Класс токсичности по ВОЗ - Ш.

Гигиенические нормативы для пирипроксифена в России не установлены.

Область применения препарата. Пирипроксифен - инсектицид контактного и кишечного действия из группы аналогов ювенильного гормона, подавляющий эмбриогенез и процесс метаморфоза насекомых. Активно подавляет развитие мух, жуков, комаров и других насекомых.

2. Методика определения пирипроксифена в зелёной массе, огурцах и томатах методом ВЭЖХ

2.1.    Осаовные положения

2.1.1.    Принцип метода

Методика основана на определении пирипроксифена методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью и очистке путем перераспределения между двумя жидкими фазами, а также на колонке с флорненлом.

2.1.2.    Метрологическая характеристика метода Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Объект анализа Предел обнаруже ния miVkt Диапазон определяемых концентраций мг/кг Среднее значение определения,% (для каждого объекта п~24) Относительное стандартное отклонение S, % Доверительны й интервал среднего, п-24, Р-0.95 Зелёная масса 0.02 ~~1 0.02-0.2 87,9 8,61 7,55 Огурцы 0.01 0.01-0.1 90,3 7,84 6,87 Томаты 0.01 0.01-0.1 91,0 8,11 7,10

Полнота определения пирипроксифена в зелёной массе, огурцах и томатах (d«N+1“6 для каждой концентрации)

Таблица 2

Сред» Внесено, мг/кг Найдено, мг/кг Стандартное отклонение, S± Полнота определения, % 1 2 3 4 6 Зелёная масса 0,02 0,01734 1,89-10'J 86,7 0,04 0,03564 3,64-10'J 89,1 0,1 0,0885' 8,22-10"1 88,5 од 0,1746 1,53 10"“ 87,3 Среднее 87,9

Огурцы	0,01	0,00893	8,21-104	89,3
	0,02	0,01794	1,6110-*	89,7
	0,05	0,04545	3,93-10'*	90,9
	0.1	0,0912	7,22-10"*	91,2
Среднее				90,3
Томаты	0,01	0,00935	8,07-104	93,5
	0,02	0,01794	1,59-10'J	89,7
	0,05	0,0444	4,1510'’	88,8
	0,1	0,0919	8,13-10-*	91,9
Среднее				91,0

2.1.3. Избирательность метода.

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и облаете применения, определению не мешает.

2.2.    Реактивы и материалы.

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, ^ИВ-230НМ^И или х.ч., ТУ 6-09-3534-87,

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бндистиллированная, деионизированная, ГОСТ 6709-79.

Дихлорметан, х.ч., ТУ 6-09-3716-80.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77,

Натрий сернокислый безводный, ч„ ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрий хлористый, ч.д.а., ГОСТ 4233-77.

Натрия гидроксид, хч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Пирипроксифен, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9%.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - вода (75:25, по объему).

Стекловата.

Флорисил 150-250 pm (Merck, Германия).

Фосфора лентоксид, ч„ МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент Х°1 для колоночной хроматографии: гексан - хлористый метилен (70:30, по объему). Элюент Хв2 для колоночной хроматографии: гексан - хлористый метилен (60:40, по объему).

2.3.    Приборы и посуда.

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы «Waters» с УФ детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или аналогичный.

Колонка Symmetry - Cl8 (250x4.6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная. Предколонка Waters Symmetry С-18 (250x4.6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA).

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34IQ4-80E или аналогичные.

Установка ультразвуковая «Серьга», ТУ 3.836.008.

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74 или аналогичный. Бидистиллятор.

Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ100 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ100 29/32 и КШ10 14/19 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-250, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100,250 н 1000 см³, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50,100 и 1000 см³, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1,2, 5, 10 см³, ГОСТ 22292-74.

Колонки стеклянные (25x1) см.

2.4.    Отбор проб.

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (Ns 2051-79 от 21.08.79). Пробы растительных материалов хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18°С, Перед проведением анализа пробы огурцов и томатов гомогенизируют в гомогенизаторе.

2.5.    Подготовка к определению.

2.5.1.    Подготовка и очистка реактивов и растворителей.

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г КМл0₄ и 2 г К₂С0₃). Ацетонитрил, х.ч. сушат над пентаксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

2.5.2.    Кондиционирование колонки.

Перед началом анализа колонку Symmetry-Cl 8 кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1-2 часов.

2.53. Приготовление растворов.

Для получения 50%-го водного ацетона в колбе емкостью 1л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры. Для получения 75%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 750 мл ацетона и 250 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры. Для приготовления подвижной фазы смешивают 750 мл ацетонитрила с 250 мл бндистиллированноЙ воды в колбе на 1000 мл, смесь фильтруют, при необходимости дегазируют. Для приготовления элюента №1 в колбе на 1000 мл смешивают 700 мл н-гексана и 300 мл хлористого метилена. Для приготовления элюента №2 в колбе на 1000 мл смешивают 600 мл н-гексана и 400 мл хлористого метилена.

