Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств пестицидов в пищевых продуктах, сельскохозяйственном сырье и объектах окружающей среды

Сборник методических указаний

Выпуск 2 Часть 5 МУК 4.1.1229—4Л.1233—03

Издание официальное

Москва • 2006

МУК 4.1.1232—03

УТВЕРЖДАЮ Главный государственный санитарный врач Российской Федерации,

Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации Г. Г. Онищенко

16 марта 2003 г.

Дата введения: 1 июля 2003 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств трифлоксистробииа в воде, почве, яблоках и его метаболита ЦГА 321113 в воде н почве газохроматографическим методом

Методические указания МУК 4.1.1232—03

1. Вводная часть

Фирма производитель: Сингента (Швейцария).

Торговое название: ЗАТО, ФЛИНТ.

Действующее вещество: трифлоксистробин (ЦГА 279202). (Е.Е)-метоксиимино- {2-[ 1 -(З-трифторметилфенил)-этилиденамино-оксиметил]-фенил}уксусноЙ кислоты метиловый эфир (ИЮПАК). Структурная формула:

Эмпирическая формула: C20H19F3N2O4.

Молекулярная масса: 408,4.

Белый порошок без запаха.

Температура плавления: 72,9 °С.

Давление паров при 25 °С: 3,4 х Ю’⁶ Па.

Растворимость (г/л) при 25 °С: вода - 0,0006, гексан - И, толуол -500, дихлорметан - 500, метанол - 76, ацетон - 500, этилацетат - 500.

Стабильность к гидролизу при 20 °С: DT₅₀ = 3 139 дней (pH 5), 80,1 дня (pH 7), 1,1 дня (pH 9).

27

вода (2 : 1, по объему) и помещают в ультразвуковую баню на 5 мин. К суспензии добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Осадок на фильтре промывают 50 мл смеси ацетон-вода (2 : 1, по объему). Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (около 27 мл), эквивалентную 5 г почвы, и упаривают ее до водной фазы на роторном вакуумном испарителе при температуре 40 °С. Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 15 мл бидистиллированной воды и 15 мл гексана. Смесь встряхивают в течение 1 мин и после ее расслоения отделяют гексановую фракцию, которую пропускают через стеклянный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия, в грушевидную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию водной фракции гексаном повторяют еще два раза (по 15 мл). Объединенный гексановый экстракт, содержащий трифлоксистробин, выпаривают на роторном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 2.6.3.

Оставшуюся после обработки гексаном водную фазу подкисляют 1 н НС1 до pH 2 и переносят в делительную воронку емкостью 100 мл. Приливают 10 мл хлористого метилена и воронку встряхивают в течение 1 мин. После разделения слоев отделяют дихлорметановую фракцию, которую пропускают через стеклянный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия, в грушевидную колбу вместимостью 20 мл. Экстракцию водной фракции хлористым метиленом повторяют еще два раза (10 + 10 мл). Объединенный дихлорметановый экстракт, содержащий метаболит ЦГА321113 , выпаривают на роторном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п.п. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.2. Метилирование

К сухим остаткам водного (из п. 2.6.1.1) и почвенного (из п. 2.6.1.3) экстрактов, содержащим метаболит ЦТ А 321113, приливают соответственно 2 и 3 мл эфирного раствора диазометана (из п. 2.5.5), перемешивают, закрывают колбочки пробками и оставляют стоять в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем растворы упаривают досуха током воздуха.

2.6.3. Очистка на колонке с силикагелем

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов воды, растительного материала и почвы (из п.п. 2.6.1.1, 2.6.1.2 и 2.6.1.3) или метилированных по п. 2.6.2 экстрактов воды и почвы, количественно переносят тремя 1-мл порциями элюента № 1 в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Промывают колонку 40 мл элюента

36

МУК 4.1.1232—03

№ 1, которые отбрасывают. Трифлоксистробин элюируют 60 мл элюен-та № 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Сухие остатки экстрактов воды, почвы и яблок растворяют в 2 мл толуола и анализируют по п. 2.7.

