«УТВЕРЖДАЮ»

Главный государствен и ый^нитармый врач РФ Первый зам.МинистраларавоохДанснияРФ

)ГЮнищенко

2004 г.

МУК 4,1. /Щ'М

Дата введения: /    Z&*    *

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ИЗМЕРЕНИЮ УРОВНЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ НАФТАЛИНА В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ МЕТОДОМ ГАЗО-ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1. Вводная часть

НАЗНАЧЕНИЕ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДИКИ

Настоящие методические указания предназначены для органов и учреждений санитарно-эпидемиологического надзора России, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхозпрома и лабораторий других министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов в продуктах питания, кормах и объектах внешней среды.

Настоящие методические указания устанавливают метод газо-жидкостной хроматографии для определения содержания остаточных количеств нафталина в биологических объектах (органах и тканях) овец и крупного рогатого скота после купки их в 2% растворе водной эмульсии бесфенольного креолина.

Г

КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНАЛИЗИРУЕМОГО ПРЕПАРАТА

Нафталин был открыт в 1819 году как составная часть каменноугольной смолы. Продуктами переработки каменноугольной смолы являются каменноугольные масла, которые по химическому составу представляют собой сложные смеси органических соединений, в основном ароматического характера. С давних пор (с 1887г) на основе каменноугольных масел готовят акарицидный препарат - бесфенольный креолин, широко используемый в ветеринарной практике. В состав этого препарата входят до 60% масел, до 25% канифольного мыла и вода. Содержание нафталина в бес фенольном креолине составляет 9-12%.

Препарат креолин бесфенольный каменноугольный (регнет.номер в списке разрешенных к применению пестицидов № 01-774-0004-1) выпускается на основе действующего вещества масла каменноугольного. Препарат применяется для текущей, заключительной и профилактической дезинфекции, дезодорации и ароматизации объектов животноводства и транспортных средств, используемых для перевозки животных. Агрегатное состояние препарата -однородная, маслообразная жидкость, прозрачная в тонком слое, от темно-коричневого до черно-бурого цвета, с запахом каменноугольного масла.Содержаиие влаги не более 16%, нафталина не более 12,5%, фенола не более 2-3%, не летуч, 5%-ная водная эмульсия препарата устойчива в течение 48 часов.

Токсиколого-гигиеническая характеристика препарата представлена по материалам ряда отечественных и иностранных литературных источников, (документы ВОЗ, монографии, справочники). Острая пероральная токсичность: ЛД 50 крысы 6200 мк/кг    ЛД    50 мыши 2009 мк/кг

Клинические проявления интоксикации: головокружение, головная боль, тошнота, общая слабость. Оказывает раздражающее действие на верхние дыхательные пути, кожу, слизистые. Острая дермальная токсичность:

ЛД 50 крысы 15520 мг/кг    ЛД    50 овцы 9500 мг/кг

ПДК в воздухе рабочей зоны:

Фенола    0,3 мг/м    *

Нафталина    20 мг/м⁵

Ацснафтена    10 мг/м⁵

комнатной температуре с подсоединетшми 3-мя адсорбционными ловушками с силикагелем SEP-PAK ® фирмы Waters Associates.(pHcyHOK ловушки приведен на рис.4). Затем емкость с эф и ров ым экстрахтом помещают в водяную баню, нагретую до 65 °С, и подключают водоструйный насос. Осторожно отгоняют остатки этилового эфира в течение 7 мин., при этом нафталин сублимируется и адсорбируется на силикагельных поглотителях. После охлаждения всей системы поглотители отсоединяют от колбы и промывают каждый поглотитель с помощью шприца 5 см¹ этилового эфира для извлечения нафталина. Экстракт отгоняют на роторном испарителе досуха при температуре 0°С, затем добавляют 1,5 Ы этилового эфира. (У2).Из пробирки отбирают необходимый объем(У1 )и вводят его в хроматограф. Объем вводимой в хроматограф пробы составляет 2-9 мкл в зависимости от содержания нафталина.Ввод каждой пробы повторяют дважды. Определяют с помощью линейки высоту сигнала нафталина в параллельных вводах (XI и Х2). За результат измерения принимают среднее арифметическое значение: Х*(Х1 +Х2)/2.

Расхождение между измеренными высотами сигналов не должны отличаться более, чем на 5%, т.е. (XI - Х2)/Х < 0,05.В противном случае ввод пробы повторяют.

На рис.З. приведены хроматограммы, полученные при проведении анализа печени овиы с добавлением известного количества нафталина.

