Государственный комитет санитарно-эпидемиологического надзора Российской Федерации

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

по экспериментальному обоснованию ГЩК микроорганизмов-продуцентов и содержащих их готовых форм препаратов в объектах производственной и окружающей среды

Москва • 1993

Экспериментальное обоснование ПДК микроорганизмов-про-дуцентов и содержащих их готовых форм препаратов в объектах производственной и окружающей среды: Методические указания. - Мл Информационно-издательский центр Госкомсанэпиднадзора России, 1993. - 20 с.

Документ разработан: Научно-исследовательским объединением практической экологии и токсикологии «Экотокс» (проф. О. Г. Алексеева, проф. Г. А. Багдасарьян, к.б.н. П. Л. Зельцер, к.м.н. И. 3. Зельцер, д.м.н. Г. Б. Штейнберг, д.ы.н. Ж. Г. Умеров); ВНИИ гигиены и токсикологии пестицидов, полимерных и пластических масс (Д.М.Н. Т. Г. Омелья-нец, д.м.н. Е. А. Мельникова); ВНИИ антибиотиков (к.м.н. И. И. Прохорова); НИИ общей и коммунальной гигиены им. А Н. Сысина АМН СССР (д.м.н. В. И. Немыря); ЦНИИ Рижского медицинского института (до.н. И. Я. Квятковская, к.м.н. И. М. Ремез, кАн. И. А Иванова); ВНЦ биологически активных веществ (к.м.н. А Ф. Гирич).

Рецензенты: д.м.н. В. В. Влодавец (НИИ гигиены им. Ф. Ф. Эрнсмана М3 РСФСР); проф. А А Аравийский (ВНИИ антибиотиков и ферментов медицинского назначения); к.м.н. В. В. Шеаляков, д.м.н. А И. Олофир (БелНИСГИ).

Председатель экспертной комиссии: K.M.H. Г. В. Цариченко.

Государственный комитет санитарно-эпидемиологического надзора при Президенте Российской Федерации на основании Закона РСФСР «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» и Постановления Верховного Совета РСФСР «О ратификации Соглашения о создании Содружества Независимых Государств» от 12 декабря 1991 года постановляет: Установить, что на территории России действуют санитарные правила, нормы и гигиенические нормативы, утвержденные бывшим Министерством здравоохранения СССР, в части, не противоречащей санитарному законодательству Российской Федерации.

Указанные документы действуют впредь до принятия соответствующих нормативных актов Российской Федерации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения.

С Информационно-издательский центр Госкомсанэпиднадзора России

Методические указания

по экспериментальному обоснованию ПДК микроор-ганизмов-продуцентов и содержащих их готовых форм препаратов в объектах производственной и окружающей среды

С выходом в свет данных методических указаний считать утратившими силу методические указания «Постановка исследований для обоснования предельно допустимых концентраций производственных штаммов микроорганизмов и на их основе готовых форм препаратов в воздухе рабочей зоны» № 2955-83 от 23.12.83.

1. Общие положения

Настоящие методические указания предназначены для специалистов, занимающихся обоснованием гигиенических нормативов в объектах производственной и окружающей среды (воздух рабочей зоны, атмосферный воздух и вода водоемов) произвоодсгвенных штаммов микроорганизмов и готовых форм препаратов, действующим началом которых являются живые микроорганизмы или их споры.

Разработка настоящих методических указаний обусловлена широким промышленным применением микроорганизмов (дрожжеподобные и плесневые грибы, бактерии и др.) в различных отраслях народного хозяйства и связанной с этим проблемой гигиенического регламентирования их содержания в объектах производственной и окружающей среды.

3

Настоящие методические указания должны способствовать получению сопоставимых материалов, выбору оптимального объема исследований, необходимых для научного обоснования гигиенических регламентов производственных штаммов микро-организмов и готовых форм препаратов на их основе. В то же время предлагаемая схема исследований, их объем и рекомендуемые методы не должны ограничивать творческую инициативу исследователей в плане расширения, углубления методических приемов и использования дополнительных и новых методов исследования.