2.7. Условия хроматографирования Газовый хроматограф Тгасог 570 (США) с

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю высоту пика.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,25 мкг/мл, разбавляют толуолом.

2.8. Обработка результатов анализа

Содержание трифлоксистробина рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

, где

X - содержание трифлоксистробина в пробе, мг/кг или мг/дм³;

Н, ~ высота пика образца, мм;

Н₀ — высота пика стандарта, мм;

А - концентрация стандартного раствора трифлоксистробина, мкг/мл;

37

V- объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

т - объем или масса анализируемой части образца, мл или г (для воды - 100 мл; для яблок - 2,5 г; для почвы - 5 г).

Содержание метаболита ЦТ А 321113 рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

_v Hi А V X = —!-, где

Но ' пг К

X- содержание ЦГА 321113 в пробе, мг/кг или мг/дм³;

Н, - высота пика образца, мм;

Н₀ - высота пика стандарта, мм;

Л - концентрация стандартного раствора трифлоксистробина, мкг/мл;

К- объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

т ~ объем (мл) или масса (г) анализируемой части образца (для воды - 100 мл; для почвы - 5 г).

К - коэффициент пересчета, учитывающий соотношение молекулярных масс трифлоксистробина и ЦГА 321113, равный 1,035.

3.    Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.

4.    Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335—95 «ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа».

5. Разработчики

Павлова Н. Н., н. с., канд. биол. н.; Талапакина Т. Н., н. с., Чкани-кова Е. В., н. с., канд. мед. н.; Макеев А. М., зав. лаб., канд. биол. н. ВНИИ фитопатологии, 143050 Московская обл., п/о Большие Вяземы.

38

В биологически активных почвах в анаэробных условиях трифлок-систробин быстро разрушается: DTjo <1,1 дня, DT90 = 2—3 дня.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LDjo) для крыс - более 5 ООО мг/кг; острая дермальная токсичность (LD50) для крыс - более 2 ООО мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC50) для крыс - более 4 646 мг/м³. Трифлоксистробин не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика, не обладает мутагенными и сенсибилизирующими свойствами.

Трифлоксистробин токсичен для дафний, рыб и водорослей в лабораторном эксперименте.

Гигиенические нормативы:

ПДК в воде водоемов - 0,03 мг/дм³;

ОДК в почве - 0,2 мг/кг;

МДУ в яблоках и грушах - 0,! мг/кг.

Основной метаболит трифлоксистробина: ЦТ А 321113.

(Е,Е)-метоксиимино- {2-[ 1 -(3-трифторметилфенил) этилиденамино-оксиметил]-фенил}уксусная кислота (ИЮПАК).

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C19H17F3N2O4.

Молекулярная масса: 394,4.

Белый порошок без запаха.

Другие физико-химические и токсикологические характеристики основного метаболита трифлоксистробина отсутствуют.

В биологически активных почвах в аэробных условиях метаболит ЦГА 321113 достаточно стабилен: DT50 - 110 дней, DT90 = 279 дней.

Область применения препарата. Трифлоксистробин - синтетический фунгицид из класса стробилуринов, являющихся продуцентами гриба Strobilurus tenacellus. Вещество эффективно против широкого круга грибных патогенов хлебных злаков, овощных, кормовых, технических и плодовых культур. Обладает защитным и лечебно-профилактическим действием.

Проходит регистрационные испытания в России и странах СНГ под торговым названием Зато, ВДГ (500 г/кг) в яблоневых и грушевых

МУК 4.1.1232—03

садах в качестве средства борьбы с возбудителями мучнистой росы, парши, пятнистостей и болезней при хранении с нормой расхода препарата 0,10—0,15 кг/га при 4—6-кратной обработке (до и после цветения) за сезон с 10—14-дневными интервалами.

Трифлоксистробин весьма лабильное вещество и при попадании в воду или почву достаточно быстро гидролизуется с образованием довольно устойчивого соединения - (Е,Е)-метоксиимино-{2-[1-(3-три-фторметилфенил)-этилиденамино-оксиметил]фенил}-уксусной кислоты (ЦТА 321113). В яблоках трифлоксистробин разрушается слабо.

