ИНФОРМАЦИОННО-ИЗДАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ГОСКОМСАН-ЭПИДНАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ИЗМЕРЕНИЮ КОНЦЕНТРАЦИЙ ВРЕДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
Выпуск 23/1
УТВЕРЖДЕНО Заместителем Главного государственного санитарного врача СССР А.И.Заиченко ”12” декабря 1988г.
N 4802-88
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ по фотометрическому измерению концентраций липазы микробной в воздухе рабочей зоны
Липаза микробная является ферментным препаратом, предназначенным для расщепления жиров, применяется в медицине, в меховой, кожевенной промышленности, в животноводстве, и других отраслях народного хозяйства.
Липаза микробная — мелкий порошок светло-коричневого цвета и легким дрожжевым запахом, растворим в воде, в солевых растворах (в частности, фосфатном буфере), не растворим в большинстве органических растворителях.
В воздухе находится в виде аэрозоля.
Ферментный препарат липаза микробная раздражает слизистые оболочки верхних дыхательных путей и легких, обладает аллергенным действием.
ПДК в воздухе 1 мг/м^.
Характеристика метода
Метод основан на фотометрическом определении цветного комплекса меди, образуемого свободными жирными кислотами, которые выделяются в результате гидролитического действия липазы, с диэтилдитиокарбаматом.
Отбор проб производится с концентрированием на фильтр.
101
Нижний предел измерения содержания жирной кислоты 1 мкг/мл в фотометрируемом растворе.
Нижний предел измерения липазы в воздухе 0,3 мг/м^ (при отборе 4 л воздуха).
Диапазон измеряемых концентраций липазы в воздухе от 0,3 до 3,7 мг/м^.
Измерению не мешают белковые вещества и фосфорнокислые соли.
Суммарная погрешность измерения не превышает 25%.
Время выполнения измерения, включая отбор проб, 1 час 30 мин.
Приборы, аппаратура, посуда
Спектрофотометр.
Аспирационное устройство.
Фильтродержатели, ТУ 95.72.05-77. pH-метр типа ионометра ЭВ-74.
Размельчитель тканей РТ-2, ТУ 64-1-1305-79.
Аппарат инактивации сыворотки АИС, ТУ 64-1-1091-77 или лабораторная водяная баня.
Колбы конические, ГОСТ 10394-72, вместимостью 1000 мл. Бюретка, ГОСТ 20292-74, вместимостью 25 мл.
Мерные колбы, ГОСТ 1770-74, вместимостью от 25 до 1000 мм. Пипетки, ГОСТ 20292-74, вместимостью 1 и 5 мл.
Цилиндры мерные, ГОСТ 1770-74, вместимостью 100 мл.
Бюксы, ГОСТ 25336-82, вместимостью 2-5 мл.
Пробирки с пришлифованными пробками, ГОСТ 10515-75, вместимостью 15 мл.
Стаканы химические, ГОСТ 25336-82, вместимостью 50; 100; 250 мл.
Реактивы, растворы и материалы
Липаза микробная.
Оливковое масло, ГОСТ 7580-55.
102
Спирт поливиниловый (ПВСО, ТУ 64-5-51-79, 2% водный р-р.
Натрий фосфорнокислый двухзамещенный, ГОСТ 4172-76, 1/15 М раствор (А).
Калий фосфорнокислый однозамещенный, ГОСТ 4198-75, 1/15 М раствор (Б).
Фосфатный буфер, 1/15 М раствор с pH 7,8. Готовят смешиванием растворов А и Б в соотношении 91,5 : 8,5. Величину pH проверяют на рН-метре.
Хлороформ, ГОСТ 215-74, хч.
Гептан, ГОСТ 5.395-78, хч.
Раствор экстракционный: готовят путем смешивания хлороформа и гептана 3:2.
Уксусная кислота, ледяная, ГОСТ 6175, 1 М раствор.
Медь азотнокислая трехводяная, ГОСТ 4163-68, чда.