Регламентированию подлежат штаммы микроорганизмов, прошедшие первичную санитарно-гигиеническую оценку как продуценты для целей микробиологического синтеза и допущенные М3 СССР к использованию в технологических процессах, а также изготовленные на их основе товарные формы препаратов, содержащие живые клетки или споры.

При направлении для исследования производственных штаммов микроорганизмов или готовой формы препарата с целью обоснования их гигиенического регламента обязательно указывают следующие данные.

Для микроорганизмов:

полное наименование штамма микроорганизма, его таксономическое положение, происхождение, условия культивирования, селективную питательную среду, способ иденти-фикации, способ применения и мощность предприятия.

Для готовых форм препаратов:

товарное название, назначение, способ получения и применения, мощность предприятия, состав (действующее начало, наполнитель, технологические добавки, стадия развития и количество клеток микро-организмов-продуцентов на единицу массы готового препарата; содержание посторонней микрофлоры; агрегатное состояние препарата, дисперсный состав аэрозоля).

Кроме этого, в обоих случаях должно быть представлено заключение о патогенности и аллергенности штамма, о влия-нии его на экосистемы и процессы самоочищения воды и почвы с указанием действующих, пороговых и недействующих концентраций.

В последние годы все большее развитие получает промышленное применение микроорган из мов-продуцентов, конструируемых методом генной инженерии и содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Степень опасности таких рекомбинантных систем зависит от инфекционных и токсикогенных свойств клетки хозяина и рекомбинантной ДНК, их способности к выживанию в объектах производственной и окружающей среды и, что особенно важно, к передаче генетической информации другим организмам.

Принимая во внимание отсутствие методических подходов к гигиеническому нормированию таких штаммов, с учетом последнего

4

эффекта и в соответствии с санитарно-противоэпидемическими правилами «Безопасность работы с рекомбинантными молекулами ДНК» (М3 СССР, М, 1989), выброс данных штаммов микроорганизмов в процессе производства в воздух рабочей зоны и объекты окружающей среды запрещается.

Исследования проводят на следующих видах лабораторных животных молодого возраста: белые мыши (масса тела 16-18 г), белые крысы (масса тела 160-180 г), морские свинки (масса тела 200-250 г), кролики (масса тела 1500-2000 г). При этом необходимо указать вид, линию (популяцию), из какого питомника получены животные, пол, исходную массу тела, пищевой рацион, сезон, в котором проводилась каждая серия экспериментов.

Подбор животных и формирование из них однородных опытных и контрольных групп осуществляют с учетом одинаковой массы тела, отсутствия различий в поведении, общем состоянии, содержании лейкоцитов в крови и состоянием нормальной микрофлоры организма.

Количество лабораторных животных должно соответствовать требованиям, изложенным в разделе IX методических указаний «Постановка исследований для обоснования санитарных стандартов вредных веществ в воздухе рабочей зоны» (М, 1980), а условия содержания - требованиям санитарных правил «Устройство, оборудование и содержание экспериментально-биологических клиник (вивариев)*, утвержденных М3 СССР (М., 1973). С соответствующей аргументацией могут быть использованы и другие лабораторные модели (клетки культуры ткани, куриные эмбрионы и др.).

Учитывая качественное отличие изучаемых агентов (живые клетки), принципы их гигиенического нормирования существенно отличны от таковых, используемых при обосновании санитарных стандартов (ОБУВ и ПДК) химических вредных веществ, в том числе продуктов микробиологического синтеза (кормовые белки, белково-витамипные концентраты, аминокислоты, ферменты, антибиотики и др.). Показателями опасности действия непатогенных (не вызывающих у человека инфекционных процессов) микроорганизмов-про-дуцентов является транзиторное бациллоносительство (диссеминация во внутренних органах), специфическое влияние на иммунную систему (иммунотоксичность) и на нормальную микрофлору микроорганизма (дисбиотическое действие).

В соответствии с этими положениями составлены схемы постановки исследований для установления ПДК В схему постановки исследований по обоснованию санитарных стандартов готовых форм препаратов, содержащих живые микроорганизмы, учитывая наличие в них различных химических соединений в виде добавок и наполнителей, включены отдельные тесты, используемые при гигиеническом нормировании вредных химических соединений.

