2. Биологическая характеристика В. subtilis 65 и его гигиенический норматив

Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных средах. Оптимальная температура роста 37 °С, оптимальная pH 6,6—7,2, культивирование 18—24 часа. Для размножения используется мясо-пептонная агаризованная среда (МПА) с глюкозой (1 %). Систематическое положение микроорганизма

Schizomycetes

Eubacteriales

Bacillaceae

Bacillus

subtilis

65

На МПА штамм образует небольшие округлые колонии, максимальный диаметр которых составляет 0,5—0,7 см. Край колоний изрезанный, с характерным белым налетом в центральной верхней части. Колонии гладкие, плоские, матовые, сухие. Не врастают в агар и легко отделяются от него. Цвет от слабо кремового до желтоватого.

Морфологически штамм представлен подвижными мелкими палочками, образующими центрально расположенные эндоспоры, располагаются поодиночке или цепочками различной длины. Палочки снабжены жгутиками, расположенными перитрихиально.

В. subtilis 65 строгий аэроб, сапрофит, мезофил, грам-положителен. Штамм интенсивно разлагает белковые среды благодаря действию протеолитических энзимов, при этом, на желатине происходит разжижение, на среде лакмус-молоко - пощелочение, пептонизация. Чувствителен к целому ряду антибиотиков, устойчив к ампицилину.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе рабочей зоны - 4 ООО кл/м\ пометка А.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток микроорганизма в атмосферном воздухе в диапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

24

МУК 4.2.1769—03

4. Метод измерений

Прямой метод основан на аспирации из воздуха клеток микроорганизма на агаризованную среду МПА с глюкозой (1 %) и подсчета количества выросших колоний по типичным культуральноморфологическим признакам.

Косвенный метод основан на аспирации из воздуха клеток микроорганизма на поверхность плотной питательной среды (молочный агар Эйкмана) и подсчета прозрачных зон, образующихся вокруг выросших колоний и четко выделяющихся на общем молочно-мутном фоне среды через 18—24 часа.

При данном методе на одной чашке Петри после забора пробы может быть учтено не более 50 колоний т. к. большее количество колоний на чашке образуют сливающиеся зоны пептонизации молочного белка казеина.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова)    ТУ 64-12791 —77

Термостаты электрические суховоздушные или водяные

Автоклав электрический    ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами Холодильник бытовой

Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200 Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211

Лупа с увеличением х 10    ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100 мм Пробирки биологические, вместимостью

20 и 35 мл    ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1,5, и 10 мл    ГОСТ    1770—74

Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74 Секундомер    ГОСТ 9586-75

25

W - объем экстракта, подготовленного для хрома парафирования, мл;

V - объем пробы воздуха, отобранный для анализа, приведенный к стандартным условиям (давление 760 мм рт.ст., температура 20 ° С), дм ^J.

V* 0,386 *Р* ut/(273+T). где Т - температура воздуха при отборе пробы (на входе в аспиратор). град.С,

Р *• атмосферное давление при отборе пробы, мм рт.ст. и - расход воздуха при отборе пробы, дм/.мин, t - длительность отбора пробы, мин.

3. ТРЕБОВАНИЯ ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ

Необходимо соблюдать требования безопасности при работе в химических лабораториях в соответствии с “Правилами устройства, техники безопасности, производственной санитарии, нротивоэпидемиолопгческого режима и личной гигиены при работе в лечебных и санитарно-эпидемиологических учреждениях системы М3 СССР” (N 2455-81 от 20.10.81 г.), а также требования, изложенные в документации на приборы.

4.    Контроль uni рсшкост и измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

5.    Разработ чики

Юдина T.B., Федорова Н.Е.. Волкова В.Н., Волчек С И. (Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрнсмана Минздрава России, г. Мытищи Московской обл.)

УТВЕРЖДАЮ

Г лавный государственный санитарный врач

терапии.