Натрий хлористый, ГОСТ 4233-77, хч.
Триэтаноламин, ТУ 6-09-2448-72, ч.
Бутанол, ГОСТ 6006-78, чда.
Натрия N, N-диэтиддитиокарбамат, ГОСТ 8864-71, ч.
Реагент меди: готовят в мерной колбе на 200 мл, для этого к 10 мл 1 М раствора уксусной кислоты добавляют 12 мл триэтаноламина, 4,75 г меди азотнокислой и 100 мл воды, растворяют, добавляют 57 г хлористого натрия и 50 мл воды, затем 1 М уксусной кислотой устанавливают pH-8,1 и доводят до метки водой. Устойчив реагент месяц (до образования зеленого осадка).
Цветной реагент: в мерной колбе на 100 мл растворяют 100 мл натрия N, N-диэтилдитиокарбамата в 60 мл бутанола и доводят до метки хлороформом. Сохраняется при хранении в холодильнике в течение 2-х недель.
Эмульсия оливкового масла; готовят перемешиванием 40 мл оливкового масла с 60 мл 2% раствора ПВС в дистиллированной воде в стакане микроизмельчателя тканей при 3000 об/мин в течение 30-40 минут. Эмульсия готовится перед употреблением.
Пальмитиновая кислота, МРТУ 6-09-5841-69. Для стандарта возможно также применение олеиновой кислоты.
Стандартный раствор N 1 с концентрацией 1,5 мг/мл пальмитиновой кислоты готовят растворением кислоты в экстракционном растворе в мерной колбе на 50 мл. Раствор устойчив при хранении в холодильнике в течение недели.
103
Стандартный раствор N 2 и 3 с концентрацией 100 мкг/мл и 10 мкг/мл готовят путем соответствующего разбавления раствора N 1 экстракционным раствором. Готовят перед употреблением. Фильтры АФА-ХА-20 или АФА-ХА-10.
Отбор пробы воздуха
Воздух с объемным раствором 1 л/мин аспирируют через фильтр АФА-ХА, укрепленный в фильтродержателе.
Для определения 1/2 ПДК достаточно отобрать 2,5 л воздуха. Пробы устойчивы длительное время.
Подготовка к измерению
Градуировочные растворы готовят в пробирках, согласно таблице 12.
Таблица 12 |
N
стан
дарта |
Стандартный раствор N 3, |
Экстракционны! раствор, мл |
Концентрация пальмитиновой кислоты, мкг/мл |
1 |
0,0 |
5,0 |
0 |
2 |
0,5 |
4,5 |
1 |
3 |
1,0 |
4,0 |
2 |
4 |
2,0 |
3,0 |
4 |
5 |
3,0 |
2,0 |
6 |
6 |
4,0 |
1,0 |
8 |
7 |
5,0 |
0,0 |
10 |
|
Во все пробирки с градуировочными растворами добавляют 0,5 мл насыщенного раствора натрия бромистого и 2,5 мл реагента меди. Пробирки закрывают и встряхивают при 1500 об/мин. По 3,5 мл органического слоя переносят в пробирки с 0,4 мл цветного реагента. Перемешивают и через 5-10 минут измеряют оптиче-104
скую плотность при длине волны 440 нм. Измерение проводят в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм по отношению к раствору сравнения, не содержащего определяемого вещества (раствор N 1 по таблице). Окраска растворов устойчива 3 часа.
Строят градуировочный график зависимости значений оптических плотностей от соответствующих им концентраций жирной кислоты в градуировочном растворе (мкг/мл).
Проверка градуировочного графика проводится в случае использования новой партии реактивов, но не реже 1 раза в квартал.
