образом: патрон С1 уравновешивают 5 см3 ацетонитрила. На патрон наносят образец экстракта из печени объемом 1см3 и элюируется 5 см3 ацетонитрила. Элюат упаривают досуха при температуре 45*С. Сухой остаток растворяют 1 см3 ацетонитрила. Раствор используют для хроматографии.
11. Выполнение измерений
Анализ включает не более 10 испытуемых образцов. Перед началом и в конце работы проводят анализ стандартного образца, чтобы убедиться в стабильности работы системы.
МУК 4.1
Объем наносимой на колонку пробы для всех объектов составляет 0/05 см3.
Условия проведения процесса хроматографирования описаны в разделе для стандартного образца.
12. Обработка результатов
Для обработки результатов хроматографирования используется программа «Мультихром». На хроматограммах исследуемых образцов определяют площадь пиков, по времени удерживания соответствую-тих пикам стандарта клозантела.
По калибровочному графику находят содержание клозантела в объеме инжектируемой пробы испытуемого образца.
Содержание клозантела в образце рассчитывают по формуле:
Скп.иУ,
УУ,к
Скп. - концентрация клозантела в образце, мкг/см3;
Скп.и - содержание клозантела в объеме инжектируемой пробы образца, определяют по графику, мкг;
V, - объем пробы, нанесенной на колонку, см? (0,05 см3)
V; - объем пробы, подготовленной для ВЭЖХ, см3 (1 см3);
Vs - объем пробы плазмы, взятой для экстракции;
К - коэффициент, учитывающий степень извлечения клозантела (получен при постановке модельных опытов с внесением известных количеств клозантела, К ■ 0,8).
Разработчики:: к.м.н. В.Г. Тер-Симоняк, kjc.h. С.В. Авчук, к.б.н. 6.Б. Кругляк,.
(ООО НБЦ «Фармбиомед». Москва)
JL7£