Первый    здравоохранения

терапии Г.Г Онншенко

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ по измерению концентраций крезоксим-мстила в воздухе рабочей зоны и атмосферном воздухе населенных мест методами газожидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии

1. ВВОДНАЯ ЧАСТЬ

Фирма производитель: БАСФ (Германия)

I орговос название: СТРОКИ Действующее вещество: крезоксим-метил

(С)-Метил-2-мегок'сиимино-2-(2-(о-толилоксиметил)фенил|ацетат (IUPAC)

Эмпирическая формула: CHH19NO4 Молекулярная масса: 313.3

Кристаллическое вещество белого цвета со слабым ароматным запахом Температура плавления: 101,6- 102,5° С Давление паров при 20° С : 2,3* 10° мПа

Растворимость в органических растворителях при 20°С (г/дм³): ацетон - 217; метанол - 14.9; дихлорметон - 939; этил ацетат - 123; толуол - 111; н-гептан - 1.7. Рас творимое ть в воде - 0,002 мг/дм³.

Может присутствовать в воздухе в виде аэрозоля.

lie

Краткая токсиколо! ическлм характеристика:

Острая пероральная токсичность:

1 .Г) 5о крысы - более 5000 мг/кг,

Ос грая дермальная токсичность:

LD50 крысы - более 2000 мг/кг;

Нс оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз, не обладает сенсибилизирующим действием.

Рекомендуемые гигиенические нормативы:

ОБУВ в воздухе рабочей зоны - I мг/м³ ОБУВ в атмосферном воздухе - 0,1 мг/м³ ПДК в воде водоемов - 0,01 мг/дм³ ОДК в почве - 0,2 мг/кг

Область применения препарата

Крезоксим-мстнл - синтетический фунгицид из класса стробилуриыов, эффективен против широкого круга грибных патогенов хлебных злаков, овощных, кормовых, технических и плодовых культур. Обладает защитным, лечебным и искореняющим действием.

Проходит регистрационные испытания в России и странах СНГ под торговым названием Строби, 500 ВДГ (500 г/кг) с нормой расхода 140 - 320 г/га при трехкратной обработке (по розовому бутону, после опадения 75% лепестков и по мелким плодам).

2. МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИЙ КРЕЗОКСИМ-МЕТИЛА В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ И АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ МЕТОДАМИ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ И ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

2.1.    Основные положения

2.1.1.    Принцип методики

Методика основана на определении крезоксим-метила метолом газожидкостной хроматофафии (ГЖХ) с детектором постоянной скорости рекомбинации ионов или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором.

Отбор проб воздуха осуществляется концентрированием аэрозоля на бумажные фильтры "синяя лента”. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2.    Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии компонентов препаративной формы.

2.1.3.    Метрологическая характеристика метода (Р = 0,95)

Число параллельных определений - 6

Предел обнаружения в хроматографируемом объеме - 0,! нг (измерение но и.

2.7.1., 1*ЖХ) и 2 иг (измерение по п. 2.7.2., ВЭЖХ).

Предел обнаружения в воздухе (при озборс 10 дм³) - 0,05 мг/м ³ Диапазон определяемых концентраций: 0,05 - 0,5 мг/м³ (при отборе 10 лм³); 0.1 - 1,0 мг/м³ (при отборе 5 дм³)

Среднее значение определения - 97%.

Стандартное отклонение (S) - 4,72% (ГЖХ). 2,50% (ВЭЖХ).

Относительное стандартное отклонение (DS) - 1.93% (1ЭКХ), 1,02% (ВЭЖХ), Доверительный интервал среднего - ± 4,96(ГЖХ), ± 2,62% (ВЭЖХ).

Суммарная погрешность измерения не превышает 16% (ГЖХ), 12% (ВЭЖХ).

2.2. Реактивы, растворы и материалы

Крсзоксим-мстил с содержанием д.в. 99,9%, (БАСФ, Германия)

Азот особой чистоты, из баллона. ГОСТ 9293-79 Ацетонитрил для хроматографии, хч. ТУ 6-09-4326-76 Вода бидистиллиропанная или деионизованная н-Г'ексан, хч, ТУ 6-09-4521-77 Кислота орто-фосфорная , хч, ГОСТ 6552-80 Метиловый спирт, хч, ГОСТ 6995-77 Толуол ч.д.а., ГОСТ 5789-78

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч, ГОСТ 22300-76 Хрома гои-Супер с 5% OV-17 (0,16 -0.20 мм)

Бумажные фильтры “синяя лента”, предварительно промытые последовательно этанолом, затем эти л ацетатом. Стекловата Фнльтродержатели

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

Газовый хроматограф “Цвет” или аналогичный, снабженный детектором постоянной скорости рекомбинации ионов (ДПР) с пределом детектирования по линдаиу 4 х 10 ¹⁴ г/см³

Хроматографическая колонка стеклянная, длиной 1 м, внутренним диамсгром 3

мм

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором фирмы Perkin-Elmer (США) или аналогичный

Хроматографическая колонка стальная, ^длиной 25 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Zorbax ODS. зернением 5 мкм.