Проведение измерения
Фильтр с отобранной пробой переносят в химический стакан, добавляют 5 мл фосфатного буфера и перемешивают интенсивно в течение 10 мин стеклянной палочкой или на магнитной мешалке. В пробирки вносят 1 мл эмульсии оливкового масла и 8-10 минут выдерживают в водяной бане при 37+0,5°С, затем не вынимая добавляют в каждую пробирку по 0,5 мл раствора фермента (пробы), перемешивают и оставляют при 37°С на 1 час (точно) для проведения липолиза. По истечении этого времени в каждую пробирку добавляют 5 мл экстракционного раствора из бюретки и интенсивно встряхивают в течение 3 минут.
Определение содержания образовавшейся жирной кислоты проводят аналогично градуировочным растворам. Раствором сравнения служит эмульсия с добавлением фосфатного буфера, которым обработан чистый фильтр. Остальные реактивы добавляют в том же количестве, как при анализе проб. Концентрацию жирной кислоты находят по графику.
Расчет концентрации
Концентрацию липазы микробной (С) в воздухе (в мг/м^) вычисляют по формуле:
С - [(а * В! * В2) / (М * А * Б3 * V)J * 1000, где
105
a — концентрация жирной кислоты в анализируемом растворе, найденная по графику, мкг/мл;
Bj — общий объем раствора для экстракции жирных кислот,
мл;
В2 — общий объем раствора пробы с ферментом, мл;
Б3 — объем раствора пробы с липазой, взятый для инкубирования, мл;
V — объем воздуха, отобранный для анализа и приведенный к стандартным условиям, л (см. Приложение 1);
1000 — коэффициент пересчета на 1 м^;
М — молекулярная масса жирной кислоты;
А — липолитическая активность липазы, ЛЕ/мг, ч. Единице липолитической активности (ЛЕ) соответствует такое количество фермента, которое освобождает 1 мкмоль жирной кислоты в течение часа при 37°С. Или это количество микроэквивалентов жирной кислоты, выделяющихся в результате гидролитического действия 1 мг фермента липазы. Использована липаза с активностью 200000 ЛЕ/гч (200 ЛЕ/мг ч).
Пояснение к формуле расчета:
(а * В})/М — количество мкмоль жирной кислоты в градуировочном растворе. Так как 200 мкэквив. жирной кислоты дает 1 мг липазы, то (а ф В|) / М мкэквивалентов дает А “ a/Bj/M * 2000 мг липазы.
Эти А мг липазы содержит Б3 *= 0,5 мл пробы, объем всей пробы фермента В2 * 5 мл.
V/1000 количество м^ воздуха, отобранного для анализа.
106
Приложение 1
Приведение объема воздуха к стандартным условиям проводят по следующей формуле:
V20 - IV * (273 + 20) * Р 1/ 1(273 + t°) * 101.331, где
V — объем воздуха, отобранный для анализа, л;
Р — барметрическое давление, кПА (101,33 кПа - 760 мм рт. ст.)
t — температура воздуха в месте отбора пробы, °С.
Для удобства расчета V20 следует пользоваться таблицей коэффициентов (приложение 2). Для приведения воздуха к стандартным условиям надо умножить V на соответствующий коэффициент.