2. Методика определения остаточных количеств трнфлоксистробина в воде, почве, яблоках и его метаболита ЦТ А 321113 в воде и почве газохроматографическим методом

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип методики Методика основана на газохроматографическом определении трнфлоксистробина и его метаболита ЦТ А 321113 (в виде метилового эфира) на неподвижной фазе OV-17 с использованием электронзахват-ного детектора (ДЭЗ) после экстракции препарата из воды гексаном, из почвы и яблок водным ацетоном, а метаболита из подкисленной воды хлористым метиленом и из почвы водным ацетоном при ультразвуковой обработке, предварительной очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, метилирования метаболита диазометаном до трнфлоксистробина и окончательной очистки экстрактов на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Избирательность метода В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при возделывании яблоневых садов.

29

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

2.2, Реактивы у растворы, материалы

Трифлокси строб ин, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9 % (Новартис,

Швейцария)

ЦТ А 321113, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,0 % (Новартис,

Швейцария)

Ацетон, чда

Вода бидистиллированная Г ексан,ч

Калия перманганат Калий углекислый, хч Кальция хлорид Кислота серная, хч Кислота хлористоводородная, хч Натрия гидроксид, хч Натрия сульфат безводный, хч Натрий двууглекислый, хч Натрия хлорид, хч N-Memn-N-нитрозо-п-толуолсульфонамид (Мерк, Германия)

или N-нитрозометилмочевина    ТУ 6-09-11-1643—82

Спирт метиловый, хч    ГОСТ 6995-77

Воронки делительные, вместимостью 100, 250 и 500 мл

Воронки для фильтрования стеклянные Колба Бунзена

Колбы круглодонные на шлифе, вместимостью 100,250 и 500 мл Колбы конические с притертыми пробками, вместимостью 250 мл Колбы мерные, вместимостью 25, 50,100 мл Колбы грушевидные, вместимостью 20,100 мл Пипетки мерные, вместимостью 1,2,5 и 10 мл Пробирки градуированные с притертыми пробками, вместимостью 5 и 10 мл Цилиндры мерные, вместимостью 25, 50, 100, 250 и 500 мл

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы почвы и яблок хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более трех дней. Для длительного хранения пробы почвы доводят до воздушно-сухого состояния и хранят в холодильнике; пробы яблок хранят до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С. Пробы воды хранят при температуре не выше 4 °С в течение 3 дней, при температуре -18 °С в течение месяца.

Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, а яблоки измельчают.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем гексан последовательно промывают водой, 2 %-м раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Этилацетат промывают равным объемом 5 %-го раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

32

МУК 4.1.1232—03

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г КМп0₄ и 2 г К₂С0₃).

Диэтиловый эфир (1 л) предварительно встряхивают с 20 мл свежеприготовленного раствора железного купороса (30 г сульфата железа в 50 мл воды с добавлением 1,5 г концентрированной серной кислоты). Затем диэтиловый эфир последовательно промывают 0,5 %-м раствором перманганата калия, 5 %-м раствором гидроксида натрия и водой, после чего сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

2.5.2.    Подготовка и кондиционирование колонки Готовую насадку /3 % OV-17 на Хромосорбе W(HP)/ засыпают в

стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 250 °С в течение 8—10 ч.

2.5.3.    Приготовление стандартных растворов Основной стандартный раствор трифлоксистробина с содержанием

100мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 99,9 % д.в., в толуоле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,025; 0,05; 0,125 и 0,25 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора трифлоксистробина соответствующим последовательным разбавлением толуолом. Рабочие растворы хранят в холодильнике не более 3 дней.

При изучении полноты открывания трифлоксистробина в модельных матрицах используются ацетоновые растворы вещества.

Основной стандартный раствор метаболита ЦГА 321113 с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 99.0 % д.в., в ацетоне в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.

Из основной) стандартного раствора метаболита готовят разбавлением ацетоном рабочие растворы с концентрациями 0,1; 0,5 и 2,5 мкг/мл, которые хранят в холодильнике не более 3 дней. Рабочие растворы используются при изучении полноты открывания метаболита в воде и почве. При расчете количества вводимого в матрицу метаболита учитывают соотношение молекулярных масс ЦГА 321113 и трифлоксистробина.