5

При нормировании штаммов, относящихся к уже изученному виду микроорганизмов, их исследование проводится по сокращенной схеме, включающей изучение уровня воздействия по показателю, являющемуся лимитирующим для данного вида.

2 Принципиальная схема исследований

2.1.    Схема проведения исследований по обоснованию ПДК микроорганизмов-продуцентов в воздухе рабочей

зоны, атмосферном воздухе и воде водоемов

Исследования предусматривают оценку опасности изучаемого микроорганизма при поступлении в организм лабораторных животных путями, адекватными реальным условиям трудовой деятельности и обитания человека, с целью выбора лимитирующего критерия вредности и установления ПДК:

выявление раздражающего слизистую оболочку глаза действия; проведение хронического эксперимента при поступлении микроорганизма через органы дыхания или энтерально для выявления лимитирующего критерия вредности (иммун©токсического, дисбе-отического или по диссеминации микроорганизма во внутренних органах);

при нормировании в воде водоемов учитываются данные по изучению влияния продуцента на процессы микробного самоочищения водной среды.

2.2.    Особенности исследования по обоснованию ПДК готовых форм препаратов, содержащих живые

микроорганизмы или споры

В дополнение к исследованиям, проводимым для определения опасности микроорганизма (раздел 2.1), выполняют в соответствии с методическими указаниями «Постановка исследования для обоснования санитарных стандартов вредных веществ в воздухе рабочей зоны» (МЦ 1980):

определение раздражающего действия на кожу;¹ определение порогов острого и хронического общетоксического действия;

выявление сенсибилизирующего действия.

3. Методы исследования

3.1.    Определение раздражающего слизистую оболочку

глаза действия

Для проведения опыта берут не менее 3 кроликов. В конь-юктивальный мешок глаза однократно закапывают 1 каплю взвеси живой культуры микроорганизма-продуцента, содержащей 10⁹ кл./мл или 50 % суспензии готовой формы препарата. Учет эффекта проводят в течение двух суток (прил. 3).

3.2.    Выявление сенсибилизирующего действия готовой

формы препарата

Специальных опытов по выявлению сенсибилизирующего действия микроорганизмов-продуцентов не проводят, поскольку они как чужеродные для макроорганизма клетки являются облигатными аллергенами и различаются лишь степенью выраженности данного эффекта.

Однако, при контакте с готовой формой препарата возможно проявление сенсибилизирующего действия входящих в ее состав химических соединений (добавки, наполнители и т. д.). Если они не нормированы, то проводят специальные эксперименты.

При выявлении сенсибилизирующего действия готовой формы препарата для сенсибилизации используют введение (интранаэальное или внутрижелудочное) ее суспензии в концентрации на порядок ниже величины ЛД ₅₀, а также ингаляционное воздействие в концентрациях, выбранных для определения Lim _АС (действующая, пороговая и ниже).

Сенсибилизацию определяют как по отношению к микроорган из му-продуценту (или к каждому из микроорганизмов, если в готовую форму препарата входит смесь микроорганизмов), так и к входящим в композицию химическим соединениям. При тестировании химическими соединениями руководствуются методическими рекомендациями по нормированию химических аллергенов (см. список литературы), а микроорганизмами -* согласно методикам, изложенным в разделе 33.1.

Если сенсибилизирующее действие готовой формы препарата было обнаружено только при тестировании входящим в его состав микроорган измом-продуцентом, то в последующих хронических экспериментах определяют порог сенсибилизации для данного микроорганизма. Если же входящие в состав препарата химические соединения также проявили сенсибилизирующий эффект, то животных в хронических опытах тестируют и микроорганизмом-иродуцентом, и химическим аллергеном.