223
Приложение 2
Коэффициент К для приведения объема воздуха к стандартным
условиям
°с |
|
Давление Р, кПа |
(мм рт. |
ст.) |
|
97,33 |
97,86 |
98,4 |
98,93 |
99,46 |
|
(730) |
(734) |
(738) |
(742) |
(746) |
-30 |
1,1582 |
1,1646 |
1,1709 |
1,1772 |
1,1836 |
•26 |
1,1393 |
1,1456 |
1,1519 |
1,1581 |
1,1644 |
-22 |
1,1212 |
1,1274 |
1,1336 |
1,1396 |
1,1458 |
-18 |
1,1036 |
1,1097 |
1,1159 |
1,1218 |
1,1278 |
-14 |
1,0866 |
1,0926 |
1,0986 |
1,1045 |
1,1105 |
-10 |
1,0701 |
1,0760 |
1,0819 |
1,0877 |
1,0986 |
-06 |
1,0640 |
1,0599 |
1,0657 |
1,0714 |
1,0772 |
-02 |
1,0385 |
1,0442 |
1,0499 |
1,0556 |
1,0613 |
0 |
1,0309 |
1,0366 |
1,0423 |
1,0477 |
1,0535 |
+02 |
1,0234 |
1,0291 |
1,0347 |
1,0402 |
1,0459 |
+06 |
1,0087 |
1,0143 |
1,0198 |
1,0253 |
1,0309 |
+10 |
0,9944 |
0,9990 |
1,0054 |
1,0108 |
1,0162 |
+14 |
0,9806 |
0,9860 |
0,9914 |
0,9967 |
1,0027 |
+18 |
0,9671 |
0,9725 |
0,9778 |
0,9880 |
0,9884 |
+20 |
0,9605 |
0,9658 |
0,9711 |
0,9783 |
0,9816 |
+22 |
0,9539 |
0,9592 |
0,9645 |
0,9696 |
0,9749 |
+24 |
0,9475 |
0,9527 |
0,9579 |
0,9631 |
0,9683 |
+26 |
0,9412 |
0,9464 |
0,9516 |
0,9566 |
0,9618 |
+28 |
0,9349 |
0,9401 |
0,9453 |
0,9503 |
0,9955 |
+30 |
0,9288 |
0,9339 |
0,9391 |
0,9440 |
0,9432 |
+34 |
0,9167 |
0,9218 |
0,9268 |
0,9318 |
0,9368 |
+38 |
0,9049 |
0,9099 |
0,9149 |
0,9198 |
0,9248 |
224
°с |
Давление |
Р, кПа (мм рт. ст. |
) |
|
100 |
100,53 |
101,06 |
101,33 |
101,86 |
|
(750) |
(754) |
(758) |
(760) |
(764) |
-30 |
1,1899 |
1,1963 |
1,2026 |
1,2058 |
1,2122 |
-26 |
1,1705 |
1,1763 |
1,1831 |
1,1862 |
1,1925 |
-22 |
1,1519 |
1,1581 |
1,1643 |
1,1673 |
1,1735 |
-18 |
1,1338 |
1,1399 |
1,1460 |
1,1490 |
1,1551 |
-14 |
1,1164 |
1,1224 |
1,1284 |
1,1313 |
1,1373 |
-10 |
1,0994 |
1,1053 |
1,1112 |
1,1141 |
1,1200 |
-06 |
1,0829 |
1,0887 |
1,0945 |
1,0974 |
1,1032 |
-02 |
1,0669 |
1,0726 |
1,0784 |
1,0812 |
1,0869 |
0 |
1,0591 |
1,0648 |
1,0705 |
1,0733 |
1,0789 |
+02 |
1,0514 |
1,0571 |
1,0627 |
1,0655 |
1,0712 |
+06 |
1,0363 |
1,0419 |
1,0475 |
1,0502 |
1,0557 |
+10 |
1,0216 |
1,0272 |
1,0326 |
1,0353 |
1,0407 |
+14 |
1,0074 |
1,0128 |
1,0183 |
1,0209 |
1,0263 |
+18 |
0,9936 |
0,9989 |
1,0043 |
1,0069 |
1,0122 |
+20 |
0,9868 |
0,9921 |
0,9974 |
1,0000 |
1,0053 |
+22 |
0,9800 |
0,9853 |
0,9906 |
0,9932 |
0,9985 |
+24 |
0,9735 |
0,9787 |
0,9839 |
0,9865 |
0,9917 |
+26 |
0,9669 |
0,9721 |
0,9773 |
0,9755 |
0,9851 |
+28 |
0,9605 |
0,9657 |
0,9708 |
0,9734 |
0,9785 |
+30 |
0,9542 |
0,9594 |
0,9646 |
0,9670 |
0,9723 |
+34 |
0,9418 |
0,9468 |
0,9519 |
0,9544 |
0,9595 |
+38 |
0,9297 |
0,9347 |
0,9397 |
0,9421 |
0,9471 |
225