2.5.4. Построение калибровочного графика Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 2 мкл рабочего стандартного раствора трифлоксистробина с концентрацией 0,025, 0,05, 0,125 и 0,25 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хрома-

33

тографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации трифлоксистробина в растворе в мкг/мл.

2.5.5. Приготовление раствора диазометана в эфире В круглодонной колбе на 100 мл растворяют 5 г N-Meran-N-нитрозо-п-толуолсульфонамида в 16 мл смеси диэтилового эфира и метанола (1 : 1). Колбу присоединяют к холодильнику, нижний конец которого снабжен алонжем с отводом, проходящим через резиновую пробку с отводом и погруженным в слой эфира (40 мл) на дне приемника. Приемник охлаждают смесью льда и соли. В капельницу помещают 15 мл 50 %-го раствора едкого калия.

Реакцию начинают добавлением в реакционный сосуд раствора едкого калия по каплям, избегая бурного вскипания реакционной массы. Об окончании реакции судят по прекращению выделения диазометана в диэтиловый эфир.

2.5.6. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1,2 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и приливают около 10 мл гексана. Затем в колонку вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают последовательно 50 мл элюента № 2 и 30 мл элюента № 1 со скоростью 1—2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.7. Проверка хроматографического поведения трифлоксистробина на колонке с силикагелем В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора трифлоксистробина с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл элюента № I и наносят на колонку. Промывают колонку 50 мл элюента № 1, затем 70 мл элюента № 2 со скоростью 1—2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл толуола и анализируют на содержание трифлоксистробина по п. 2.7.

Фракции, содержащие трифлоксистробин, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 4 мл толуола и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание трифлоксистробина в элюате, определяют полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание. Профиль вымывания трифлоксистробина может меняться при использовании новой порции сорбента и растворителей.

34

МУК 4.1.1232—03

2.6. Описание определения

2.6.1. Экстракция трифлоксистробина и метаболита ЦГ4 321113 и очистка экстракта

2.6.1.1.    Вода. В делительную воронку емкостью 250 мл помещают 100 мл предварительно отфильтрованной воды. Добавляют 20 мл гексана и встряхивают 1 мин. Верхний органический слой отделяют, собирая в грушевидную колбу на 100 мл. Водную фазу экстрагируют гексаном еще дважды порциями по 20 мл. Объединенную органическую фазу пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают на роторном вакуумном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 2.6.3.

Водную фазу, оставшуюся после экстракции гексаном, переносят в делительную воронку емкостью 250 мл, подкисляют 1 н НС1 до pH 2 и трижды экстрагируют хлористым метиленом порциями по 20 мл. Объединенную органическую фазу, содержащую метаболит трифлоксистробина, пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают небольшими порциями в 20-мл грушевидной колбе на роторном вакуумном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п.п. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.1.2.    Яблоки. К навеске (25 г) измельченного материала добавляют 100 мл смеси ацетон-вода (2:1, по объему), гомогенизируют 3 мин при 10 000 об./мин и суспензию перемешивают в течение 20 мин на аппарате для встряхивания. Добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу на 250 мл. Осадок на фильтре промывают 50 мл смеси ацетон-вода (2 : I, по объему). Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (около 15 мл), эквивалентную 2,5 г растительного материала, и упаривают ее до водной фазы на роторном вакуумном испарителе при температуре 40 °С. Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 10 мл насыщенного раствора хлорида натрия и 15 мл гексана. Смесь встряхивают в течение 1 мин и после ее расслоения отделяют гексановый слой, который пропускают через стеклянный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия, в грушевидную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию водной фракции гексаном повторяют еще два раза (по 15 мл). Объединенный гексановый экстракт, содержащий трифлоксистробин, выпаривают на роторном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 2.6.3.

2.6.1.3.    Почва. Навеску (25 г) воздушно-сухой почвы помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл смеси ацетон-

35