Микрошприн гнпа МНИМ , ТУ 2.833.105, вместимостью 1 мкл Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 -100 мкл

Аспирационное устройство типа ЭА-1.ТУ 25-11-1414-78, или аналогичное Барометр, ТУ 2504-1797-75.

Весы аналитические т ипа ВЛА-200, ГОСТ 34104-80!*

Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М, ТУ 25-11-917-76 или аналогичный Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2, цена деления 1 ⁰ С, пределы измерения 0-55° С, Г ОСТ 215-73Е

Воронки химические, конусные, диаметром 34-40 мм. ГОСТ2533682 Е Колбы грушевидные со шлифом, ГОСТ 10394-72, вместимостью 100 мл. Колбы мерные, ГОСТ 1770-74. вместимостью 50 и 100 мл.

Пипетки, 1’ОСТ 20292-74, вместимостью 1,2 и 5 мл.

Цилиндры мерные, ГОСТ 1770-74Е, вместимостью 10. 50 и 250 мл.

Пробирки центрифужные. Г ОСТ 25336-82Е Ректификационная стационарная установка РУТ, ТУ 25-11-1103-75 Стаканы химические, ГОС 1 25336-82Е, вместимостью 100 мл

Ji9

Груша резиновая

Стеклянные палочки

Установка для перегонки растворителей при атмосферном давлении

Фильтродсржатсли

2.4.Отбор проб

Отбор проб воздуха рабочей зоны следует осуществлять в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 “ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей тоны” или ГОСТ 17.2.4.02-81 “ОПА. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ в воздухе населенных мест”.

Воздух с объемным расходом 1- 4 дм³/мип асиирируюг через фильтр ‘‘синяя лен га”, помещенный в фильтродержатсль.

Для измерения 0,5 рекомендуемого ОБУВ в воздухе рабочей зоны следует отобрать 1 дм³ воздуха; 0,8 ОБУВ в атмосферном воздухе - 7 дм³.

Фильтры с отобранными пробами, упакованные в полиэтиленовые пакеты, можно хранить в холодильнике при температуре 4-6° С в течение 20-ти дней.

2.5. Подготовка к* определению

2.5.1.    Подготовка органических раствори гелей

2.5.1.1.    Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пснтоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

2.5.1.2.    Очистка этплацетага

Этил ацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют.

Необходимую чистоту растворителя можно достичь перегонкой коммерческого этилацетата на ректификационной колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

2.5.1.3.Очистка толуола

Толуол выдерживают нал безводным хлористым кальцием и перегоняют перед употреблением , отбрасывая предгон обьемом 10 - 15% от исходного.

2.5.2.    Метол I ЖХ. Подготовка и конлицноинрованне колонки

Готовую насадку (5% OV-17 на Хроматоне-супср, 0,16 - 0,20 мм) засыпают в стеклянную колонку, иредваритсльпо промытую последовательно этиловым спиртом, ацетоном и гексаном, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостате хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 260 °С в течение 10-12 часов.

2.5.3.    Метод ВЭЖХ

2.5.3Л.Подготовка подвижной фаты дли ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 50 мл метилового спирта, 350 мл    бидистиллированной воды, 0.5 мл o/w/о-фосфорной кислоты и 600 мл

ацетонитрила, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

2.5.3.2. Кондиционирование колонки

Промывают колонку для ВЭЖХ смесью ацетонитрил - метанол - оопа-орто-фосфорная кислота, (60 : 5 : 35 : 0,05, по объему) в течение 30 - 45 мин при скорости подачи растворителя 1 мл/мин до получения стабильной базовой липни.

2.5.4.    Приготовление стандартных растворов

Стандартный раствор крезоксим-метила с содержанием 1 мг/мл готовят растворением 0.0500 г вещества в толуоле (измерение по п. 2.7.1., ГЖХ) или ацетонитриле (измерение по п п. 2.7.2., ВЭЖХ) в мерной колбе на 50 мл. Раствор хранится в холодильнике в течение 3-х месяцев.