Массовую долю нафталина в пробах биологических объектов рассчитывают по формуле:

A* V2

m *=----------,    где    (I)

К* н ’VI

m - массовая концентрация нафталина в анализируемом растворе, после приведения всех размерностей в соответствие, выраженная в мг/кг

А - количество нафталина в пробе, найденное по калибровочному графику, нг

К - степень извлечения нафталина из биологической пробы, определенная экспериментальным путем и равная 0,75 н - масса навески,г V2 - объем экстракта, см*

V1 - объем вводимой в хроматограф пробы, мкл

За результат анализа принимают среднее арифметическое значение двух параллельных определений ml и m2.

m « (ml + m2)/2    (2)

Рис.4. Адсорбционная трубка с силикагелем 1.    Резиновый шланг 2.    Стекловата в трубке 3.    Комочки из проволоки для предотвращения выброса силикагеля 4. Трубка стеклянная размером 33x4мм

&

При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники езопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТу 12.1.007.

Помещение, в котором проводят измерения, должно бьпь оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией.

Элсктробезопасностъ при работе с электроустановками по ГОСТу 12.2.007.

Организация обучения персонала безопасности труда но ГОСТу 12.0.004.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТу 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТу 12.4.009.

Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны нс должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.686-98 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны».

При эксплуатации сжатых газов следует соблю7дать «Правила устройства и бсзопасносной эксплуатации сосудов, работающих под давлением» (ПБ 10-115-96), Госгортехнадзор России, ГОСТ 12.2.085.

IV. Разработчики

В разработке методики определения остаточных количеств нафталина в органах и тканях животных методом газо-жидкостной хроматографией принимал участие авторский коллектив Испытательного Центра «Пестицид» под руководством доктора химических наук, профессора Головкина Геннадия Васильевича, в составе к.х.н., ст.н.с. Егоровой Т.А., докт.ветерен.н., лроф. Тимофеева Б.А., Горлова И.Ф., Гиченкова С.Г.

Креолин бесфснольный каменноугольный обладает широким спектром антимикробной активности ( в отношении неспоро-образуюигих грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов).

При работе с препаратом соблюдать рекомендуемые меры предосторожности в соответствии с «Гигиеническими требованиями к хранению, применению и транспортировке пестицидов и агрохимикатов. Санитарные правила и нормы СаНиН 1.2.1077-01 от 31.10.01»

Производит бесфенольный креолин ОАО завод «Ветеринарные препараты» по ТУ 9392-023-00483079-98.

Нафталин - белое кристаллическое вещество, брутто-формула СюН». м.м. 128. Структурная формула :    ^

Т.плавления - 80,3°С, т. кипения - 218°С, хорошо растворяется в горячем спирте, этиловом эфире, бензоле, хлороформе. Нафталин (раствор в изооктане) поглощаег в УФ-области спектра при 220нм, довольно летуч, отгоняется с парами воды, легко окисляется, сублимируется при 50°С/760 мм рт.ст.

Применяется в качестве инсектицида (против моли).

Содержание остаточных количеств нафталина в биологических объектах (органах и тканях) овец и крупного рогатого скота и определяет предлагаемая методика.

II. Методика определения остаточных количеств нафталина в органах животных методом г аз о-жидкостной хроматографии

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ

ШшшшЕмовда

Метод основан на извлечении нафталина путем экстракции этиловым эфиром из биологических объектов (печень, почки, селезенка, сердце, легкое, мышечная и жировая ткани и т.п.) животных, очистки экстрактов сублимацией (возгонкой) нафталина из экстрактов с улавливанием нафталина адсорбентами с силикагелем, последующим вымыванием нафталина этиловым эфиром из адсорбентов н    измерении    сигнала нафталина методом газо-жидкостной

хроматографии на неподвижной фазе 5% ХЕ-60 на хроматоне N-AW-DMCS (0,125 - 0,160 мм). Очистка экстрактов пробы обеспечивается методом подготовки пробы и селективной способностью нафталина сублимироваться при пониженной температуре.

Метролоппесюге характеристик метода

Метрологические характеристики газо-хроматографического метода приведены в таблицах 1,2 и 3.

Табл.1.

Характеристики измерении

Определяемое вещество Наименование Диапазон опре- Нижний предел объекта деля см ых кон- обнаружен ия,мг/кг центраций.нг нафталин биологи ч.органы 0.85-13,6 0,03 животных

При разработанных условиях мешающих определению нафталина примесей не обнаружено.

Приведенные в настоящих методических указаниях оптимальные аппаратурные параметры и условия проведения измерений относятся к газожидкостному хроматографу «Цвет-ПО». При использовании хроматографов других марок эти параметры должны быть согласованы с требованиями Руководства по эксплуатации фирмы-изготовителя.

Минимально детектируемое количество (чувствительность определения) -1нг .Линейный диапазон детектирования 0.85 -13.6 нг. Характеристики измерений приведены в табл. 1.

Предел обнаружения массовых долей нафталина в биологических объектах составляет величину 0.03 мг/кг.