7

3.3. Постановка хронического эксперимента для определения лимитирующего критерия вредности

Микроорганизмы-продуценты вводят животным интраназально в виде суспензии в физиологическом растворе с последующим пересчетом вводимой дозы на концентрацию клеток во вдыхаемом воздухе (прил. 2). При наличии специальных камер для создания микробных аэрозолей проводят ингаляционное введение. При нормировании микроорганизмов-продуцентов в воде водоемов используют энтеральное введение. При исследовании готовых форм препаратов на основе живых микроорганизмов используют ингаляционное введение в пылевых затравочных камерах, при этом ежедневная экспозиция при установлении ПДК в воздухе рабочей зоны - 4 ч, а для ПДК в атмосферном воздухе - круглосуточно. Энтеральное и интраназальное введение осуществляют 1 раз в сутки.

Для определения порогов иммунотоксического и дисбиоти-чес-кого действия введение живой культуры микроорганизма-продуцента или готовой формы препарата осуществляют в течение 1 месяца. Длительность периода ингаляционного воздействия готовой формы препарата при установлении порога хронического общетоксического действия (Lim ^ - 4 месяца.

3J.1. Определение порога иммунотоксического действия

Иммунотоксическое действие может проявляться сенсибилизацией, иммунизацией (признак антигенности микроорганизма) и неспецифической иммуномодуляцией (стимуляция и иммунодефицит) организма, поэтому в настоящем документе предусмотрено определение всех трех возможных иммунотоксических эффектов.

Для оценки опасности развития сенсибилизации в хроническом эксперименте тестирование животных осуществляют живой культурой микроорганизма-продуцента. Аллергены из микроорганизмов используют только при наличии коммерческих препаратов, прошедших государственный контроль, т. е. с гарантированной специфичностью и активностью. При оценке готовых форм препаратов кроме того применяют их суспензию и растворы (взвеси) отдельных химических соединений. С микроорганизмами выполняют определение ГЗТ и ГНТ, с химическими соединениями - тесты, указанные в разделе 3.2.

Определение гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ): тестирование животных опытной (сенсибилизированной) и контрольной (интактной) групп проводят путем введения под аноневроз задней лапки взвеси микроорганизма-продуцента (в объеме 0,05 мл), выращенного на оптимальной плотной питательной среде и суспензированного в физиологическом растворе, в концентрации, кото-

8

рая у контрольных животных не вызывает воспалительной реакции. При оценке готовой формы препарата второй партии животных опытных групп вводит 100 мкг наполнителя. На следующие сутки (через 18-20 ч), измеряя толщину каждой из задних лапок инженерным микрометром (или по объему вытесненной воды), определяют выраженность отека в мм (или в мл) по разнице между толщиной (объемом) двух задних лапок каждого животного и вычисляют среднегрупповые показатели отека животных опытной и контрольной групп.

Определение реагиновой пшерчувсгвительносги немедленного типа (ГНТ):

опытным и контрольным крысам внутрибрюшинно вводят 6-8 мл среды 199 и в течение 1-1,5 мин проводят легкий массаж передней стенки живота. Затем по средней линии делают послойный разрез длиной 1,5-2 см и, перевернув животное, собирают перитонеальную жидкость в пробирку, смоченную гепарином, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Осажденные тучные клетки ресуспензируют в среде 199 до концентрации 10⁶ мл.

На предметное стекло, окрашенное 0,03 % нейтрал-рот (в абсолютном спирте) наносят 0,05 мл суспензии тучных клеток и добавляют 0,05 мл суспензии микроорганизмов-продуцентов или препарата в концентрации, которая не вызывает дегрануляции тучных клеток интактных крыс. Смесь покрывают покровным стеклом, края которого смазывают вазелином и помещают в термостат при 37 °С на 10-15 мин. Затем под микроскопом подсчитывают число дегранулированных клеток на 50 тучных клеток.

Для оценки антигенности микроорганизмов применяют определение иммунных антител в реакциях агглютинации и фагоцитоза изучаемого микроорганизма нейтрофилами крови.