2.5.4. Приготовление стандартного н градуировочных растворов:

Берут точную навеску пирипроксифена (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (Стандартный раствор с концентрацией 1.0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0.1,0.2, 0.5, 1.0 и 2.0

м кг/м л готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил - бндистиллироваиная вода (75:25, по объему).

Растворы пири прокси фен а для внесения в образец при определении полноты извлечения готовят растворением навески пирипроксифена (5 мг) в 100 мл гексана (раствор с концентрацией 50 мкг/мл) с последующим разбавлением полученного раствора гексаном в 50 и 100 раз (растворы внесения с концентрациями 1.0 и 0.5 мкг/мл), используя мерные колбы ёмкостью 50 и 100 мл.

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0-4°С в течение 1 месяца, градуировочные растворы и растворы внесения - в течение суток.

2.5.5. Построение градуировочного графика.

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация пирипроксифена в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади ликов и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации пирипроксифена в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5,6. Подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта.

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 30 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из ваты и вносят суспензию 5 г флорисила в 20 мл элюента №1. Не позволяя просохнуть верхней кромке слоя флорисила на него насыпают слой сернокислого натрия толщиной 10-15 мм. Колонку промывают 40 мл элюента №2, затем 40 мл элюента Xs I со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.7.    Проверка хроматографического поведения пирипроксифена на колонке с флорисилом.

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 1 мл раствора внесения пирипроксифена с концентрацией 1 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 5 мл элюента Хй1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюента №1 и также наносят на колонку. Промывают колонку 50 мл элюента №1, затем 100 мл элюента №2 со скоростью 1-2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3.) и анализируют на содержание пирипроксифена по п. 2.6.4.

Фракции, содержащие пирипроксифен, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2,6.4, Рассчитывают содержание пирипрксифена в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание:    профиль    вымывания    пирипроксифена    может    меняться    при

использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.8.    Подготовка приборов и средств измерения.

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6. Проведение определения.

2.6.1.    Экстракция пирипроксифена из проб зелёной массы, огурцов н томатов.

Гомогенизированные пробы зелёной массы, массой 10 г, огурцов и томатов, массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 100 мл с притертой пробкой, добавляют 50 мл 50%-го водного ацетона (для зеленой массы) или 75%-го водного ацетона и экстрагируют в течение 15 мин на ультразвуковой бане. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще дважды с 50 мл водноацетоновой смеси. Объединенные экстракты упаривают до водного остатка (50-75 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40°С. Очистку экстрактов проводят по пункту 2.6.2.

2.6.2.    Очистки экстрактов.

Объем водного остатка доводят до 100 мл, фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента¹¹, переносят в делительную воронку объемом 250 мл н экстрагируют трижды гексаном порциями по 40 мл, встряхивая каждый раз в течение 2-3 минут и собирая после расслаивания верхний гексановый слой*. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10-15 мл гексана. Полученный раствор выпаривают на роторном испарителе при температуре не выше 40°С досуха. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.3.

* Б случае образования сравнительно стойких эмульсий на стадии экстракции гексаном для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку небольшое количество (до 5 мл) этилового спирта.

2.6*3. Очистка на колонке с флорненлом

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п.п. 2.6.1, и 2.6.2. экстрактов растительного материала, растворяют в 5 мл элюента №1 и количественно переносят в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.6.). Колбу обмывают еще 5 мл элюента №1. Промывают колонку 50 мл элюента №1, которые отбрасывают. Пирипроксифен элюируют 80 мл элюента №2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40°С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.4* Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы «Waters» с УФ детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Колонка Symmetry -Cl8 (250x4.6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA).

Температура колонки 30±1°С.

Предколонка Waters Symmetry С-18 (20x3.9) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) для защиты аналитической колонки.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода в соотношении 75:25 (по объему).

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Рабочая длина волны 272 нм.

Объем вводимой пробы 50 мкл.

Время удерживания пирипроксифена 10.3 ± 0.1 мин.

Линейный диапазон детектирования 0.1 -2.00 мкг/мл.

Л8

2.6.6. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание пирипроксифена в образце воды, почвы или растительных материалов (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

SjxCxV

X--

SixP

где Si- площадь пика пирипроксифена в стандартном растворе, ед.адс.хс;

Sj- площадь пика пирипроксифена в анализируемой пробе, ед.адс.хс;

V - объ£м пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;

Р - навеска анализируемого образца, г (для воды - объем, мл);

С - концентрация стандартного раствора пирипроксифена, мкгЛал.

Содержание остаточных количеств пирипроксифена в анализируемом образце вычисляют, как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор пирипроксифена 2 мкг/мл разбавляют.

3.    Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции «Основные правила безопасной работы в химической лаборатории», общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и электрооборудования до 400 В.

4.    Контроль погрешности измерений.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

5.    Разработчики

Юзихин О.С., Короткова Н.В., Цибульская И.А., Долженко В.И.

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.

АЗ