Для приготовления стандартного раствора крезоксим-метила с содержанием 10 мкг/мл в мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1 мл основного стандартного раствора (1 мг/мл). доводят объем до метки толуолом (измерение по п. 2.1 Л.. ГЖХ) или ацетонитрилом (измерение по п и. 2.7.2., ВЭЖХ). Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрацией 0.1; 0.2; 0.3; 0,5 и 1,0 мкт/мл готовят путем последовательного разбавления раствора, содержащего 10 мкг/мл крезоксим-метила в толуоле или ацетонитриле, толуолом (измерение по и. 2.7.1., ГЖХ) или подвижной фазой для ВЭЖХ (измерение по п п. 2.7.2., ВЭЖХ). Растворы хранятся в холодильнике в течение 3-х дней.

w

2.5.5. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика в инжектор хроматографа вводят по 1мкл (ГЖХ) или 20 мкл (ВЭЖХ) рабочих стандартных растворов крезоксим-мстила с концентрацией ОД; 0,2; 0,3; 0,5 и 1,0 мкг/мл.

Осуществляют не менее 5 параллельных измерений. Находят среднее значение высоты (ГЖХ) или площади (ВЭЖХ) хроматографического пика для каждой концентрации. Сгроят градуировочный график (А или Б) зависимости высоты или площади хроматографического пика (в мм или относительных единицах, соответственно) от концентрации крезоксим-метнла в растворе (в мкг/мл).

2.(».Описание определении

Фильтр с отобранной пробой переносят в химический стакан вместимостью 100 мл, заливают 10 мл этилацетата, оставляют на 5-7 минут, периодически перемешивая. Растворитель сливают, отжимая фильтр стеклянной палочкой. Фильтр еще дважды обрабатывают новыми порциями этилацетата объемом 10 мл.

Объединенный экстракт уааривакгг в грушевидной колбе на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани 40 -45° С почти досуха, оставшийся расгворитель отдувают потоком теплого воздуха, остаток растеряют в 5 мл этилацетата (измерение но п. 2.7.1., ГЖХ) или подвижной фазы для ВЭЖХ (измерение по п. 2.7.2., ВЭЖХ ), центрифугируют или фильтруют через слой стекловаты, помещенный в конусную химическую воронку, и хроматографируют.

2.7.УСЛОВИЯ хроматографировании

2.7.1. ГЖХ

Хроматограф газовый “Цвет-560” с детектором постоянной скорости рекомбинации ионов

Колонка стеклянная длиной 1 м, внутренним диаметром 3 мм. заполненная 5% ОV-17 на Хрома гоне-супср (0.16 - 0,20 мм)

Рабочая шкала электрометра 64*10 ¹⁰ ом

Скорость движения ленты самописца 240 мм/час

Температура термостата колонки - 240° С

детектора - 320°С испарителя -270°С Скорость газа-носи геля (азота) - 30 ± 2 мл/мин Объем вводимой пробы -1 мкл Время выхода крезоксим-метила - 3 мин 50 сек Линейный диапазон детектирования: 0,1-1 иг

Образцы, дающие пики, большие, чем стандартный раствор с концентрацией 1 мкг/мл, разбавляют эти лацет атом.

2.7.2. ВЭЖХ

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором фирмы Pcrkin-Elmer (США)

Хроматографическая колонка стальная, длиной 25 см, внут])сш!им диаметром 4 мм, содержащая Zorbax ODS, зернением 5 мкм Тем пехтура колонки: комнатная

Подвижная фаза: ацетонитрил - метанол - вода - о/>л?о-фосфорная кислота (60 : 5 : 35 : 0,05, но объему)

Скорость потока элюента: 1 мл/мин

Рабочая длина волны: 236 нм

Чувс твительность: 0,005 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы: 20 мкл

Время выхода крезоксим-мстила: 6.49 - 6,52 мин

Линейный диапазон детектирования: 2 - 20 иг

Образцы, дающие пики, большие, чем стандартный раствор с копнен грацией 1,0 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

2.8. Обработка результатов анализа

Содержание крезоксим-мстила рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

X - С * W/V , где X - содержание крезоксим-метила в пробе воздуха, мг/мЗ;

С - концентрация крезоксим-метила в хроматографируемом растворе, найденная по градуировочному графику, мкг/мл;