Настоящая методика с вероятностью Р=0.95 обеспечивает получение результатов анализа с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в табл.2.

Табл. 2. Метрологические характеристики погрешностей измерений

Определяемое Среднее Стандартное Доверительные вещество и кон- значение. отклонение границы суммарной центрация,нг нг S погрешности, Р=0.95, п=5 нафталин 0,85 0,85 0,02 0,85± 0,12 нафталин 1,70 1,71 0,04 1,71± 0,16 нафталин 6,80 6,80 0,06 6,80± 0,14 нафталин 13,60 13,62 0,07 13,62* 0,22 Табл.З. Доверительный интервал и полнота определения нафталина в биологических объектах овцы (на примере печеюмточек и сердца) Биолог.объект Добавлено Обнаружено Доверят. Полнота овцы нафталина. нафталина. интервал < определения. мг/кг мг/кг ± % печень 0,03 0,0221 0.003 73,8 0,09 0,0682 0,004 75,8 0,12 0,0890 0,006 74,2 0,15 0,1130 0,006 75,5 почки 0,03 0,0225 0.002 75,1 0,09 0,0680 0,002 75,6 0,12 0,0896 0,004 74,7 0,15 0,1110 0,004 74,1 сердце 0,03 0,0224 0.003 74,6 0,09 0,0682 0,003 75,8 0,12 0,0908 0,004 75,7 0,15 0,1126 0,005 75,1

<S

Вспомогательные устройства и материалы

Магнитная мешалка ММ ЗМ ТУ 25-110-834-73 Насос водоструйный Роторный испаритель

Термостат водяной типа mlm 8 (Польша) с пределами температур - 60 - +150°С

Колбы конические Кн 2-100-29, Кн 2-250-29 ГОСТ 25336

Колбы круглодонные 1-100    ГОСТ 1770

Пробирки с притертой пробкой емкостью 5 см * ГОСТ 1770

Адсорбционные трубки, стеклянные, заполненные мелкодисперсным

силикагелем для газовой хроматографии, фирма Waters,тип SEP-PAK® ,размер

трубок 30 Ммм., размер частиц 0,100- 0,125мм (см. рис.4)

Шприцы стеклянные емк.500,100 и 10 мкл

Мясорубка или микроразмельчитель ткани РТ-2 МРТУ 42 1505-63 Реактивы

Диэтиловый (этиловый) эфир ОСТ 84-2006-88

ГОСТ 2603 ГОСТ 4166 ТУ 6П-56-68 ГОСТ 9293

ГОСТ 3033 или генераторный ГОСТ 11882 или компрессорный Наполнитель для колонки хроматон N-AW-DMCS (размер частиц 0.125-0,160мм), пропитанный 5% ХЕ-60

Допускается применение других вспомогательных устройств и материалов и реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных.

Дриддаменде. растворов д построение градуировочного графика. Растворы нафталина с массовой концентрацией 0.01мг/1 см¹ и 3,4 мкг/см⁹.

В мерную колбу емкостью 1000 Ьдавешивают на микровесах 10 мг нафталина (точность взвешивания ± 0,02мг), добавляют РОШеснна, растворяют навеску полностью и доводят до метки ацетоном. Перемешивают.

Получают раствор А с концентрацией нафталина 0,01мг/см'. В мерную колбу емкостью 100 см* вносят цилиндром 34 cm^j раствора А, получают раствор В с концентрацией нафталина 3,4 мкг/см', который используют для

приготовления растворов при построении градуировочного графика. Срок хранения растворов А и В - два месяца при условии хранения их в холодильнике.

Растворы нафталина для построения градуировочного графика.

а)    В пробирку с притертой пробкой вносят шприцем 20 мкл раствора В, добавляют 180 мкл ацетона. Перемешивают.

б)    В пробирку с притертой пробкой вносят шприцем 40 мкл раствора В, добавляют 160 мкл ацетона. Перемешивают.

в)    В пробирку с притертой пробкой вносят шприцем 80 мкл раствора В, добавляют 120 мкл ацетона. Перемешивают.

г)    В пробирку с притертой пробкой вносят шприцем 160 мкл раствора В, добавляют 40 см* ацетона. Перемешивают.

д)    В пробирку с притертой пробкой вносят шприцем 54,4 мкл раствора А, добавляют 45,6 мкл ацетона. Перемешивают.

Срок хранения этих растворов составляет одну неделю при условии хранения их в холодильнике.

Построение градуировочного графика.

Градуировочный график строят, откладывая на оси ординат высоту сигнала нафталина в мм, на оси абсцисс - массовую концентрацию в нг.