Реакция агглютинации;

готовят сыворотки крови опытных и контрольных животных. Реакцию выполняют в пробирках 10 к 75 мм по 10 штук в ряду для каждой сыворотки; в первую пробирку каждого ряда наливают 0,95 мл, в остальные - по 0,5 мл физиологического раствора. Затем в первую пробирку добавляют 0,05 мл испытуемой сыворотки крови, перемешивают и переносят 0,5 мл во вторую и т. д. до последней пробирки, из которой лшпние 0,5 мл выливают. После получения двукратного разведения сывороток (от 1 ; 20 до 1 : 10250) в каждую пробирку добавляют по 0,5 мл взвеси живой культуры микроорганизма-продуцен-та, содержащей ДО⁹ кл./мл; перемешивают содержимое встряхиванием и центрифугируют в течение 10 мин при 1000 об/мин. Реакцию считают положительной, если в пробирке появляется осадок, дающий крупные хлопья при осторожном постукивании по нижней части пробирки. За титр агглютининов принимают наибольшее разведение сыворотки, вызывающее агглютинацию микроорганизмов. Вычисляют среднегеометрическое, используя log ₂ основания титра.

Реакция фагоцитоза: ²

из живой культуры микроорганиэма-иродуцента готовят суспензию на физиологическом растворе, содержащую 10² клеток/мл; к 0,1 мл данной суспензии добавляют 0,1 мл гепаринизированной крови как опытных, так и контрольных животных, перемешивают и инкубируют при 37 °С в течение 30 мин (реакцию ставят или в полистероловых планшетах, или в обрезанных пробирках), затем приготовляют мазки для подсчета формулы крови. Подсчитывают 200 нейтрофилов крови, вычисляют процент фагоцитирующих нейтрофилов и индекс активности фагоцитоза (общее число фагоцитированных микроорганизмов, разделенное на число фагоцитирующих нейтрофилов).

Для оценки иммуномодулирующего эффекта определяют в крови и лимфоидных органах содержание лимфоцитов, Т- и В-лимфоцитов и ауто-РОК (прекиллеры и предшественники иммунорегулирующих Т-клеток), массовые коэффициенты лимфоидных органов (тимус, селезенка, трахеобронхиальные и брыжечные лимфоузлы). Содержание лимфоцитов и их популяций определяют как в процентах, так и по числу в 1 мкл крови или 1 г органа; исследования проводят одновременно с гематологическим анализом.

Выделение лимфоцитов:

под эфирным наркозом забирают кровь из подъязычной артерии без антикоагулянта (получение сыворотки крови) и с антикоагулянтом - гепарином (для выделения лимфоцитов и аутоэритроцитов). После декапитации выделяют лимфоузлы, тимус и селезенку. Органы взвешивают для последующего пересчета содержания лимфоцитов в 1 г органа, промывают в забуференном физиологическом растворе (pH = 7,3), подсушивают фильтровальной бумагой, измельчают ножницами, затем - в фарфоровой ступке и протирают через двойную капроновую сетку. Клетки ресуспензируюг в 2 мл забуфе-ренного физиологического раствора, подсчитывают их число в 1 мкл в камере Горяева. Лимфоциты выделяют в градиента плотности верификола или верографина по общепринятым методикам. В реакциях розеткообразования используют взвесь лимфоцитов в концентрациях 2-5 и 10“ кл./мл.

Определение Т-лимфоцитов:

в силиконированной пробирке смешивают 0,1 мл взвеси лимфоцитов и 0,1 мл 0,5 %-ной взвеси отмытых эритроцитов барана (при исследовании Т-лимфоцитов крыс, мышей) или эритроцитов кролика (при определении Т-лимфоцитов морских свинок), затем инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, центрифугируют в течение 1-2 мин при 1000 об/мин, затем 1 ч выдерживают в холодильнике при 4 °С, после чего сразу же добавляют для фиксации розеток 0,1 мл 0,6 %-ного глютарового альдегида, выдерживают при комнатной температуре 15-20 мин, центрифугируют при том же режиме, из осадка готовят мазок, высушивают, фиксируют метанолом в течение 3 мин, промывают дистиллированной водой, окрашивают

10

1

При выявлении раздражающего действия микроорганизмов-продуцентов или готовых форм препаратов необходимо проведение на предприятиях профилактических мероприятий по защите глаз и кожных покровов работающих (защитные очки, перчатки, одежда, обувь).

2