Для получения данных для построения графика в хроматограф вводят 2,5мкл растворов а-д. Каждый объем пробы вводят по 3 раза, относительное СКО результатов параллельных измерений сигналов нафталина для каждого вводимого объема не должно превышать 5%. В табл.4 приведены данные, полученные для построения градуировочного графика.

Приготовленных объемов растворов для построения градуировочных графиков хватает для проведения построения графиков в течение , по крайней мере, недели.

Табл. 4.

Данньицполученные для построения градуировочного графика

№№ Высота сигнала, мм Вводимый объем, мкл Концентрация нафталина, нг 1 0,50 2,5 0,85 2 1,07 2,5 1,70 3 2,15 2,5 3,40 4 4,32 2,5 6,80 5 8,70 _2А_ 13,60

Типичный градуировочный график для нафталина, полученный при проведении испытаний, приведен на рис. I. Стабильность градуировочной характеристики контролируют не реже, чем через каждые 20 вводов аналитических проб. Хроматограммы,полученные при построении градуировочного графика, приведены на рис.2. Время выхода сигнала нафталина составляет 3,2 мин.

Падвпйиа к определению

Отбор проб

Отбор проб проводят в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов)), утв. №2051 -79 от 21.09.1979г.. Для каждого биологического объекта отбирают 2 параллельных пробы . Для каждой пробы выполняют одну экстракцию.

Подготовка хроматографической колонки

/(?

Условия хроматографирования: Хроматогрф "ЦВЕТ-ПО"

Колонка стеклянная.длина 2м Детектор - ГИД

Неподвижная фаза - 5Z ХЕ на ХЩ кел'-а* -vU/tb (0,125-0,160мм) Температура: термостата

колонки 13ffc, испарителя 160°С детектора 200°С Расход:    азота    60

в мл/мин водорода 30

воздуха 300 Объем вводимой пробы: 2,5мкл ^ Чувст.электрометра,мА    5x10

Хроматографическую колонку промывают, сушат и заполняют адсорбентом. Заполнение производят малыми дозами при легком постукивании но колонке. Для обеспечения плотной упаковки конец колонки присоединяют к вакуумному насосу. Концы заполненной колонки закрывают комочками стекловаты.

Колонку устанавливают в термостат хроматографа, продувают газом-носителем (азотом) при температуре 230°С в течение 6-8 часов. Затем колонку присоединяют к детектору.

После окончания работы каждый день температура термостата колонки должна бьггь повышена до 230°С и колонка должна быть откондиционирована в течение 1 часа при включенном детекторе. После 3-днсвной работы рекомендуется заменить 3-4 см наполнителя с конца колонки, подсоединенного к испарителю.

Условия выполнения измерений

При выполнении измерений необходимо соблюдать следующие условия.

Монтаж, наладку и вывод хроматографа на рабочий режим проводят в соответствии с инструкцией, прилагаемой к прибору.

Для достижения оптимального разделения компонентов смеси, вводимой в хроматограф, допускается изменять условия проведения измерений и состав наполнителя колонки.

Требования к квалификации персонала К работе на газо-жидкостном хроматографе допускается персонал, прошедший соответствующий курс подготовки.

К работе по подготовке проб пищевых продуктов допускается персонал, имеющий навыки работы в химической лаборатории и прошедший обучение работе с аналитическими приборами и посудой.

Проведение определения..,

Образец биологических проб (печень, почки, селезенка, л егкое, сердце, мышечная или жировая ткань и т.п.) измельчают на мясорубке или микроразмельчителе ткани РТ-2, после измельчения пробу тщательно перемешивают, разравнивают и шпателем отбирают из разных мест навеску пробы массой 10 грамм (точность взвешивания 0,02г). Навеску помещают в коническую колбу с притертой пробкой емкостью 250 ^Зсм . Добавляют 20 см³ этилового эфира и проводят экстракцию нафталина путем перемешивания содержимого колбы на магнитной мешалке в течение 1 часа. Эфирный экстракт сливают декантацией в коническую колбу с притертой пробкой емкостью 100 см³, в которую предварительно помешают 40 грамм безводного сульфата натрия. Экстракцию повторяют еще дважды, добавляя к анализируемой пробе по 15 см³ этилового эфира, перемешивают на магнитной мешалке содержимое колбы по 30 минут каждую экстракцию. Экстракты соединяют и концентрируют до объема 10 Ы, удаляя этиловый эфир с помощью водоструйного насоса при

/3

Условия хроматографирования: Хроматограф"ЦВЕТ-110"

Колонка стеклянная,длина 2м Детектор-ПИД Неподв.фаза:5%ХЕ-60 на хроматоне ,V-Jnv-b-UtA Температура: колонки

испарителя детектора Расход в мл/мин: азота

водорода 30 воздуха 300 Объем вводим.пробы 2^5ккл Чувст.электрометра,мА 5x10

/&